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Artigo de método

Purificação do S100A12 humano e seus Oligomers íon-induzidos para a estimulação imune da pilha

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DOI:

10.3791/60065

⸱

29 de setembro de 2019

 ,  , 
1Department of Pediatric Rheumatology and Immunology, University Children's Hospital

Neste artigo

Resumo

Este protocolo descreve um método da purificação para a proteína obrigatória tag-livre de recombinação do cálcio S100A12 e seus oligômeros íon-induzidos para ensaios humanos da estimulação do monocyte.

Resumo

Neste protocolo, nós descrevemos um método para purificar a proteína cálcio-obrigatória humana S100A12 e seus oligômeros íon-induzidos da cultura de Escherichia coli para estimulações imunes da pilha. Este protocolo baseia-se em uma estratégia de cromatografia em duas etapas, que compreende a pré-purificação de proteínas em uma coluna de cromatografia de troca de ânions e uma etapa de polimento subsequente em uma coluna de interação hidrofóbica. Esta estratégia produz S100A12 proteína de alta pureza e rendimento a custos gerenciáveis. Para ensaios funcionais em células imunes eventual contaminação de endotoxina remanescente requer monitoramento cuidadoso e mais etapas de limpeza para obter proteína livre de endotoxina. A maioria das contaminações da endotoxina pode ser excluída por cromatografia de troca de ânions. Para esgotar contaminações residuais, este protocolo descreve uma etapa da remoção com filtros centrífugos. Dependendo do íon-força disponível S100A12 pode arranjar em homomultimers diferentes. Para investigar o relacionamento entre a estrutura e a função, este protocolo descreve mais mais o íon-tratamento da proteína S100A12 seguida pelo reticulação químico para estabilizar S100A12 oligômeros e sua separação subseqüente pelo tamanho-exclusão Cromatografia. Finalmente, nós descrevemos um ensaio Cell-Based que confirme a atividade biológica da proteína purified e confirme a preparação LPS-livre.

Introdução

S100A12 é uma proteína de ligação de cálcio que é predominantemente produzida por granulócitos humanos. A proteína é superexpressa durante a inflamação (sistêmica) e seus níveis séricos, particularmente em (auto) doenças inflamatórias como a artrite idiopática juvenil sistêmica (Aijs), a febre familiar do Mediterrâneo (FMF) ou a doença de Kawasaki (KD) pode informar sobre atividade da doença e resposta à terapêutica. Dependendo dos receptores de reconhecimento de padrão (PRRs), como os receptores Toll-like (TLRs), o sistema imunológico inato pode ser ativado por padrões moleculares associados a patógenos (PAMPs), como lipopolissacarídeos (LPS) ou danos associados a padrões moleculares (DAMPs; também denominado ' alarmins '). Os DAMPs são moléculas endógenas, como proteínas celulares, lipídios ou ácidos nucleicos1. As funções húmidas são bem descritas para os membros da família de proteínas calgranulina, S100A8/A9 e S100A122, quetambém são relatados para operar como peptídeos antimicrobianos de quelaçãode íonsmetálicos divalentes3,4, 5,6. Dependendo da força disponível do íon S100A12 lata, como outros membros da família S100, arranja em homomultimers diferentes e até recentemente o impacto de S100A12-oligomerisation no PRR-interação, particular TLR4, era desconhecido.

A forma monomérica da proteína (92 aminoácidos, 10,2 kDa) consiste em duas estruturas de hélice-loop-hélice da EF-mão conectadas por um vinculador flexível. O C-Terminal EF-Hand contem o clássico CA2 +-o motivo obrigatório visto que o N-Terminal EF-Hand exibe uma estrutura prolongada proteína-específica do laço S100 (' pseudo-EF-mão ') e revela a afinidade reduzida de CA2 +-. CA2 +-a ligação por S100A12 pode induzir uma mudança conformacional principal no C-Terminus das proteínas, que conduz à exposição de um remendo hydrofóbico em cada monómero e dá forma à relação do dimerização. Assim, condições fisiológicas, a menor estrutura quaternária formada por S100A12 é um dímero não covalente (aproximadamente 21 kDa), no qual os monómeros individuais estão em orientação antiparalela. Quando arranjado como dímero, S100A12 é relatado para seqüestro Zn2 + , bem como outros íons metálicos divalentes, por exemplo,2 + com alta afinidade7. Estes íons são coordenados na interface de dímero S100A12 por aminoácidos h15 e D25 de uma subunidade e H85, bem como H89 da antiparalelante outra subunidade8,9,10. Enquanto estudos anteriores propõem que Zn2 +-carregado S100A12 pode induzir a organização da proteína em Homo-tetramers (44 kDa) e para resultar em aumento CA2 +-afinidade11,12, recente titulação de metal estudos6 sugerem CA2 +-ligação por S100A12 para aumentar a afinidade da proteína para Zn2 +. Uma vez que os S100A12 EF-hands são ocupados inteiramente por CA2 +, o CA adicional2 + é pensado para ligar entre dímeros, provocando a formação do hexamer (aproximadamente 63 kDa). A arquitetura da estrutura quarternary forma é claramente diferente daquela do tetramer. Propõe-se que a interface do tetrâmero é interrompida para dar origem a novas interfaces dímero-dímero que beneficia a formação de hexamer10. S100A12 é quase exclusivamente expresso por granulócitos humanos, onde constitui cerca de 5% de toda a proteína citosólica13. Em sua função úmida S100A12 foi historicamente descrita como agonista do receptor multiligante para produtos finais de glicação avançada (RAGE), então denominado proteína de ligação à raiva recém-identificada extracelular (EN-RAGE)14. Embora nós relatado mais cedo S100A12-ligação bioquímica a Rage e a TLR415, Nós demonstramos recentemente monócitos humanos para responder à estimulação S100A12 em uma maneira TLR4-dependente16. Isto exige o arranjo de S100A12 em seu ca2 +/Zn2 +-estrutura quarternary forma induzida16.

