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Dissecção, cultura e análise de células da crista neural craniana primária do mouse para o estudo de delaminação e migração de células de crista neural

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DOI:

10.3791/60051

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3 de outubro de 2019

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1Centre for Craniofacial and Regenerative Biology, King's College London, 2Institute of Molecular Biology and Biotechnology, FORTH, Department of Biomedical Research, University of Ioannina, 3Randall Centre of Cell & Molecular Biophysics, King's College London, 4Department of Biological Applications and Technology, University of Ioannina

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Este protocolo descreve a dissecção e a cultura de pilhas neurais cranianas da crista dos modelos do rato, primeiramente para o estudo da migração da pilha. Nós descrevemos as técnicas ao vivo da imagem latente usadas e a análise da velocidade e da forma da pilha muda.

Resumo

Ao longo das últimas décadas tem havido um aumento da disponibilidade de modelos de rato geneticamente modificados utilizados para imitar as patologias humanas. No entanto, a capacidade de estudar os movimentos celulares e a diferenciação in vivo ainda é muito difícil. As neurocristopatias, ou distúrbios da linhagem da crista neural, são particularmente desafiadoras para estudar devido à falta de acessibilidade dos principais estágios embrionários e as dificuldades em separar a crista neural mesênquima do mesênquima mesodérmico adjacente. Aqui, nós estabelecemos para estabelecer um protocolo bem definido, rotineiro para a cultura de pilhas neural cranianas preliminares da crista. Em nossa aproximação nós dissecamos para fora a beira neural da placa do rato durante a fase neural inicial da indução da crista. A região da borda da placa neural é explantados e cultivada. O formulário neural das pilhas da crista em uma folha epithelial que circunda a beira neural da placa, e por 24 h após o explant, começa a delaminate, submetendo-se a uma transição epithelial-mesenchymal (EMT) para transformar-se pilhas neurais inteiramente motile da crista. Devido a nossa aproximação bidimensional da cultura, as populações distintas do tecido (placa neural contra a crista neural premigratory e migratória) podem facilmente ser distinguidas. Usando abordagens de imagem ao vivo, podemos então identificar alterações na indução da crista neural, EMT e comportamentos migratórios. A combinação desta técnica com mutantes genéticos será uma abordagem muito poderosa para a compreensão da biologia neural normal e patológica da célula da crista.

Introdução

A linhagem da crista neural (NC) é uma população transitória, multipotente e migratória de células que aparece exclusivamente em vertebrados durante o desenvolvimento embrionário precoce1,2. Os derivados da crista neural são extremamente diversificados, e incluem glia, músculo liso, melanócitos, neurônios e osso craniofacial e cartilagem3,4. Como a crista neural contribui para a função de muitos sistemas de órgãos, essa linhagem é essencial para a embriogênese humana. O desenvolvimento aberrante do NC é implicado em uma escala larga dos defeitos de nascimento humanos os mais comuns (isto é, fissura labial e palato)5, e igualmente desordens tais como Hirschsprung ' doença de s (HSCR), síndrome de Wardensburg (WS), síndrome da carga e síndrome de Williams6 ,7,8,9.

O desenvolvimento do NC foi explorado em um número de sistemas modelo não-mamíferos que incluem modelos de Xenopus, de pintainho e de zebrafish. Em mamíferos, o trabalho em modelos de mouse identificou alguns dos principais eventos genéticos subjacentes ao desenvolvimento da crista neural; no entanto, tem sido mais difícil seguir a biologia celular da migração da crista neural, devido à inacessibilidade do embrião do camundongo (revisado em outros10,11). Além disso, enquanto os estudos em pintainho, Xenopus e zebrafish estabeleceram uma rede reguladora do gene para NC, a perda de estudos da função nestes modelos animais às vezes não exibem um phenotype comparável no rato. Por exemplo, em xenopus, zebrafish e Chick, a sinalização não canônica de WNT é um dos mecanismos celulares que permite que a NC Adquira sua capacidade migratória12,13,14,15 . No entanto, no mouse, a perda de sinalização WNT não-canônica não parece afetar a migração16. Como in vivo NC migração tem sido difícil de rastrear por longos períodos de mouse, não está claro se estas espécies-diferenças refletem diferentes modos de migração, ou diferenças na regulação molecular.

Como observado, estudos NC no mouse têm sido muito desafiador, porque a cultura ex utero de embriões é trabalhoso. Além disso, o NC é constantemente no contato íntimo com os tecidos adjacentes tais como o mesoderma e o neurectoderm. O uso recente de motoristas de CRE específicos da crista neural ou corantes exógenos nos permitiu rotular de forma fluorescentamente a NC migratória; no entanto, essas abordagens ainda são limitadas. Apesar dos relatórios múltiplos que descrevem técnicas diferentes para visualizar a migração NC17,18, temsido difícil resolver estas técnicas em um procedimento simples e rotineiro.

