É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.

Artigo de método

Avaliação da migração do linfócito em um sistema de transmigração ex vivo

6.7K visualizações

⸱

DOI:

10.3791/60060

⸱

20 de setembro de 2019

 , 
1Department of Internal Medicine, University of Utah, 2Research Service, VA Nebraska Iowa Health Care System, 3Department of Internal Medicine, University of Nebraska Medical Center, 4Department of Environmental, Agricultural & Occupational Health, University of Nebraska Medical Center

Neste artigo

Resumo

Neste protocolo, os linfócitos são colocados na câmara superior de um sistema de transmigração, separados da câmara inferior por uma membrana porosa. A quimiocina é adicionada à câmara inferior, o que induz a migração ativa ao longo de um gradiente de quimiocina. Após 48 h, os linfócitos são contados em ambas as câmaras para quantificar o transmigration.

Resumo

Neste documento, apresentamos um método eficiente que pode ser executado com habilidades e materiais laboratoriais básicos para avaliar o movimento quimiocineítico do linfócito em um sistema de transmigração ex vivo. As pilhas lymphoid inata do grupo 2 (ILC2) e as pilhas do ajudante de CD4+ T foram isoladas dos baços e dos pulmões do ovalbumina do ovo da galinha (óvulos)-desafiaram ratos de Balb/c. Nós confirmamos a expressão de CCR4 em pilhas de T CD4+ e em ILC2, comparativamente. CCL17 e CCL22 são os ligantes conhecidos para CCR4; Conseqüentemente, usando este método ex vivo da transmigração nós examinamos o movimento CCL17- e CCL22-INDUCED de CCR4+ linfócitos. Para estabelecer gradientes de quimiocina, CCL17 e CCL22 foram colocados na câmara inferior do sistema de transmigração. Os linfócitos isolados foram adicionados então às câmaras superiores e sobre um período de 48 h os linfócitos migraram ativamente através dos poros de 3 μm para o quimiocina na câmara inferior. Este é um sistema eficaz para determinar o chemokinetics dos linfócitos, mas, compreensivelmente, não imitam as complexidades encontradas nos microambientes in vivo do órgão. Esta é uma limitação do método que pode ser superado pela adição da imagem latente in situ do órgão e dos linfócitos o estudo. Por outro lado, a vantagem deste método é que é pode ser realizada por um técnico de nível de entrada a uma taxa muito mais rentável do que imagens ao vivo. Como os compostos terapêuticos tornam-se disponíveis para melhorar a migração, como no caso de tumor infiltrando células imunes citotóxicas, ou para inibir a migração, talvez no caso de doenças auto-imunes onde a Imunopatologia é preocupante, este método pode ser usado como um ferramenta de triagem. Em geral, o método é eficaz se a quimiocina de interesse é consistentemente gerando quimiocinetics em um nível estatisticamente mais elevado do que o controle de mídia. Em tais casos, o grau de inibição/realce por um composto dado pode ser determinado também.

Introdução

Este método original de transmigração foi apresentado por Stephen Boyden em 1962 no periódico de medicina experimental1. Muito do que sabemos sobre quimiotaxia e quimiocinetics não seria possível sem o desenvolvimento da câmara de Boyden. Antes da descoberta da primeira quimiocina em 1977, os sistemas de transmigração ex vivo foram utilizados para aprender sobre os fatores séricos que poderiam prender o movimento celular em macrófagos, enquanto amplificavam a motilidade celular em neutrófilos1,2. Uma riqueza maciça do conhecimento foi desenvolvida a respeito da migração imune da pilha, e até à data, 47 quimiocinas foram descobertas agora com 19 receptores correspondentes3,4. Além disso, multidões de inibidores/potenciadores dessas vias de quimiocina passaram por desenvolvimento para fins terapêuticos5,6,7,8. Muitos desses compostos foram testados em câmaras de transmigração semelhantes para compreender as interações diretas entre os compostos e a responsividade da célula imune a uma determinada quimiocina9.

A transmigração, ou diapedese, em tecido inflamado é um processo essencial para uma resposta inflamatória saudável à infecção clara10,11. Uma câmara de Boyden, sistema de transmigração, ou aparelho transwell são geralmente compostas por duas câmaras separadas por uma membrana porosa1,12. A câmara inferior mais frequentemente detém meios contendo a quimiocina de interesse, enquanto os leucócitos são colocados na câmara superior. O tamanho do poro na membrana pode ser selecionado com base no tamanho da célula de interesse. Para este projeto, selecionamos uma membrana porosa de 3 μm, pois as células linfóides têm 7-20 μm de tamanho, dependendo do estágio do desenvolvimento celular. Este tamanho do poro assegura-se de que estas pilhas não estejam caindo passivamente através dos poros, mas que estão migrando ativamente em resposta ao inclinação do quimiocina.

