Quantificação da dinâmica da rede de interação de proteínas usando co-imunoprecipitação multiplexada

Summary

A imunoprecipitação quantitativa Multiplex (QMI) utiliza citometria de fluxo para detecção sensível de diferenças na abundância de interações proteína-proteína direcionadas entre duas amostras. O QMI pode ser realizado usando uma pequena quantidade de biomaterial, não requer Tags geneticamente projetadas e pode ser adaptado para qualquer rede de interação protéica previamente definida.

Abstract

Interações proteína-proteína dinâmicas controlam o comportamento celular, da motilidade à replicação do DNA para a transdução do sinal. No entanto, o monitoramento de interações dinâmicas entre múltiplas proteínas em uma rede de interação protéica é tecnicamente difícil. Aqui, apresentamos um protocolo para imunoprecipitação multiplex quantitativa (QMI), que permite a avaliação quantitativa de alterações de dobra em interações protéicas com base em medições de fluorescência relativa de proteínas em complexos compartilhados detectados por expostos Epítopos de superfície (PiSCES). Em QMI, os complexos proteicos de lysates da pilha são Immunoprecipitated em microspheres, e então sondado com um anticorpo etiquetado para uma proteína diferente a fim quantificar a abundância de PiSCES. Os anticorpos da imunoprecipitação são conjugados às regiões espectrais diferentes de magbead, que permite que um citômetro do fluxo diferencie ligações paralelos múltiplos e quantifique simultaneamente a quantidade de anticorpo da ponta de prova associado com cada um. O QMI não necessita de marcação genética e pode ser realizado utilizando um biomaterial mínimo em comparação com outros métodos de imunoprecipitação. O QMI pode ser adaptado para qualquer grupo definido de proteínas interagindo, e até agora tem sido usado para caracterizar redes de sinalização em células T e sinapses neuronais de glutamato. Os resultados conduziram à geração nova da hipótese com aplicações diagnósticas e terapêuticas potenciais. Este protocolo inclui instruções para executar o QMI, desde a seleção inicial do painel de anticorpos até a execução de ensaios e análise de dados. A montagem inicial de um ensaio QMI envolve a triagem de anticorpos para gerar um painel, e empiricamente determinando um tampão de Lise apropriado. A preparação subsequente do reagente inclui anticorpos covalentemente do immunoprecipitação do acoplamento aos magbeads, e anticorpos biotinylating da ponta de prova assim que podem ser etiquetados por um fluorophore streptavidin-conjugado. Para executar o ensaio, o lisado é misturado com magbeads durante a noite, e então os grânulos são divididos e incubados com anticorpos diferentes da ponta de prova, e então uma etiqueta do fluoróforo, e lidos pelo fluxo cytometry. Dois testes estatísticos são realizados para identificar peixes que diferem significativamente entre as condições experimentais, e os resultados são visualizados usando Heatmaps ou diagramas de borda de nó.

Introduction

As interações proteína-proteína dinâmicas constituem as cascatas de sinalização molecular e as estruturas motile que são a base funcional da maioria de fisiologia celular¹. Esses processos são frequentemente representados como vias de sinalização lineares que alternam entre Estados estáveis com base em entradas simples, mas os dados experimentais e de modelagem mostram claramente que funcionam como redes integradas^{2,3, 4}. no caso das proteínas g, diferentes receptores geralmente têm a capacidade de ativar a mesma proteína g, e um único receptor também....

Protocol

1. projeto do ensaio

1. Preparação do anticorpo do candidato
   1. Para cada proteína de interesse, escolha 3 a 5 anticorpos para a tela. Quando possível, use anticorpos monoclonais que reconhecem epítopos diferentes. Inclua também um anticorpo de controle não específico.
   2. Para remover Tris, realize a troca do amortecedor adicionando o anticorpo a um filtro da rotação de 30 kDa, girando para baixo a seu volume mínimo, adicionando 500 μL de soro-tampão fosfato (PBS), e repetindo 3 vezes. Para remover proteínas do portador, realize a purificação do anticorpo de acordo com o protocolo do fabricante (veja a tabela de materiais para a re....

Results

Triagem de anticorpos
Figura 2 B mostra os resultados de uma tela para a proteína Connexin36. A maioria de combinações IP_probe não produzem nenhum sinal sobre controles de IgG. O IP com o anticorpo monoclonal 1E5 e a ponta de prova com o 1E5 ou o anticorpo Polyclonal 6200 produzem uma mudança rightward na distribuição do grânulo comparado aos controles de IgG. Aqui, IP 1E5 e sonda 6200poly foram selecionados para evitar o uso do mesmo anticorpo como IP e.......

Discussion

O ensaio QMI requer investimento substancial no desenvolvimento do painel de anticorpos, equipamentos e reagentes, mas uma vez que o ensaio é estabelecido, pode-se coletar dados de alta dimensão observando as redes de interação protéica à medida que respondem a Estímulos. Tecnicamente, o QMI requer pipetagem cuidadosa e rastreamento de locais de amostra e de poços de anticorpos. Etiquetar com cuidado as placas do ensaio é útil, como está fazendo um molde detalhado de posições do poço no papel, que é conservado então para.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Placas de fundo plano de 96 poços	Bio Rad	171025001
Placas PCR de 96 poços	VWR	82006-704
Sistema Bioplex 200 com HTF	Bio Rad	171000205	modificado para manter parcialmente refrigerado, consulte a Figura S1 para obter detalhes
Bio-Plex Pro Wash Station	Bio Rad	30034376
BSA	Sigma
Grânulos CML	Invitrogen	C37481
EDTA	Sigma	E6758
EZ-Link Sulfo-NHS-Biotina	Thermo Scientific	A39256
MagPlex Microspheres	Luminex	MC12xxx-01	xxx é a região do grânulo de 3 dígitos
Melon Gel IgG Spin Spin Kit	Thermo Scientific	45206	usado para purificação
MES	Sigma	M3671
, não estéril	USA Scientific	2920-0000
Coquetel inibidor de fosfatase # 2	Coquetel	P5726
Refrigerador de preparação de sanduíche	Sigma		para refrigeração personalizada de Bioplex 200
flúor	Sigma	201154
Ortovanadato de sódio	Sigma	450243
Estreptavidin-PE	BioLegend	405204
Sulfo NHS	Thermo Scientific	A39269
Tris	Fisher Scientific	BP152