É evidente que há necessidade de técnicas que permitam o manuseio e caracterização da NC de mamíferos. Nós focamos nossos esforços no NC craniano do rato porque é o modelo preliminar para estudar o desenvolvimento craniofacial humano e os neurocristopathies. Refinamos nossa abordagem com base em vários relatórios interessantes descrevendo a cultura primária das células NC19,20,21. Aqui, nós descrevemos completamente as técnicas ideais da cultura para de pilhas preliminares do NC. Nós demonstramos o método vivo da imagem latente da pilha e o uso óptimo de matrizes diferentes para revestir as placas da cultura. Nosso protocolo descreve como capturar a migração de células NC ao vivo usando um microscópio invertido, que se destina como uma diretriz para uso com outros microscópios, bem como um resumo detalhado de nossas análises celulares.

O resultado esperado do explante deve ser uma distribuição lindamente estabelecida de células que são claramente distinguidas o microscópio, onde se pode ver três diferentes populações de células que representam (i) placa neural, (II) premigratory, e, (III) células da crista neural migratória. Nós demonstramos como analisar os comportamentos da pilha na beira da população premigratory das pilhas durante a transição epithelial-mesenchymal. Também concentramos nosso esforço em estudar células totalmente migratórias para velocidade celular, distância e morfologia celular.

Protocolo

Todo o trabalho animal sofreu aprovação ética pelo King ' s College London processo de revisão ética e foi realizada de acordo com o Reino Unido Home Office Project License P8D5E2773 (KJL).

1. preparação dos reagentes

  1. Prepare soluções e ferramentas gerais, incluindo solução salina tampão fosfato estéril (PBS), 70% etanol, ferramentas de dissecção (fórceps e lâminas de dissecção ou agulhas estéreis), placas plásticas ou lâminas de vidro revestidas com uma matriz extracelular comercialmente disponível ( ECM)-baseado hidrogel ou fibronectina (veja a tabela dos materiais), e meios neural da crista (veja abaixo).
  2. Prepare o meio basal da crista neural usando o meio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM, 4500 mg/L de glicose), 15% soro fetal bovino (FBS), 0,1 mM mínimo essencial de aminoácidos não essenciais (MEM NEAA 100X), 1 mM piruvato de sódio, 55 μM β-Mercaptoetanol, 100 unidades/mL de penicilina, 100 unidades/mL de estreptomicina e 2 mM de L-glutamina.
    1. Condicionar a mídia durante a noite usando o crescimento-inibida STO alimentador células21.
      1. Prepare as células STO (veja a tabela de materiais) mídia para conter DMEM suplementado por 10% fbs e 100 u/ml de penicilina, 100 u/ml de estreptomicina. Cresça e expanda as células STO para confluência em 25 cm2 frascos revestidos com gelatina de 0,1%. Aplique 5000 RAD de irradiação gama.
      2. Semente de aproximadamente 3 x 106 células inibidas pelo crescimento em um prato de 10 cm2 ou 25 cm2 balão (da etapa 1.2.1.1). Adicione aproximadamente 10 – 12 mL de meio basal da crista neural e incubar durante a noite.
        Nota: as células semeadas podem ser usadas para produzir meio condicional por até 10 dias. Verificar a aparência das células regularmente
    2. Filtre o meio (tamanho do poro de 0,22 μm), e suplementa com o fator de crescimento básico do fibroblasto de 25 ng/mL (bFGF) e o 1000 U do fator do inibidor da leucemia (LIF).
      Nota: conservar a 4 ° c e utilizar dentro de um mês ou armazenar a-20 ° c e utilizar no prazo de 3 meses.
  3. Revele as superfícies da cultura do tecido com matriz extracelular.
    Nota: dependendo da pergunta biológica que está sendo feita, a matriz pode ser revestida em pratos de cultura de fundo de vidro, pratos de cultura de tecido plástico ou tampa de vidro desliza. Veja abaixo para diferentes diluições de hidrogel baseadas em ECM dependentes do substrato da matriz. Fibronectin foi testado em pratos com fundo de vidro e deslizamentos de cobertura apenas nas concentrações especificadas abaixo. Aqui, vamos nos referir às superfícies revestidas de substrato como "chapas revestidas".
    1. Revele as superfícies da cultura do tecido com hidrogel baseado ECM.
      Nota: manter o substrato frio até o chapeamento, quer por arrefecimento da mídia ou manter no gelo.
      1. Descongelar o hidrogel a 4 ° c durante a noite. Adicionar 5 ml de FBS 10% em DMEM a 5 mL de hidrogel para um volume final de 10 mL (ver a tabela de materiais).
      2. Faça alíquotas de 0,5 – 1 mL como convenientes e armazene a-20 ° c.
      3. Descongelar as alíquotas de hidrogel no gelo.
      4. Use uma diluição 1:20 do estoque do hidrogel para revestir o plástico.
      5. Use uma diluição 1:5 do estoque do hidrogel para revestir corrediças de vidro e placas Glass-Bottomed da cultura do tecido.
        Nota: diluir o hidrogel em DMEM frio .
      6. Aplique hidrogel diluído suficiente para cobrir a área desejada em placas/lâminas e incubar por 30 – 45 min a 37 ° c.
      7. Use placas/corrediças revestidas imediatamente ou armazene corrediças revestidas em 4 ° c durante a noite.
      8. Remova excessos e enxágüe slides com alta glicose DMEM (opcional) antes de usar.
    2. Cubra as superfícies da cultura do tecido com fibronectina.
      1. Faça alíquotas de 1 mg/mL de solução de fibronectina e armazene em-80 ° c. Diluir a fibronectina com PBS de Dulbecco (dPBS) a uma concentração final de 1 μg/mL.
      2. Aplique fibronectina suficiente para cobrir a área desejada e incubar à temperatura ambiente por 15 min.
      3. Retire a fibronectina residual e deixe o vidro secar durante 30-45 min.
      4. Enxágüe poços ou deslizamentos de cobertura com alta glicose DMEM (opcional) antes de usar.