A principal vantagem deste protocolo é a sua rentabilidade. A transmigração in vivo é difícil porque requer treinamento extensivo em manuseio e cirurgia de animais, e muitas vezes envolve microscopia de alta potência que nem sempre está disponível para um pesquisador. A triagem econômica de compostos pensados para aprimorar ou inibir a transmigração pode ser realizada com antecedência na imagem latente in vivo. Como o sistema de transmigração é rigorosamente controlado, as células podem ser tratadas inicialmente, em seguida, adicionadas ao aparelho transwell, ou, vice-versa, a quimiocina pode ser tratada primeiro com um inibidor de quimiocina, em seguida, as células adicionadas ao aparelho transwell. Por fim, células endoteliais e/ou proteínas da membrana basal podem ser adicionadas ao fundo da pastilha transwell 1-2 dias antes do experimento de transmigração para compreender o envolvimento dessas células de barreira em quimiocinetics. Novamente, essas manipulações do sistema fornecem um meio poderoso de determinar informações importantes sobre a eficácia de um determinado composto antes de estudos mais complicados in vivo.

A utilização de um sistema de câmara de transmigração é uma forma efetiva de avaliar a mobilidade dos linfócitos várias condições in vivo e in vitro12,13,14. Nisto, nós descrevemos um método aperfeiçoado para avaliar a compreensibilidade ex vivo do linfócito aos quimiocinas em uma câmara do transmigração. Neste experimento de exemplo, as células T CD4+ e as células linfóides inatas do grupo 2 (ILC2) foram isoladas de camundongos machos e fêmeas, Balb/c após exposição de óvulos-alérgeno. Uma hipótese foi gerada que CCR4+ CD45+ Lineage-(Lin-) ILC2 dos ratos alérgeno-desafiados migrariam mais EFICIENTEMENTE para CCL17 e CCL22 do que pilhas do ajudante de CCR4+ de CD4+ T. CCL17 e CCL22 são quimiocinas comumente produzidas por células dendríticas e macrófagos do fenótipo m2 (alérgico), entreoutrascélulas, emalergia15,16. CCL17 e CCL22 podem ser pensados como biomarcadores de inflamaçãoalérgica, poissão prontamente detectados nos pulmões durante as exacerbações das vias aéreas16,17,18. É importante ressaltar que a expressão CCR4 é elevada em comparação aos controles não tratados, como revelado em dados bioinformaticos gerados a partir de ILC2 isolados de animais tratados com ácaros da casa, e similarmente ILC2 de animais ingênuos tratados ex vivo com IL-33 ( cytokine inata de promoção do alérgeno) upregulates CCR4,19. Além disso, de acordo com dados para ILC2 na base de dados do projeto do genoma imunológico (www.immgen.org), CCR4 mRNA é expressado altamente nestas pilhas imunes inata. Até o momento, pouco se sabe sobre o tráfico de ILC2 em tecidos, mas é provável que as células T de ILC2 e CD4+ usem quimiocinas e receptores semelhantes para quimiotaxia e quimiocinetics, pois expressam fatores e receptores de transcrição semelhantes. Assim, comparamos a responsividade CCL17 versus CCL22, dos linfócitos T de ILC2 e CD4+ , tanto de machos como de fêmeas, animais desafiados por óvulos.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Protocolo

Todos os métodos descritos aqui foram revisados e aprovados pelos comitês institucionais de cuidados e uso de animais da Universidade de Nebraska Medical Center (UNMC) e da Universidade de Utah.

