Indução meningocócica meningite sorogrupo C em camundongos via parto intracisternal

Resumo

Aqui, descrevemos um método para induzir a meningite meningocócica através de uma via intracisternal de infecção em camundongos adultos. Apresentamos um protocolo passo a passo de infecção meningocócica desde a preparação do inóculo para a infecção intracisternal; registre então a sobrevivência animal e avalie as cargas bacterianas em tecidos do murine.

Resumo

Neisseria meningitidis (meningococcus) é um microorganismo de alcance estreito, reconhecido mundialmente como a principal causa de meningite bacteriana. Meningococcus é um colonizador transitório da nasofaringe humana de aproximadamente 10% do sujeito saudável. Em circunstâncias particulares, adquire uma capacidade invasiva de penetrar na barreira da mucosa e invade a corrente sanguínea causando septicemia. No último caso, a sepse fulminante poderia surgir mesmo sem o consequente desenvolvimento da meningite. Por outro lado, as bactérias poderiam se multiplicar mal na corrente sanguínea, atravessar a barreira do cérebro sanguíneo, alcançar o sistema nervoso central, levando à meningite fulminante. Os modelos de urina de meningite bacteriana representam uma ferramenta útil para investigar as interações hospedógeno-patógeno e analisar os mecanismos pathogenéticos responsáveis por esta doença letal. Embora, vários sistemas de modelos experimentais tenham sido avaliados nas últimas décadas, nenhum deles foi capaz de reproduzir os eventos patológicos característicos da doença meningocócica. Neste protocolo experimental, descrevemos um procedimento detalhado para a indução da meningite meningocócica em um modelo de camundongo baseado na inoculação intracisternal de bactérias. Os sinais peculiares da meningite humana foram registrados no hospedeiro murina por meio da avaliação de parâmetros clínicos (por exemplo, temperatura, peso corporal), avaliação da taxa de sobrevida, análise microbiológica e exame histológico de lesão cerebral. Ao usar inóculo intracisternal (i.cist.), meningococos entrega completa diretamente em cisterna magna, levando a uma replicação meningocócica muito eficiente no tecido cerebral. Um aumento de 1.000 vezes da contagem viável de bactérias é observado em cerca de 18 h. Além disso, meningococos também são encontrados no baço, e fígado de camundongos infectados, sugerindo que o fígado pode representar um órgão-alvo para a replicação meningocócica.

Introdução

Neisseria meningitidis é um Gram negativo β-proteobacterium restrito ao hospedeiro humano, bem conhecido por ser uma das causas mais comuns de meningite e sepse na população humana em todo o mundo. Coloniza o trato respiratório superior (nariz e garganta) de portadores saudáveis e assintomáticos (2-30% da população), mas a bactéria às vezes evita várias defesas imunes do hospedeiro e se espalha da corrente sanguínea para o cérebro, causando um local descontrolado inflamação, conhecida como meningite meningocócica. Uma combinação de fatores do anfitrião e bacterianos parece contribuir à transição do commensal ao comportamento invasor^1.<....

Protocolo

Este protocolo foi conduzido para minimizar o sofrimento dos animais e reduzir o número de camundongos de acordo com a Diretiva do Conselho das Comunidades Europeias de 24 de novembro de 1986 (86/609/CEE). Experimentos in vivo relatados neste estudo foram aprovados pelo Ethical Animal Care and Use Committee (Prot. número 2, 14 de dezembro de 2012) e pelo Ministério da Saúde italiano (Prot. número 0000094-A-03/01/2013). Todos os procedimentos devem ser realizados dentro do Gabinete de Biossegurança 2 (BSC2) em uma sala BSL2, e os resíduos potenciais infectados devem ser descartados em recipientes dedicados.

1. Infecção de camundongos com N....

Resultados

Sobrevivência de camundongos infectados com N. meningitidis tipo selvagem e cepas mutantes isogênicos.
As cepas Neisseria meningitidis utilizadas nestes resultados representativos são a estirpe de referência serogrupo C 93/4286 (ET-37) e o seu mutante isogênico 93/4286ΩcssA obtido por inativação insercional do gene cssA, codificação para o UDP-N-acetilglucosamina 2-epimerase, que mapeia na síntese cápsula locus²⁵. Para avaliar o grau de virul.......