2. dia 1: dissecção dos primeiros embriões da fase somita

Nota: Utilize ferramentas estéreis e soluções estéreis. Se for necessário genotipagem, colete o corpo do embrião para extração de DNA.

  1. A dissecção da placa neural craniana é restrita aos embriões em 8,5 dias após o coitum (DPC). Selecione embriões no estágio de 5 – 8 somite. Dissecar o útero em PBS e cortar o mesométrio para separar cada embrião (Figura 1a). A parede muscular do útero contrai e o tecido decidual se tornará visível (Figura 1b).
    Nota: manter os embriões no útero em PBS gelada, enquanto as dissecções são realizadas um embrião de cada vez. Mova os embriões com uma pipeta Pasteur de vidro em PBS estéril fresco para melhorar a visibilidade e reduzir a contaminação.
  2. Deslize o fórceps entre a camada do músculo e o tecido Decidual e remova a camada do músculo com um segundo par de fórceps (Figura 1C).
  3. Usando o fórceps, perfure o Erythroxylum nas bordas do pólo sinusóides e com um segundo par de rasgo do fórceps para abrir perpendicularmente ao pólo.
  4. Descasque para trás o tecido decidual com o fórceps para visualizar a membrana de Reichert.
  5. Retire cuidadosamente a membrana de Reichert. O saco vitelino visceral torna-se visível e o embrião pode ser observado no interior (Figura 1D).
  6. Retire o saco de gema visceral e o amnion (Figura 1e) e posicione o embrião para visualizar a prega da cabeça (Figura 1F).
  7. Corte a cabeça dobre acima do coração e raspar afastado o mesoderma subjacente usando fórceps e/ou ferramentas da pestana para obter uma placa neural limpa (NP) (Figura 1h).
    Nota: o NP pode ser mantido inteiro ou dividido para baixo o eixo anteroposterior de modo que cada lado possa ser chapeado individualmente. A borda da placa neural pode ser mais cortada longe da placa neural, a fim de minimizar as contribuições neuronais para os explantes.
  8. Use uma pipeta Pasteur de vidro para transferir a placa neural dissecada para um prato revestido com hidrogel preenchido com mídia de crista neural condicionada.
  9. Agitar suavemente o prato para posicionar o NP no meio do poço. Isto é importante para maximizar a qualidade da fase para a imagem latente da vivo-pilha (no dia 2).
  10. Incubar durante a noite (ou ao ponto de tempo desejado) a 37 ° c em 5% CO2. Células da crista neural devem ser visivelmente migrando para fora da placa neural.
    Nota: as células geralmente se unem dentro de 6 – 8 h. Depois que os anexos explante, permitem mais tempo para visualizar as células migratórias. Geralmente pelo explant do borne de 24 h, nós podemos encontrar três populações distinguíveis das pilhas. A primeira população, no centro do explante, é a placa neural (NP). A segunda população, a NC premigratory (pNC), circunda o NP em uma folha epithelial das pilhas. A terceira população, no anel externo, é formada por NC migratória (mNC), que são maiores em tamanho, e parecem totalmente mesenquimais (Figura 2).

3. dia 2: imagens da célula viva de células da crista neural craniana murina

Nota: a imagem latente deve ser executada no borne de 24 h que de para otimamente Image e quantificar a migração neural da pilha da crista. Os meios de indução NC não precisam de ser refrescados antes da imagem latente viva da pilha. O acesso a um microscópio invertido, com um estágio motorizado e uma câmara incorporada do ambiente é exigido. Use os pratos da cultura do tecido do multi-poço apropriados para a imagem latente (tabela dos materiais).

