Um ensaio com base em proteínas de fluorescência verde reforçada para estudar o crescimento do neurite em neurônios primários

Resumo

Neste relatório, nós descrevemos um protocolo simples para estudar o conseqüência do neurite em neurônios corticais do rato embrionário cotransfecting com EGFP e a proteína do interesse.

Resumo

O conseqüência do neurite é um evento fundamental na formação dos circuitos neural durante o desenvolvimento do sistema nervoso. Dano de neurite severo e disfunção sináptica ocorrem em várias doenças neurodegenerativas e degeneração relacionada à idade. A investigação dos mecanismos que regulam o conseqüência do neurite não somente derramaria a luz valiosa em processos desenvolventes do cérebro mas igualmente em tais desordens neurológicas. Devido à baixa eficiência do transfection, é atualmente desafiante estudar o efeito de uma proteína específica no conseqüência do neurite em neurônios mamíferos preliminares. Aqui, nós descrevemos um método simples para a investigação do conseqüência do neurite pelo co-transfection de neurônios corticais do rato preliminar com EGFP e uma proteína do interesse (POI). Este método permite a identificação de neurônios transfected do POI através do sinal de EGFP, e assim o efeito do POI no conseqüência do neurite pode ser determinado precisamente. Este ensaio baseado em EGFP fornece uma aproximação conveniente para a investigação dos caminhos que regulam o outgrowth do neurite.

Introdução

Neurites, incluindo os axônios e dendritos, são as projeções de neurônios envolvidos no estabelecimento das redes neurais. O crescimento dinâmico dos neuritos é essencial para o neurodesenvolvimento. No entanto, os mecanismos regulamentares subjacentes permanecem pouco claros. Em particular, o dano de neurite é freqüentemente observado em várias doenças neurodegenerativas e após lesões cerebrais¹. Portanto, a investigação dos papéis de moléculas putativas em várias vias regulatórias de crescimento de neurite melhoraria nossa compreensão do processo. Além disso, pode revelar alvos terapêuticos novos para várias desordens neurológicas. As linhas ....

Protocolo

Todos os procedimentos seguidos estavam de acordo com os padrões éticos do Comitê de ética em experimentação animal da universidade chinesa de Hong Kong.

1. preparação de COVERSLIP

1. Coloque uma lamínula circular estéril de 18 mm em cada poço de uma placa de cultura de tecido de 12 poços.
2. Cubra a lamínula com 5 μg/mL de solução de poli-D-lisina em uma incubadora humidificada de 37 ° c por pelo menos 1 h.
3. Aspirar a solução de poli-D-lisina da placa de cultura do tecido e enxaguar as coberturas revestidas uma vez com água estéril.

2. dissecção do Neuron embrionário do rato

Resultados

Para testar essa metodologia, utilizou-se o fator NGF de crescimento do cito D e do nervo, que demonstrou inibir e estimular o crescimento doneurite, respectivamente,^14,15,16. O comprimento do neurite dos neurônios transfected com EGFP foi medido após o tratamento com cyto D ou NGF. A eficiência do transfection de EGFP aos neurônios era 2,7% (1.068 neurônios contados). Como mostrado na

Discussão

Como afirmado antes, PC12 e seus subclones são amplamente empregados para estudar a extensão do neurite, pois têm excelente eficiência^detransfecção 2,3. Em contrapartida, os neurônios primários têm uma baixa taxa de transfecção, que é um grande obstáculo para o estudo dos reguladores de crescimento do neurite por transfecção⁷. Aqui, nós descrevemos um protocolo conveniente para quantificar o conseqüência do neurite em neurônios preliminare.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
#5 pinças	Regine	5-COB
18 mm Circle Cover Sheets	Thermo Scientific	CB00180RA	Esterilizar antes de usar
Suplemento B27	Gibco	17504044
Citocalasina D	Invitrogen	PHZ1063	Dissolvido em DMSO
D-(+)-Glicose	Sigma-Aldrich	G8270
Dimetil Sulfóxido	Sigma-Aldrich	D2650
, 10 cm	World Precision Instruments	14393
Tesoura de dissecação, 12,5 cm	World Precision Instruments	15922
EndoFree Plasmid Maxi Kit	QIAGEN	12362
Meio de montagem de fluorescência	Dako	S302380
Lipofectamine 2000 Transfecção Reagente	Invitrogen	11668019
Neurobasal Médio	Gibco	21103049
NGF 2.5S Proteína Nativa de Camundongo	Gibco	13257019
Nugent Utility Forceps, 10 mm, Ponta Reta	Instrumentos	de Precisão Mundial 504489
Paraformaldeído	Sigma-Aldrich	P6148
pEGFP-C1	Clontech	#6084-1
pCI FE65			Consulte as referências 8 e 15
Comprimidos PBS	Gibco	18912014
Penicilina-Estreptomicina	Gibco	15140122
Bromidrato de Poli-D-lisina	Sigma-Aldrich	P7280
Espátula	Sigma-Aldrich	S4147
Tripsina-EDTA (0,05%), fenol solução vermelha	do azul de	Gibco
Trypan, 0.4%	Gibco	15250061

Tesoura de dissecação 25300062