Discussão

Neste estudo, descrevemos um protocolo experimental para induzir meningite meningocócica em camundongos adultos por i.cist. inoculação de bactérias meningocócicas. A nosso conhecimento, nenhum outro modelo da meningite meningococcal foi desenvolvido nos ratos do laboratório contaminados pelo i.cist. rota; no passado, desta forma tem sido explorada para fornecer modelos de meningite meningocócica em ambos os ratos³¹ e coelho³². É sabido que a maior taxa de doença meningocóci.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
1,8 Rodapé Covial Com rosca externa	Starlab	E3090-6222
50 mL Polipropileno Tubo Cônico	Falcon	352070	30 mm x 115 mm
Adson Fórceps	F.S.T.	11006-12	Termômetro de alarme de aço inoxidável
	TESTO	9000530
BactoTM Proteose Peptona	BD	211693
BD Micro seringa fina	BD	320837	U-100 Insulina
BD Seringa Plastipak 1 mL 25 G 5/8 polegadas	BD	300014	05 mm x 16 mm
BD Seringa Plastipak 5 mL	BD	308062	07 mm x 30 mm
ARMÁRIO DE FLUXO LAMINAR VERTICAL BIOHAZARD AURA B	Bio Air s.c.r.l.	Biofotômetro Aura B3
	Eppendorf	Modelo #6131
Garrafa D	Tecniplast	D	Graduado até: 400 mL, Volume Total 450 mL, 72 mm x 72 mm x 122 mm
C150 CO2 Fichário Incubadora		9040-0078
Corpo da Gaiola Eurostandard Tipo II	Tecniplast	1264C	267 x 207 x 140 mm3, Área do piso 370 cm2
Placa de Petri para cultura de células com tampa	Thermo Scientific	150288	Volume de trabalho: 5 mL
Centrífuga	Eppendorf	Microcentrífuga 5415R
Cuvetta semi-micro L. Form	Kartell S.p.A.	01938-00
hidrogenofosfato dipotássico trihidratado	Carlo erba	471767
hidrogenofosfato dissódico anidro ACS-para análise	Carlo Erba	480141	g1000
Certificado padrão Diete	Mucedola s.r.l.	4RF21	Pellet alimentar para animais
Dumont Hp Pinças 5 Aço Inoxidável	F.S.T. by DUMONT	AGT5034	0,10 x 0,06 mm2 ponta
Balança Eletrônica	Gibertini	EU-C1200	Max 1200 g, d = 0,01 g, T = -1200 g
Eppendorf Tubo de microcentrífuga com trava segura	Eppendorf	T3545-1000EA
Eritromicina	Sigma-Aldrich	E-6376	25 g
de tesoura Bonn extra fina	F.S.T.	14084-08
Tampo do Filtro em Aço Inoxidável (mini-Isolador), H-Temp com grampos de bloqueio	Tecniplast	1264C400SUC
GC base de ágar	OXOID	CM0367
Gillies Fórceps 1 x2 dentes	FST	11028-15	Glicerina de Aço Inoxidável
RPE	Carlo Erba	453752	1 L
Graefe Fórceps	F.S.T.	11052-10	Largura da ponta serrilhada: 0,8 mm
Tampa interna	Tecniplast	1264C116
Solução de ferro dextrano	Sigma-Aldrich	D8517-25ML
Ketamine	Intervet
BH-EN e BHG Classe II	Tubos	BH-EN 2004
1,5 mL	MARCA	PP780751	tampa de rosca PP, grad
Mouse Handling Forceps	FST	11035-20	Borracha serrilhada; Superfície de preensão: 15 mm x 20 mm
Mucotit-F2000	MERZ	61846	2000 mL
Luvas de látex natural	Medica	M101
New Brunswick Classic C24 Incubadora Shaker	PBI international	C-24 Classic Benchtop Incubator Shaker
Petri PS Dishes	VWR	391-0453	90 x 14,2 mm2
Pipetman Classic P20	Gilson	F123600	2-20 μ L
Pipetman Classic P200	Gilson	F123601	20-200 μ LL
Pipetman Classim P1000	Gilson	F123602	200-1.000 μ L
Polivitox	OXÓIDE	SR0090A
Cloreto de Potássio	J.T. Baker Chemicals B.V.	0208	250 g
de Di-hidrogenofosfato de Potássio	J.T. Baker Chemicals B.V.	0240	1 kg
PS Pinça descartável	VWR	232-0191
Divisor removível	Tecniplast	1264C812
Tubos de polipropileno de fundo redondo	Falcon	352063	5 mL
de cloreto de sódio	Retentor MOLEKULA	41272436
SS e filtro de poliésterFolha	Tecniplast	1264C
Fórceps Padrão	Padrão F.S.T.	11000-12	Tesoura de
Tenotomia Stevens	FST	14066-11	Tesoura
Inoxidável - ToughCut	F.S.T.	14130-17	Luvas
descartáveis de nitrilo inoxidável Touch N Tuff	Ansell	92-500
Freezer de temperatura ultrabaixa (ULT)	Haier	DW-86L288	Volume = 288 L
Tesoura Wagner	FST	14070-12	Aço Inoxidável
Xylazine	Intervet

Gabinete de Segurança Microbiológica de microcentrífuga mais rápidos Inoxidável Cirúrgica de Aço