  1. Set-up do microscópio
    1. Ajuste a câmara do ambiente em 37 ° c e em 5% CO2.
    2. Perfure um furo na tampa da tampa da placa da cultura do tecido para permitir a agulha de CO2 , conectada à câmara da humidificação do co2 , para sentar-se dentro da placa.
    3. Coloc o prato da cultura do tecido no suporte e na fita da amostra para baixo a tampa da placa e a agulha de CO2 para impedir agitar durante a aquisição do multi-poço.
    4. Ligue o controlador do microscópio, o controlador de palco e o software de imagem.
    5. Concentre-se nas células NC cranianas com ampliação de 10x (com anel de fase correspondente no condensador selecionado).
    6. Ajuste a fase-contraste da alta qualidade no microscópio ajustando o diafragma da íris do campo, o diafragma da íris da abertura e o telescópio de centralização, como especific no manual ajustado do microscópio.
  2. Imagens de células ao vivo de contraste de fase
    1. Defina o local do diretório ou arquivo onde os arquivos de lapso de tempo serão salvos.
    2. Defina o tempo de exposição, a binning e a área da câmera.
    3. Defina o número de pontos de tempo, a duração da imagem e o intervalo de tempo entre quadros.
      1. Para quantificar a capacidade migratória da célula NC, defina o microscópio para ampliação de 10x, levando 1 quadro a cada 5 min (217 pontos de tempo acima de 18 h). Para quantificar a morfologia celular, defina a ampliação para 40x, levando 1 frame/min (61 pontos de tempo acima de 1 h). Para quantificar a dinâmica lamellipodial, ajuste a ampliação à ampliação 40x ou 60x, tomando 1 quadro cada 10 s (sobre 10 minutos).
    4. Para a imagem latente do multi-poço, ajuste o estágio mecânico para mover-se entre posições XY selecionadas do interesse. Confirme que as células NC cranianas estão em foco e as posições do estágio estão corretas.
    5. Use o comando adquirir para iniciar a imagem de lapso de tempo.
    6. Uma vez concluída a imagem de lapso de tempo, revise os dados multidimensionais e exporte arquivos. STK para análise.
      Nota:. STK é um ficheiro de pilha TIFF.
    7. Saia do software, desligue o computador e desligue o palco, câmera e controladores de microscópio.

4. análise da imagem latente: quantificação da migração neural da pilha da crista

Nota: para definir melhor os comportamentos celulares expostos pela migração das células da crista neural craniana murina, analisamos uma série de parâmetros migratórios quantificáveis, focando especificamente na capacidade migratória e na dinâmica da forma celular. (1) a migração (distância acumulada) é o comprimento total do trajeto tomado pela célula (μm); (2) a migração (distância euclidiana) é a distância de linha reta entre a posição inicial e final da célula (μm); (3) a migração (velocidade celular) é a distância percorrida por célula por unidade de tempo (μm/min); (4) a forma da pilha (área da pilha) é a superfície total coberta pela pilha. Ajuste o pixel à escala do mícron de acordo com o microscópio da imagem latente. (A = PX x n px, onde uma áreaPX = pixel e nPX = número de pixels. Unidades: μm2; (5) a forma celular (circularidade celular) é o desvio da forma celular de um círculo perfeito que é indicado por um valor de circularidade de 1,0 (4Π (a/p2)) onde a = área e p = perímetro.

  1. Rastreamento de célula única
    Observação: para medir a migração de célula NC, coordenadas XY de células individuais em todos os quadros de lapso de tempo são geradas. Isto permite a análise subseqüente de medidas da distância, da velocidade e da persistência da migração da pilha.
    1. Abra o ImageJ e importe dados como arquivos de pilha TIFF.
    2. Clique em analisar | Definir escala para calibrar os arquivos. STK de acordo com as configurações do microscópio, trabalhando em pixel/μm.
    3. Clique em plugins | Rastreamento | Manual de rastreamento para abrir Image J manual de rastreamento de célula plugin. Para iniciar o rastreamento de célula, selecione Adicionar faixa.
    4. Rastreie células através de todos os quadros de filmes de lapso de tempo, usando o núcleo como um ponto de referência.
      Nota: 10 – 20 células devem ser rastreadas por explante, com um total de 60 células controladas (n = 3). As células que passam por divisão celular durante o decorrer do lapso de tempo devem ser excluídas da análise.
    5. Salve e exporte os resultados como um arquivo. csv. Os resultados representam número de faixa de célula individual, número de fatia e coordenadas XY em todos os quadros.
  2. Quantificação da capacidade migratória da célula de crista neural
    1. Abra dados de rastreamento de célula única (veja acima). Converta arquivos. csv em formato de arquivo. txt.
    2. Abra o software de migração (a tabela de materiais). Clique na guia importar dados para importar os dados de rastreamento de célula como um arquivo. txt.
    3. Em conjuntos de dados | Inicialização, selecione o número de fatias ou quadros a serem analisados e defina a calibração XY e o intervalo de tempo entre quadros. Selecione aplicar configurações para salvar as configurações.
    4. Selecione o símbolo de dados de plotagem para formar plotagens de trajetória. Selecione o símbolo de estatísticas para quantificar as medidas de distância e velocidade.
    5. Salve as plotagens de trajetória como arquivos de bitmap (. bmp) e medidas de distância e velocidade como arquivos. txt. Selecione o símbolo remover dados . Repita para outros arquivos de lapso de tempo.
      Observação: as plotagens de trajetória podem ser usadas para visualizar a franqueza de caminhos de células individuais para uma determinada condição de célula ou estado ao longo dos filmes de lapso de tempo (figura 4a). Os dados de distância e velocidade armazenados nos arquivos. txt podem ser usados para análise posterior.
  3. Quantificação da área celular de crista neural e circularidade
    1. Abra os arquivos Time-Lapse. STK no ImageJ e calibre de acordo com as configurações do microscópio, trabalhando em pixel/μm.
    2. Em analisar | Definir medições, clique para selecionar os parâmetros de forma de célula: área de célula, perímetro e descritor de forma.
    3. Use a ferramenta seleção de mão livre para desenhar manualmente em torno de cada célula, usando os limites da membrana celular como um guia.
    4. Pressione Ctrl + B chaves no teclado para manter o contorno da célula sobreencontrado na imagem. Repita para as células sobre cada quadro de lapso de tempo.
    5. Use a imagem | Sobreposição | Para o ROI Manager para armazenar os valores.
    6. Depois que todas as células de interesse por quadro tiverem sido descritas, clique em medir. Salve os resultados como um arquivo. csv.
      Nota: 10 – 20 células por filme devem ser delineadas, com um total de 30 – 60 células analisadas por condição (n = 3). Dados de forma celular (arquivos. csv) podem ser usados para quantificar como a dinâmica da forma celular muda ao longo do tempo (Figura 4C) ou como a morfologia pode ser alterada em diferentes tratamentos celulares.