1. configuração e preparação de reagentes

  1. Prepare a mídia completa do RPMI (Roswell Park Memorial Institute).
    1. Adicionar 10 mL de soro bovino fetal inativado por calor (FBS) a 90 mL de RPMI.
    2. Adicionar 1 mL de 100 x penicilina-estreptomicina-glutamina a 100 mL de 10% FBS RPMI.
  2. Prepare a mídia de expansão ILC2.
    1. Adicione IL-2 e IL-33 (20 ng/mL cada citocina) a 10 mL de RPMI completo.
    2. Se as citocinas de ações são 10 μg/mL, pipetam 20 μL de IL-2 e IL-33 em um tubo de 15 mL contendo 10 mL de meios completos de RPMI.
  3. Prepare o meio de dissociação pulmonar.
    1. Adicionar 50 mg de colagenase tipo 1 a 250 ml de RPMI não suplementado.
    2. Adicionar 2,5 mL de penicilina 100x-estreptomicina-glutamina para o 250 mL de mídia na etapa 1.3.1.
    3. Misture suavemente a mídia para garantir que o tipo 1 Collagenase está completamente dissolvido antes de usar.
  4. Prepare RPMI livre de soro.
    1. Diluir 1 g de albumina sérica bovina liofilizada (BSA) em 200 mL de RPMI.
    2. Adicionar 2 mL de 100x penicilina-estreptomicina-glutamina.
    3. Misture suavemente a mídia para garantir que a BSA é completamente dissolvido na mídia antes de usar.
  5. Prepare o meio de migração com CCL17.
    1. Adquira 10 mL de RPMI sem soro e adicione CCL17 [50 ng/mL].
      1. Se a CCL17 de ações for de 10 μg/mL, adicione 50 μL de estoque de CCL17 a 10 mL de mídia RPMI sem soro.
  6. Prepare o meio de migração com CCL22.
    1. Adquira 10 mL de RPMI sem soro e adicione CCL22 [50 ng/mL].
    2. Se a CCL22 de ações for de 10 μg/mL, adicione 50 μL de estoque de CCL22 a 10 mL de mídia RPMI sem soro.
  7. Prepare CCR4 anticorpo mancha cocktail.
    1. Para 10 testes totais, adicione 5 μL de cada um dos seguintes anticorpos a um tubo de 5 mL: CCR4, CD19, CD11b, CD45, ST2, e ICOS do anti-rato.
      Nota: Exemplo de como fazer coquetel de anticorpos para 10 amostras: 0,5 μL de cada anticorpo x 10 amostras = 5 μL de cada um dos anticorpos listados em 1.7.1.
    2. Para 10 testes totais, adicione 2,5 μL dos seguintes anticorpos ao cocktail do anticorpo do passo 1.7.1: anti-rato CD3, CD11c, e NK 1.1.
      Nota: Exemplo para completar o coquetel de anticorpos para 10 amostras: 0,25 μL x 10 amostras = 2,5 μL de anticorpos CD3, CD11c e NK 1.1.
    3. Guarde o cocktail de coloração do anticorpo CCR4 a 4 ° c até estar pronto para adicionar às amostras. Descarte o coquetel de anticorpos após 1 semana se não for usado.
  8. Prepare o Fixative de estabilização 1x.
    1. Adicionar 10 mL de água destilada desionizada a 5 mL de concentrado fixativo de estabilização 3x

2. preparação de camundongos BALB/c com deficiência de alérgeno

Nota: Camundongos BALB/c machos e fêmeas foram comprados no Rio Charles (UNMC) ou Jackson Laboratories (Universidade de Utah) às 6 a 8 semanas de idade.

  1. Após a aclimatação (1 semana), sensibilize todos os animais para OVA.
    1. Combine 100 μg/mL de OVA adsorto a hidróxido de alumínio (20 mg/mL) num tubo de poliestireno de 5 mL.
    2. Misture o tubo e extraia imediatamente 500 μL da suspensão de OVA-alum numa seringa de 1 mL, 28 G (seringa de insulina).
    3. Coloque um rato num jarro de sino contendo isoflurano (1 – 2 mL um piso falso, para que o animal não esteja parado directamente no isoflurano). Permitir que o mouse para ir anestesia por aproximadamente 1-2 min, ou até que a taxa de respiração cai.
    4. Rapidamente pegar o mouse pela pele nas costas e ombros e injetar 100 μl de ova-alum via intraperitoneal por mouse21,22.
    5. Coloc o rato para trás em sua gaiola e preste atenção para certificar-se que recuperam a mobilidade; Isto deve ocorrer dentro de 2 – 5 min.
  2. Sete dias após a sensibilização, sujeitar todos os animais à intranasal (i.n.) 1,5% OVA diluída em soro fisiológico estéril em câmara de nebulização (data Sciences International) por 20 min.
    1. Retire os camundongos de suas gaiolas e coloque-os na câmara de nebulização animal. Feche a tampa da câmara.
    2. Prenda a mangueira de nebulização ao bico de entrada na câmara de nebulização.
    3. Adicionar 30 mL de 1,5% de óvulos diluídos em soro fisiológico estéril no copo de nebulização no nebulizador.
    4. Gire sobre o nebulizador e permita que a câmara encha com a névoa por 20 minutos.
    5. Desligue o nebulizador e deixe a névoa assentar.
    6. Devolva os animais para suas gaiolas.
  3. Repita o passo 2,2 para um total de 5 vezes, em 5 dias consecutivos, para induzir a inflamação alérgica.