Resultados

Usando o procedimento demonstrado aqui, os embriões do rato foram dissecados do útero, e os tecidos extraembriogênicas foram removidos (Figura 1a – D). Os embriões eram somite encenado (usando somente embriões em 5 – 8 mesodérmicos (SS), Figura 1E, F). A placa neural craniana foi então dissecada e o neuroepitélio foi isolado. Células mesodérmicas, identificadas como células soltas, circulares, mesenquimais, foram suavemente escovadas (Figura 1G-L). A placa neural anterior pode ser explantados inteiro, caso em que o tecido neural da crista emergirá lateralmente e expandirá radialmente em torno do explant, ou cada beira neural da placa (direita e esquerda) pode ser explantados separada. Isto é particularmente útil quando de de mutantes genéticos.

Dentro de 24 h, uma região da crista neural craniana (epithelial) premigratory pode claramente ser vista em torno do explante neural da placa (Figura 2b). Além disso, uma subpopulação de células de crista neural sofreu transição epitelial para mesenquimais e parece totalmente mesenquimal (Figura 2). Assim, temos vários anéis concêntricos de células distintas, com a placa neural (NP) no centro, a crista neural premigratory (pNC) no círculo intermediário, e uma população de crista neural migratória (mNC) no anel externo (Figura 2b). A fim traçar pilhas do NC, é possível usar modelos genetically modificados do rato como nós mostramos em Figura 2C. Neste caso, nós usamos a crista neural específica Wnt1:: CRE; RosaMtmg que resulta em células NC sendo rotuladas em verde. Nestes camundongos, células de tomate membrana expressa (mT, em vermelho) a menos que eles estão expressando CRE recombinase. Recombination conduz às pilhas que expressam a proteína fluorescente verde da membrana (GFP, no verde). As células vermelhas mostradas no centro do explante são células da placa neural. Algumas células da placa neural dorsal também expressam GFP; para a cultura a longo prazo, nós exigiríamos o consumo de todas as células no centro. Para nossos propósitos, a pureza do explante é suficiente para rastrear as diferentes populações de células da crista neural. Onde a pureza mais elevada da crista neural é necessária, esta estratégia de rotulagem genética pode ser combinada com a triagem de células ativadas fluorescentes (FACS) para garantir a pureza da população. Alternativamente, é possível fixar os explantes e identificar a população do NC com rotulagem do anticorpo.

Também foi evidente por 24 h que os anéis concêntricos característicos das células NC premigratory e totalmente migratórias das culturas explantes não eram dependentes nem governados pela escolha da matriz (Figura 3). As culturas do explante chapearam em um hidrogel ECM-baseado e em um fibronectina deram forma a estruturas explante comparáveis, compreendendo as três populações da pilha, NP, PNC e MNC (Figura 3A, C). A morfologia neural da pilha da crista era igualmente comparável entre aquelas chapeadas no hidrogel ECM-baseado e no fibronectina (Figura 3B, D). No entanto, os explantes revestidos com fibronectina produziram células com células mais proeminente na borda principal da célula, aparentemente mais polarizada na direção da migração (Figura 3B, D).

Uma vez que uma população de células de crista neural migratórias é evidente, a imagem latente viva da pilha pode ser terminada. A microscopia do lapso de tempo é ajustada à ampliação 10x (18 h, 1 frame/5 minuto) para a análise subseqüente da migração da pilha do NC (figura 4a). O plug-in de rastreamento manual do ImageJ gera coordenadas XY de células individuais em todos os quadros dos filmes de lapso de tempo (Figura 4B). Essas coordenadas podem ser processadas usando o software de migração. Este software permite a visualização de faixas de células individuais ao longo do tempo (Figura 4B) e pode ser usado para quantificar a distância acumulada e euclidiana, bem como a velocidade da célula.

Os dados da imagem latente do tempo-lapso igualmente fornecem uma riqueza da informação na morfologia da pilha durante a migração de pilhas neurais cranianas da crista (Figura 4C). Ao delineando as membranas celulares individuais, as medições da área celular e do perímetro podem ser calculadas a partir de todos os quadros dos filmes (Figura 4C). Essas medidas permitem a posterior quantificação da área celular e da circularidade (Figura 4D). A Figura 4C mostra uma análise das mudanças da forma da pilha sobre 18 h. Observe que, à medida que as células migram para longe do explante, a área celular aumenta significativamente enquanto a circularidade celular permanece relativamente constante (ANOVA unidirecional, teste de comparações múltiplas de Tukey) ( Figura 4E,F). Isto sugere que como as pilhas partem da borda epithelial e perdem contatos da pilha-pilha, mostram a área aumentada da propagação da pilha. As medidas de circularidade celular não se modificavam significativamente ao longo do tempo; no entanto, as alterações de curto prazo na circularidade podem ser observadas se um número aumentado de pontos temporais for quantificado. As medidas da circularidade da pilha podem igualmente fornecer dados interessantes na dinâmica da forma da pilha na presença de uma sugestão Quimiotáticos ou circunstâncias confinadas.

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Figura 1: isolamento dos explantes da crista neural craniana de um embrião e 8.5.
As imagens são fotos de um vídeo documentando a técnica de microdissecção. (A – C) Dissecção do embrião do útero. (B – C) Usando dois fórceps afiado, puxe delicadamente distante a camada muscular. O painel (D) mostra o embrião dentro do saco de gema visceral (linha amarela). Extraia o embrião do saco de gema visceral. E) vista lateral do embrião no estádio 8,5 lateral. F) vista dorsal do embrião no estádio 8,5. Contagem de mesodérmicos (SS) para determinar a idade dos embriões; geralmente 5 – 8 SS (círculos amarelos em F). (G) feche acima o olhar na região craniana do embrião. Remover membranas extraembrionárias da região craniana; os mesodérmicos são marcados com uma linha amarela. (H) as dissecções da placa neural anterior são executadas o primeiro arco branquial (linha amarela). (I) visão lateral da dissecção da placa neural anterior. As dobras neurais, onde as células da crista neural surgem, são marcadas com uma linha amarela. (J – L) Remova o tecido Mesodermal (pilhas mesenquimais macias) as dobras neurais anteriores subjacentes tanto quanto possível antes de chapeamento NP em pratos preparados da cultura. O filme foi tomado usando um estéreo-microscópio com uma lente apocromático do Widefield no zumbido 3.0 x (veja a tabela dos materiais). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 2: explante da crista neural craniana murina.
(A) representação esquemática da vista dorsal de um embrião de rato e 8.5. A região craniana do embrião é cortada na linha tracejada. A borda da placa neural (destacada em vermelho) é isolada do tecido mesoderma circundante e cultivada por 24 h para permitir que a crista neural craniana para emigrar. Esquemático adaptado de22,23. (B) esquerda: imagem brilhante representativa do campo de um explante neural craniano da crista 24 horas após o chapeamento. Três populações de células são observadas, que também são esquematizadas à direita. NP = placa neural, pNC = crista neural pré-migratória e mNC = crista neural migratória. Barra de escala = 250 μm. (C) imagens de ampliação mais elevadas de um explante do rato geneticamente rotulado (Wnt1:: CRE; RosaMtmg). Células sem o driver CRE expresso membrana tomate (mT) em vermelho. A expressão de CRE o controle de um promotor Wnt1 específico da crista neural conduz à excisão da gaveta do mT e da expressão da membrana GFP (magnésio) no verde. Os núcleos são manchados com Hoescht (no azul). Barra de escala = 200 μm. (d – d ' ') imagens de ampliação mais elevadas de células migratórias expressando a membrana GFP (d). (D ') O DNA é rotulado com Hoescht (azul). (D ' ') Fusão de D e D '. Barra de escala = 20 μm. por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 3: explantes cultivados em diferentes substratos.
(A – B) Imagens de contraste de fase de explantes cultivadas em ECM-Hydrogel comercial. (C – D) Explantes cultivados em 1 μg/mL de fibronectina. A placa neural (NP), as pilhas de crista neurais premigratory (pNC) e migratórias (mNC) podem ser distinguidas por suas morfologias de pilha de deferimento. Barra de escala = 100 μm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 4: quantificação da migração da célula de crista neural craniana e dinâmica da forma celular.
(A) os frames da fase-contraste da imagem latente do tempo-lapso de culturas do explante sobrepostas com únicas trilhas neurais da pilha da crista, usando o plug-in manual de rastreamento de célula de ImageJ/Fiji. dez células MNC representativas foram rastreadas manualmente sobre 18 h (217 frames) e o XY coordenadas foram exportadas. Os dados são representados como um ponto de sobreposição e plotagens de linha. As células foram chapeadas em 1 μg/mL de fibronectina. Barra de escala = 200 μm. (B) plotagem de trajetória representativa de 10 células MNC, geradas com software de migração. (C) fase-quadros de contraste retirados da análise temporal de culturas explantes. Linhas tracejadas descrevem 8 células de crista neural migratórias representativas analisadas para a dinâmica da forma celular quando revestida em 1 μg/mL de fibronectina. Barra de escala = 200 μm. (D) representação esquemática dos cálculos utilizados para quantificar a área celular e a circularidade. A morfologia celular do esquemático é a da célula destacada em azul (C). Uma áreaPX = pixel, NPX = número de pixel, a = área, P = perímetro (1 pixel = 1,60772 μm2). (E – F) Quantificação das medidas de área celular e circularidade celular ao longo do tempo. Os dados representam média ± SEM. Cada ponto representa uma célula (n = 60), retirada de 3 experimentos independentes, e analisada em 0 h, 6 h, 12 h e 18 h (ns não significantes, * p < 0,05, * * * * p < 0, 1 ANOVA One-Way, teste de comparações múltiplas de Tukey). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