3. isolamento de células T CD4+ de baços e pulmões de camundongos desafiados por óvulos

  1. Humanamente eutanizar todos os animais machos e fêmeas tratados com OVA por asfixia de CO2 de acordo com protocolos iacuc aprovados, utilizando 2 a 3 animais por grupo, por experimento.
  2. Os pulmões e os baços do imposto de consumo dos animais e colocam tecidos em tubos separados da dissociação baseados no tipo e no sexo do tecido do animal23.
  3. Dissociar o tecido pulmonar em 500 μL de meios de dissociação pulmonar (25 U/mL; Collagenase, tipo 1) no Dissociador de tecidos automatizado utilizando o protocolo ' pulmão '.
    1. Repita 3,2 e 3,3 um total de duas vezes.
  4. Dissociar o tecido do baço em 500 μL de meios completos de RPMI usando o protocolo do ' Spleen ' no dissociator automatizado do tecido.
    Nota: As etapas restantes devem ser executadas em um armário biológico da segurança usando a técnica estéril.
  5. Enxague os tubos de dissociação contendo homogeneatos de pulmão e baço com 5 mL de meios adicionais de dissociação pulmonar ou RPMI completo, respectivamente.
  6. Filtre suspensões de células através de um filtro de células de 40 μm e colete em tubos cônicos de 50 mL.
  7. Incubar homogeneatos pulmonares por 15 – 30 min em uma incubadora de 37 ° c com 5% de CO2 para dissociar ainda mais o tecido pulmonar.
  8. Adicione 5 mL de RPMI completo aos homogeneatos de pulmão e baço e pellet as células na parte inferior dos tubos de 50 mL usando a centrifugação; 378 x g à temperatura ambiente (RT) durante 5 min.
  9. Combine esplenócitos e pilhas do pulmão em um único tubo cônico de 50 ml e determine contagens totais da pilha usando o contador automatizado da pilha.
  10. Ajuste as suspensões de células masculinas e femininas para 1 x 108 células/ml no tampão de separação e adicione a um tubo de poliestireno de 5 ml.
    Nota: O protocolo de enriquecimento pode ser ajustado até 14 mL de tubos de poliestireno quando mais células são adquiridas do baço e pulmões. Este protocolo foi projetado para os tecidos de 2 – 3 camundongos por grupo; Portanto, um tubo de 5 mL deve ser suficiente.
  11. Use aproximadamente dois terços das células totais para o isolamento ILC2 de acordo com o protocolo de enriquecimento ILC2.
    1. Adicionar um cocktail de anticorpos (50 μL/mL) à suspensão celular e incubar durante 5 min em RT.
    2. Vortex esferas rápidas para 30 s e adicionar à amostra a uma taxa de 75 μL/mL de suspensão celular. Misture suavemente e incubar por 5 min em RT.
    3. Top o tubo até 3 mL de volume total com buffer de separação e coloque no ímã de separação fácil de 8 câmaras. Incubar por 3 min em RT.
    4. Derrube o ímã para a frente (longe dos complexos da esfera-anticorpo-pilha aderiram à parte traseira do tubo) e da pipeta fora da suspensão da pilha em um tubo limpo de 5 mL.
    5. Adicionar 1,5 mL de RPMI completo aos tubos e centrifugar a 378 x g durante 5 min em RT.
    6. Despeje a mídia do pellet celular e ressuscite o ILC2 em 1 x 107 células por ml.
    7. Coloc 100 uL do macho e da fêmea ILC2 por bem em um U-parte inferior, placa de 96 poços e adicione 100 μL de meios de expansão ILC2 a cada poço.
    8. Incubar as células por 4 – 5 dias para expandir o ILC2.
    9. Colete o ILC2 em um tubo de 5 mL e adicione até 4,5 mL de RPMI sem soro. Centrifugue as células a 378 x g durante 5 min em RT.
    10. Células de contagem usando um hemacitômetro e ressuscitem em 1 x 107 ILC2 por ml em RPMI soro-livre.
  12. Use as células restantes para o procedimento de isolamento de células t CD4+ , que é conduzido de acordo com o protocolo de isolamento de células t CD4+ mouse com poucas modificações.
    1. Adicione soro de rato (50 μL/mL) à suspensão de enriquecimento de células T CD4.
    2. Adicionar cocktail de isolamento (50 μL/mL) à amostra e incubar durante 10 min na RT.
    3. Vortex esferas rápidas para 30 s e adicionar à amostra a uma taxa de 75 μL/mL.
    4. Misture suavemente a suspensão celular e incubar para 2,5 min e RT
    5. Top as amostras até 3 mL e coloque os tubos de 5 mL no ímã de separação fácil de 8 câmaras e incubar por 5 min em RT.
    6. Derrube o íman para a frente e pipetar a suspensão da célula para um tubo de 5 mL limpo.
    7. Adicionar 1,5 mL de RPMI sem soro aos tubos e centrifugar a 378 x g durante 5 min em RT.
    8. Derrame fora os meios da pelota da pilha e ressuscite as pilhas de T CD4+ em 1 x 107 pilhas por o ml no RPMI soro-livre.

4. Determine CCR4 expressão em células T CD4+ e grupo 2 células linfóides INATAS (ILC2) de animais desafiados por óvulos por citometria de fluxo

Nota: As seguintes etapas podem ser executadas em uma parte superior de banco aberta porque são técnicas não-estéreis.