Estudar células de crista neural de mamíferos tem sido um desafio para os cientistas por causa da natureza in utero do desenvolvimento de mamíferos. Estudos in vivo são difíceis de configurar, pois o embrião deve ser manipulado em condições que imitam a vida no útero. Na prática, é quase impossível a cultura rereproduvelmente estes (E8 +) embriões por mais de 24 h, especialmente para imagens ao vivo. Além disso, a indução e a migração da crista neural ocorrem concomitantemente com o fechamento do tubo neural e o torneamento embrionário no camundongo; Este é um evento morfogenético crucial e estressante, que freqüentemente falha quando os embriões são cultivados ex utero. Assim, a taxa de sucesso de abordagens ex utero é geralmente baixa. O uso de células NC imortalizadas21 é uma ferramenta útil para reduzir o uso de animais e pode fornecer uma melhor fonte de células de crista neural para análise a longo prazo, transfecção e estudos de enriquecimento. No entanto, há claramente uma necessidade de cultura confiável células da crista neural primária. Nosso método é aplicável a knock-out do mouse ou modelos genéticos condicionais. Um método comparável ao nosso foi descrito para outras populações de crista neural20; Entretanto, nosso método descreve completamente o isolamento passo a passo de células NC cranianas murinas. Também descrevemos o uso de diferentes matrizes, bem como o procedimento de análise de migração em detalhes.

Para alcançar resultados consistentes, verificou-se que a atenção especial paga para o estadiamento durante a seleção de embriões. Não surpreendentemente, o número de mesodérmicos se correlaciona com diferentes estágios no desenvolvimento do NC craniano. Portanto, o conhecimento da anatomia do embrião é muito importante antes de adquirir quaisquer dados experimentais. Esta aproximação pode então ser adaptada para isolar populações discretas de pilhas neurais da crista, dependendo da pergunta biológica e das pilhas do alvo.

Uma vez que os embriões são selecionados e dissecados, as células mesodérmicas podem ser prontamente distinguidas e devem ser removidas para permitir melhor visualização e reduzir a contaminação. Para culturas de longo prazo, o tecido da placa neural pode ser removido a 24 h de chapeamento, a fim de evitar a contaminação por tecidos neurais. Um refinamento mais adicional poderia ser o uso da rotulagem fluorescente da linhagem (por exemplo, usando um Wnt1:: CRE ou Sox10:: os excitadores de creert combinaram com os repórteres fluorescentes24,25) para distinguir pilhas neurais da crista de outros tecidos, como mostrado na Figura 2C.

Os relatórios precedentes destacaram o potencial de culturas do explante do rato do chapeamento NC em matrizes diferentes, o mais geralmente em hydrogels comerciais do ECM, no fibronectina e no colagénio mim20,21,26. Em nossas mãos, as culturas do explante do NC do rato craniano são crescidas com sucesso em todas as três matrizes, nas concentrações especificadas em relatórios originais (dados não mostrados). A aproximação refinada inicial que nós adaptamos para nossas culturas do explante do NC usou um hidrogel comercial como a matriz da escolha, que consistiu primeiramente no laminina e nos colágenos21(A Figura 3A – B). No entanto, a composição deste hidrogel não está claramente definida, com fator de crescimento desconhecido e teor de proteínas. Como tal, temos desde então mudou a nossa abordagem para chapeamento do mouse NC culturas explantes em fibronectina (A Figura 3C – D). Fibronectin é bem definido e altamente expresso nas membranas de ECM e cave ao longo do qual as células NC migramin vivo28,29,30. Para otimizar uma matriz de fibronectina que melhor Replica a migração de células de crista neural e a morfologia como visto usando o hidrogel, comparamos os comportamentos de células NC expostos no hidrogel contra uma titulação de 0,25 – 30 μg/mL de fibronectina, e definimos 1 μg/mL de fibronectina como fornecendo Propriedades ideais (dados não mostrados). Acreditamos que este trabalho preliminar pode ajudar a estabelecer um quadro para a comparação sistemática de matrizes, como a fibronectina, contra as descritas anteriormente, ou seja, colágeno e laminina32,33,34. Seria especial interessante comparar a capacidade migratória da pilha do rato NC no fibronectina contra o colagénio mim, dado que o colagénio-IA1 é secretado endogenamente pelo rato, pelas pilhas aviárias e humanas do NC28,30,31,32. O colágeno I é, portanto, tão relevante quanto a fibronectina na consideração da escolha da matriz. Também vale a pena reconhecer que a biodisponibilidade dos fatores de crescimento nos meios de comunicação pode ser alterada por diferentes componentes da matriz, especialmente tendo em conta o elevado teor sérico dos nossos meios de comunicação. Para superar isso, estamos trabalhando atualmente para produzir condições de cultura definida sem soro. Estes meios definidos são usados com sucesso em protocolos neurais da indução da crista no campo pluripotente da pilha de haste, mas exigem uma optimização mais adicional para nosso sistema da cultura do explante do NC33,34. Nosso trabalho também pode servir como ponto de partida para condições de refino para outros tipos de células NC, como o cardíaco e tronco NC, e para estudos subsequentes de diferenciação de NC. Mais importante ainda, este protocolo permite o isolamento de células NC cranianas para uma variedade de aplicações. Nós imaginamos estudos sobre migração direcionada, migração 3-D e invasão. As células isoladas desta forma podem ser tratadasin vitropara uma série de análises. Por exemplo, as células podem ser prontamente tratadas usando diferentes moléculas pequenas para direcionar proteínas específicas, elas podem ser tratadas em pontos de tempo definidos e experimentos de washout podem ser projetados para determinar a recuperação de comportamentos de células (A Figura 4). A cultura a longo prazo para o transfection e os ensaios da diferenciação é possível, assim como a passagem das pilhas (dados não mostrados). Entretanto, a viabilidade, a capacidade de renovação celular e a multipotência devem ser validadas após o passaging. As pilhas chapeadas em COVERSLIP de vidro podem igualmente ser usadas em protocolos de coloração Immunofluorescent, seguindo a imagem latente viva. Finalmente, esta abordagem representa um sistema tremendamente poderoso para estudar a migração de NC de modelos genéticos de mouse22,23,24,25.

Divulgações

Os autores não têm conflitos de interesse.

Agradecimentos

Estamos gratos à unidade de serviços biológicos do King ' s College London, especialmente Tiffany Jarvis e Lynsey Cashnella por seu apoio continuado. Agradecemos a Derek Stemple, Mamoru Ishii e Robert Maxson por aconselhamento e ajuda com reagentes durante o estabelecimento inicial deste protocolo. Agradecemos a Dheraj Taheem por ajuda com irradiação gama de células STO. Agradecemos aos laboratórios Liu e Krause, especialmente ao Tommy Pallett, por um grande apoio. Este trabalho foi financiado por subsídios do BBSRC (BB/R015953/1 para KJL/MK), um Studentship do programa de treinamento de doutorado (LD) do MRC, Newland Pedley Fund (ALM) e KRIPIS II, Secretaria-geral de pesquisa e tecnologia (GSRT), Ministério da educação e religiosos Da Grécia e da Fondation Santé (à SGGM).

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
bFGFR& D systems233-FB
b-mercaptoetanolGibco31350-010
Frascos de cultura de tecidos Frascosde cultura Corning43063925cm2
DMEM (4500 mg/L de glicose)SigmaD5671
Solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco (dPBS)SigmaD8537
EtanolFisher ChemicalsE/0650DF/C17
Soro bovino fetalSigmaTFS AA 10-155
Soro bovino fetal (ES Cell FBS)Gibco26140079/16141-079
Plasma bovino de fibronectinaSigmaF1141
Gelatina de pele bovinaSigmaG9382
L-glutaminaSigmaG7513
Fundo de vidro, multipoços 24- placa de cultura de tecidos de poçoIbidi82406Placa de cultura de tecidos com fundo de vidro, nº 1.5, 24 poços com lados pretos
Ferramenta de análise de migração celularIbidiv2.0Os manuais para este software podem ser encontrados em: https://ibidi.com/manual-image-analysis/171-chemotaxis-and-migration-tool.html.
Plug-in de circularidadeImageJv1.29 ou posteriorO plug-in de circularidade é uma versão estendida do ImageJ/Fiji' s Comando de medição, projetado por Rasband, W., (2000) (wsr@nih.gov).
LIFESGRO by MilliporeESG1106
Plug-in de rastreamento celular manualImageJv1.34k ou posteriorref Cordelieres F. Institut Curie, Orsay (França) 2005
Software de análise de imagem de microscópioUniversal Imaging Corporation6.3r7MetaMorph Software Series 6.3r7
Aminoácidos não essenciais MEM 100XGibco11140-050
Matrigel ( Hidrogel à base de ECM)Corning356234
MicroscópioOlympus1X81Microscópio invertido Olympus 1X81
Câmera de microscópioPhotometrics512BPhotometrics Cascadell 512B câmera (4x UPlanFL N, 10x UPlanFL N, 20x UPlanFL N, 40x UPlanFL N objetivas)
Controlador de microscópioOlympus1X2-UCBOlympus
1X2-UCB controlador de microscópioControlador de temperatura para microscópioSolent ScientificRS232mantido em 37° C
Penicilina / estreptomicinaSigmaA5955
Piruvato de sódioSigmaS8636
Software estatísticoGraphpad Prismv7.0
STO células alimentadorasATCCCRL-1503
EstereomicroscópioNikonSMZ
XY microscópio controlador de palcoApplied Scientific Instrumentação (ASI)MS-4400

Referências

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