  1. Adquira aproximadamente 1 – 2,5 x 105 ILC2 células da etapa 3.11.10 e 1 – 2,5 x 106 células T CD4+ da etapa 3.12.8 em tubos separados de 5 ml.
    1. Mantenha um tubo adicional de pelo menos 5,0 x 104 células T CD4 + como um controle não manchado.
  2. Suspenda as células em 100 – 200 μL de tampão FACS e adicione 1 μL de bloco FC a cada tubo, em seguida, incubar no gelo (ou em um refrigerador de 4 ° c) por 10 min.
  3. Adicionar 1 – 2 mL de FACS buffer a cada tubo e centrifugar a 378 x g durante 5 min em RT.
  4. Despeje o sobrenadante e ressuscita as células em 100 – 200 μL de tampão FACS.
  5. Adicionar 37,5 μL do cocktail de coloração do anticorpo CCR4 à suspensão da célula em cada tubo, excepto o tubo que contém as células "não manchadas".
  6. Incubar os tubos no gelo, ou em um refrigerador de 4 ° c, por 20 – 30 min.
  7. Adicionar 1 – 2 mL de FACS buffer a cada tubo e centrifugar a 378 x g durante 5 min em RT.
  8. Despeje o sobrenadante.
  9. Repita as etapas 4,7 e 4,8.
  10. Adicione 250 – 300 μL de fixador estabilizante 1x (ver tabela de materiais) a cada tubo.
  11. Prepare controles de talão de cor única para cada anticorpo no coquetel de anticorpos CCR4 de acordo com o protocolo fornecido com as contas de compensação.
    1. Vortex os grânulos de compensação.
    2. Adicione uma gota das contas a cada tubo de controle de cor única.
    3. Adicione 1 μL de cada anticorpo no cocktail de anticorpo CCR4 ao seu próprio tubo rotulado.
    4. Misture suavemente e incubar por 10 min em um refrigerador de 4 ° c ou no gelo.
    5. Adicionar 1 – 2 mL de FACS buffer a todos os tubos e centrifugar a 378 x g durante 5 min em RT.
    6. Despeje o sobrenadante e ressuscita as contas em 200 μL de tampão FACS.
    7. Leve à geladeira os controles de cor única até que todas as amostras sejam manchadas e prontas para serem analisadas no citometro de fluxo.
  12. Analise as células não manchadas, controles de cor única e as amostras experimentais no citometro de fluxo dentro de 24 h de fixação.

5. procedimento de transmigração ex vivo

Nota: As seguintes etapas devem ser executadas em um armário de segurança biológico, porque exigem a técnica estéril.

  1. Adquira o ILC2 da etapa 3.11.10 e das células T CD4 da etapa 3.12.8 e determine o número de inserções do transwell necessárias para o experimento.
    Nota: Exemplo: para 1,2 mL de células T CD4 enriquecidas a partir do passo 3.12.8, multiplicar 1,2 x 1.000 μL = 1.200 μL; em seguida, divida 1.200 uL por 100 μL = 12, o número de pastilhas necessárias para a transmigração CD4 T.
  2. Mova delicadamente as inserções do transwell de 3 μm das fileiras médias de uma placa de 24 poços.
  3. Adicionar 500 μL de meios de migração com CCL17 a aproximadamente um terço dos poços.
  4. Adicionar 500 μL de meios de migração com CCL22 para outro um terço dos poços.
  5. Adicionar 500 μL de RPMI sem soro contendo nenhuma quimiocina ao último terço dos poços.
  6. Rotule claramente a tampa na placa com a mídia de transmigração apropriada colocada nos poços inferiores.
  7. Coloc as inserções do transwell de volta nos poços que contêm os vários tratamentos.
  8. Adicione suavemente 100 μL de células T CD4 ou ILC2 ao poço superior de cada pastilha. Não misture ou Pipetar a suspensão da célula para cima e para baixo nas transpoços, pois isso pode confundir os resultados do experimento.
  9. Etiquetar claramente a tampa da placa com o tipo de célula colocado em cada poço e escrever a data ea hora do dia em que as células foram adicionadas.
  10. Repita as etapas 5,2 a 5,9 até que todas as células tenham sido colocadas em inserções de transpoços com mídia.
  11. Coloc delicadamente a placa em uma incubadora de 37 ° c com 5% CO2 para 48 h. Minimize o contato com a placa durante o período de incubação.

6. quantificação da transmigração ex vivo

  1. Remova delicadamente a placa da incubadora e remova todas as inserções do transwell das fileiras médias nos poços vazios apenas acima ou abaixo.
  2. Colete as células dos poços inferior e superior das inserções do transwell em tubos rotulados com TOP ou BOTTOM, com CCL17, CCL22 ou mídia, com o tipo de célula, e com o número replicado (pelo menos 3 repetições por experimento).
  3. Enxague os poços inferiores com 500 μL de 1X PBS e recolha esta enxaguadura no tubo correspondente.
  4. Enxague os poços superiores com 250 μL de 1X PBS e recolha esta enxaguadura no tubo correspondente.
  5. Pellet as células por centrifugação em 378 x g por 5 min em RT.
  6. Gentilmente pipeta fora todo o sobrenadante da pelota da pilha.
  7. Resuspender as células T e ILC2 em 50 μL de 1X PBS.
  8. Tome 10 μL das suspensões celulares e adicione a 90 μL de 0,4% de azul de Tripan.
  9. Conte as células no contador de células automatizado.
    1. Registro% de viabilidade.
    2. Registre a contagem de células por mL para cada amostra.
    3. Determine o número total de células por tratamento na parte superior e na câmara inferior; gravar as contagens de células.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Resultados

Expressão CCR4 em células T CD4 + e ILC2.

Para o sucesso do experimento de transmigração ex vivo, é imperativo determinar se os linfócitos são responsivos a CCL17 e CCL22 a CCR4; Conseqüentemente, nós determinamos a expressão CCR4 em pilhas de T CD4+ e ILC2 pela citometria do fluxo. Embora seja bem sabido que as células T do ajudante CD4+ específicas de ova expressam CCR4, menos é conhecida da expressão de CCR4 em ILC2. A Figura 1

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Discussão

Nisto, nós apresentamos um método bem estabelecido para avaliar a migração chemokine-induzida dos linfócitos em um sistema ex vivo da transmigração. Existem várias etapas críticas no protocolo, sendo que a primeira é verificar a expressão do receptor de quimiocina correto nas células imunes no experimento. Em nossas mãos, nós escolhemos CCR4 por causa do corpo da literatura que destaca a importância de CCR4 em células T do ajudante Th2 na inflamação alérgica. A inflamação induzida por ovalbumina foi mostrada previamente ...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Divulgações

Os autores não têm divulgações financeiras ou conflitos de interesse para divulgar.

Agradecimentos

Este trabalho foi financiado pela American Lung Association (K.J.W.), o Memorial Eugene Kenney fundo concedido a T.A.W. e K.J.W., generoso apoio start-up da Universidade de Utah para K.J.W., e um departamento de assuntos veteranos prêmio de T.A.W. (VA I01BX0003635). T.A.W. é o destinatário de um prêmio de cientista de carreira de pesquisa (IK6 BX003781) do departamento de assuntos de veteranos. Os autores desejam reconhecer a assistência editorial da Sra. Lisa Chudomelka. Os autores agradecem o núcleo de citometria de fluxo da UNMC por seu apoio na coleta dos dados de citometria de fluxo gerados para este manuscrito.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
0,4% Trypan BlueSigma-Aldrich15250061
seringa de 1 mLSeringas BD Bioscience329424U-100 Micro-Fine 28 G 1/2" 1cc
100x Penicilina-Estreptomicina, L-GlutaminaGibco10378-016Diluir para 1x em meio RPMI
Tubos cônicos de 15 mLOlympus Plastics28-101tubos de polipropileno
3 μ m insertos de transwellGenesee Scientific25-288Placa de 24 poços contendo 12 insertos de transwell
3x fixador estabilizadorBD Pharmigen338036Prepare 1x solução de acordo com o protocolo do fabricante
Tubos de poliestireno de 5 mLSTEM Cell Technologies38007
Tubos cônicos de 50 mLOlympus Plastics28-106tubos
de polipropilenoÍmã de fácil separação de 8 câmarasSTEM Cell Technologies18103
ACK Lysing BufferLife Technologies CorporationA1049201
Filtro de célula avançado, 40 μ mGenesee Scientific25-375malha de nylon, 40 μ m filtros
Hidróxido de alumínio, grau reagenteSigma-Aldrich239186-25G20 mg/mL
anti-mouse CCR4; Biolegend1312110,5 μ g/teste
anti-mouse CD11bBD Pharmigen5573960,5 μ g/teste
anti-mouse CD11c; PE eFluor 610Thermo-Fischer Scientific61-0114-820.25 μ g/teste
anti-mouse CD16/32, bloco FcBD Pharmigen5531410.5 μ g/teste
anti-camundongo CD19; APC-eFluor 780 conjugadoThermo-Fischer Scientific47-0193-820.5 μ g/teste
anti-camundongo CD3; PE Cy 7-conjugadoBD Pharmigen5527740,25 μ g/teste
anti-camundongo CD45; BD conjugado PEPharmigen560870,5 μ g/test
anti-mouse ICOS (CD278)BD Pharmigen5640700.5 μ g/teste
anti-mouse NK1.1 (CD161); BD Pharmigen5531640,25 μ g/teste
anti-mouse ST2 (IL-33R); PerCP Cy5.5 conjugadoBiolegend1453110.5 μ g/test
Contador Automatizado de CélulasBIORAD1450102
Dissociador AutomatizadoMACS Miltenyi Biotec130-093-235
Albumina de Soro Bovino, Pó LiofilizadoSigma-AldrichA2153-10G0,5% em RPMI sem soro
Contador de CélulasBIORAD1450015
Ovalbumina de Ovo de Galinha, Grau VSigma-AldrichA5503-10G500 μ g/mL
de colagenase, tipo 1, filtradoWorthington Biochemical CorporationCLSS-1, compre como frascos de 5 X 50 mg (LS004216)25 U/mL em contas
de compensaçãoAffymetrix01-1111-411 gota por tubo de controle
Tubos de DissociaçãoMACS Miltenyi Biotec130-096-335
FACS BufferBD Pharmigen5546571x PBS + 2% FBS, c/ azida sódica; armazenado a 4 ° C
Calor Inativado-FBSGenesee Scientific25-525H10% em RPMI completo & Mídia de expansão ILC2
Mouse CCL17GenScriptZ02954-2050 ng/mL
Mouse CCL22GenScriptZ02856-2050 ng/mL
Mouse CD4+ Kit de enriquecimento de células TSTEM Cell Technologies19852
Mouse IL-2GenScriptZ02764-2020 ng/mL
Mouse Kit de enriquecimento ILC2STEM Cell Technologies19842
Mouse recombinante IL-33STEM Cell Technologies7804420 ng/mL
RPMILife Technologies Corporation22400071
Buffer de SeparaçãoSTEM Cell Technologies201441x PBS + 2% FBS; armazenado a 4 ° C
Nebulizador e câmara para pequenos animaisData Sciences International
Solução salina estérilBaxter2F7124; NDC 0338-0048-040,9% de cloreto de sódio
conjugado com APC conjugado com FITC RPMI

Referências

  1. Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. The Journal of Experimental Medicine. 115, 453-466 (1962).
  2. Moser, B. Editorial: History of Chemoattractant Research. Frontiers in Immunology. 6, 548(2015).
  3. Borroni, E. M., Savino, B., Bonecchi, R., Locati, M. Chemokines sound the alarmin: The role of atypical chemokine in inflammation and cancer. Seminars in Immunology. 38, 63-71 (2018).
  4. Charo, I. F., Ransohoff, R. M. The many roles of chemokines and chemokine receptors in inflammation. The New England Journal of Medicine. 354 (6), 610-621 (2006).
  5. Abboud, D., Hanson, J. Chemokine neutralization as an innovative therapeutic strategy for atopic dermatitis. Drug Discovery Today. 22 (4), 702-711 (2017).
  6. Aldinucci, D., Casagrande, N. Inhibition of the CCL5/CCR5 Axis against the Progression of Gastric Cancer. International Journal of Molecular Sciences. 19 (5), E1477(2018).
  7. Chonco, L., et al. Novel DNA Aptamers Against CCL21 Protein: Characterization and Biomedical Applications for Targeted Drug Delivery to T Cell-Rich Zones. Nucleic Acid Therapy. 28 (4), 242-251 (2018).
  8. Trivedi, P. J., Adams, D. H. Chemokines and Chemokine Receptors as Therapeutic Targets in Inflammatory Bowel Disease; Pitfalls and Promise. Journal of Crohn's and Colitis. 12 (12), 1508(2018).
  9. Pietrosimone, K. M., Bhandari, S., Lemieux, M. G., Knecht, D. A., Lynes, M. A. In vitro assays of chemotaxis as a window into mechanisms of toxicant-induced immunomodulation. Current Protocols in Toxicology. 58 (Unit 18.17), (2013).
  10. Davis, D. M. How studying the immune system leads us to new medicines. Lancet. 391 (10136), 2205-2206 (2018).
  11. Culley, F. J., Pennycook, A. M., Tregoning, J. S., Hussell, T., Openshaw, P. J. Differential chemokine expression following respiratory virus infection reflects Th1- or Th2-biased immunopathology. Journal of Virology. 80 (9), 4521-4527 (2006).
  12. Denney, H., Clench, M. R., Woodroofe, M. N. Cleavage of chemokines CCL2 and CXCL10 by matrix metalloproteinases-2 and -9: implications for chemotaxis. Biochemical and Biophysics Research Communications. 382 (2), 341-347 (2009).
  13. Burrell, B. E., et al. Lymph Node Stromal Fiber ER-TR7 Modulates CD4+ T Cell Lymph Node Trafficking and Transplant Tolerance. Transplantation. 99 (6), 1119-1125 (2015).
  14. Warren, K. J., Iwami, D., Harris, D. G., Bromberg, J. S., Burrell, B. E. Laminins affect T cell trafficking and allograft fate. The Journal of Clinical Investigation. 124 (5), 2204-2218 (2014).
  15. Hirata, H., et al. Th2 cell differentiation from naive CD4(+) T cells is enhanced by autocrine CC chemokines in atopic diseases. Clinical and Experimental Allergy: Journal of the British Society for Allergy and Clinical Immunology. , (2018).
  16. Lin, R., Choi, Y. H., Zidar, D. A., Walker, J. K. L. beta-Arrestin-2-Dependent Signaling Promotes CCR4-mediated Chemotaxis of Murine T-Helper Type 2 Cells. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 58 (6), 745-755 (2018).
  17. Zhang, Y., et al. A new antagonist for CCR4 attenuates allergic lung inflammation in a mouse model of asthma. Science Reports. 7 (1), 15038(2017).
  18. Lu, Y., et al. Dynamics of helper CD4 T cells during acute and stable allergic asthma. Mucosal Immunology. 11 (6), 1640-1652 (2018).
  19. Li, B. W. S., Beerens, D., Brem, M. D., Hendriks, R. W. Characterization of Group 2 Innate Lymphoid Cells in Allergic Airway Inflammation Models in the Mouse. Methods in Molecular Biology. 1559, 169-183 (2017).
  20. Li, B. W. S., et al. Group 2 Innate Lymphoid Cells Exhibit a Dynamic Phenotype in Allergic Airway Inflammation. Frontiers in Immunology. 8, 1684(2017).
  21. Warren, K. J., et al. Sex differences in activation of lung-related type-2 innate lymphoid cells in experimental asthma. Annals of Allergy, Asthma, Immunology: Official Publication of the American College of Allergy, Asthma, Immunology. , (2016).
  22. Warren, K. J., et al. Ovalbumin-sensitized mice have altered airway inflammation to agriculture organic dust. Respiratory Research. 20 (1), 51(2019).
  23. Poole, J. A., et al. alphabeta T cells and a mixed Th1/Th17 response are important in organic dust-induced airway disease. Annals of Allergy, Asthma, Immunology: Official Publication of the American College of Allergy, Asthma, Immunology. 109 (4), 266-273 (2012).
  24. Matsuo, K., et al. A CCR4 antagonist ameliorates atopic dermatitis-like skin lesions induced by dibutyl phthalate and a hydrogel patch containing ovalbumin. Biomedical Pharmacotherapy. 109, 1437-1444 (2019).
  25. Mikhak, Z., et al. Contribution of CCR4 and CCR8 to antigen-specific T(H)2 cell trafficking in allergic pulmonary inflammation. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 123 (1), 67-73 (2009).
  26. Monticelli, L. A., et al. Innate lymphoid cells promote lung-tissue homeostasis after infection with influenza virus. Nature Immunology. 12 (11), 1045-1054 (2011).
  27. Saenz, S. A., et al. IL25 elicits a multipotent progenitor cell population that promotes T(H)2 cytokine responses. Nature. 464 (7293), 1362-1366 (2010).
  28. Hoyler, T., et al. The transcription factor GATA-3 controls cell fate and maintenance of type 2 innate lymphoid cells. Immunity. 37 (4), 634-648 (2012).
  29. Nakajima, H., Shores, E. W., Noguchi, M., Leonard, W. J. The common cytokine receptor gamma chain plays an essential role in regulating lymphoid homeostasis. The Journal of Experimental Medicine. 185 (2), 189-195 (1997).
  30. Warren, K. J., et al. RSV-specific anti-viral immunity is disrupted by chronic ethanol consumption. Alcohol. , (2016).
  31. Warren, K. J., Poole, J. A., Sweeter, J. M., DeVasure, J. M., Wyatt, T. A. An association between MMP-9 and impaired T cell migration in ethanol-fed BALB/c mice infected with Respiratory Syncytial Virus-2A. Alcohol. , (2018).
  32. Molteni, R., et al. A novel device to concurrently assess leukocyte extravasation and interstitial migration within a defined 3D environment. Lab on a Chip. 15 (1), 195-207 (2015).
  33. Bersini, S., et al. Human in vitro 3D co-culture model to engineer vascularized bone-mimicking tissues combining computational tools and statistical experimental approach. Biomaterials. 76, 157-172 (2016).
  34. Jeon, J. S., et al. Human 3D vascularized organotypic microfluidic assays to study breast cancer cell extravasation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (1), 214-219 (2015).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Reimpressões e permissões

Etiquetas

Gradiente de QuimiocinasExpressão de CCR4Isolamento de ILC2Célula T CD4Ensaio TranswellCitometria de FluxoViabilidade CelularTriagem de Quimiocinas
Avaliação da migração do linfócito em um sistema de transmigração ex vivo
Fale conosco
Recomendar à biblioteca

Privacidade

Termos de Uso

Políticas

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Todos os direitos reservados.