Aqui nós descrevemos um procedimento da purificação para o S100A12 humano de recombinação e seus oligômeros íon-induzidos para estimulações imunes da pilha16,17. Isso se baseia em uma estratégia de cromatografia em duas etapas, que inicialmente inclui uma coluna de troca de ânions para isolar e concentrar a proteína e remover contaminações em massa (por exemplo, endotoxinas/lipopolissacarídeos)18. Resinas de cromatografia de troca iónica separam proteínas com base em diferentes encargos de superfície líquida. Para proteínas ácidas como S100A12 (ponto isoelétrico de 5,81), um sistema tampão com um pH de 8,5 e uma resina de troca aniónica forte leva a uma boa separação. As proteínas ligadas foram eluidas com um gradiente de tampão de alto sal. Com um aumento de íons negativos de força iônica no tampão de eluição competir com proteínas para cargas na superfície da resina. Proteínas individualmente eluir dependendo de sua carga líquida e em conseqüência disso, os bufferes descritos nisto permitem isolar e concentrar a proteína S100A12 overexpressada. Devido a grupos carregados negativamente em lipopolissacarídeos, essas moléculas também se ligam a resinas de troca de ânions. Entretanto, sua carga líquida mais elevada conduz à eluição mais atrasada no inclinação elevado-sal aplicado. A segunda etapa do procedimento de purificação foi introduzida para fins de polimento. Isto faz uso da capacidade de ligação de cálcio de S100A12 e remove as impurezas remanescentes em uma coluna de interação hidrofóbica. O emperramento do cálcio de S100A12 conduz a uma mudança conformacional e a uma exposição de remendos hydrofóbicos na superfície da proteína. Nessa condição, S100A12 interage com a superfície hidrofóbica da resina. Em cima do cálcio-quelante pelo EDTA, esta interação é invertida. Na presença de íons, especialmente cálcio e zinco, S100A12 organiza em oligomers condição. Para estudar relações estrutura-função dos oligomers diferentes, nós estabilizamos o dimeric, tetramérica e o S100A12 de recombinação forma com um chapéu cabeado químico e separamos os complexos em uma coluna da cromatografia do tamanho-exclusão. Finalmente, para analisar a funcionalidade e a atividade biológica da proteína purificada e seus oligomers íon-induzidos, a liberação do citocinas de S100A12 e de LPs estimulou o monocyte pode ser comparada.

Os vários métodos para purificante S100A12 foram descritos até agora. Jackson et al.19, por exemplo, publicaram um protocolo com purificação por meio de uma coluna de troca de ânions e uma posterior cromatografia de exclusão de tamanho. O polimento de purificação em uma coluna de exclusão de tamanho leva a bons resultados, mas ― devido a, por exemplo, volumes de carregamento limitados ― é menos flexível na escalabilidade. Uma abordagem diferente, publicada por Kiss et al.20, descreve a purificação da proteína etiquetada via coluna Ni2 + Affinity como a primeira etapa de purificação, seguida de clivagem enzimática para remover a tag e outras etapas de purificação. Em contraste com os estudos aforecited19,20, aproteína produzida como descrito neste protocolo é determinada para experiências em pilhas imunes. Conseqüentemente, a contaminação remanescente da endotoxina da cultura bacteriana é um desafio. Embora diferentes abordagens para a remoção da endotoxina tenham sido descritas até o momento, não há um método uniforme que funcione igualmente bem para qualquer solução protéica21,22.

Em resumo, nosso protocolo combina as vantagens de uma expressão tag-free em um sistema bacteriano com remoção eficiente da endotoxina e elevado rendimento da proteína pura.

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Protocolo

Nota: Por favor, consulte a tabela complementar 1 para preparação de buffers e soluções de estoque.

1. expressão protéica em E. coli

  1. Clonagem
    1. Clone tag-free Human S100A12 (seqüência de referência NCBI: NP_ 005612.1) em vetor de expressão bacteriana pET11b. Para expressar a proteína, transforme a construção em E. coli BL21 (de3).
  2. Cultura
    1. Prepare uma cultura inicial inoculando uma única colônia em 5 mL de meio de crescimento (caldo LB com 100 μg/mL de ampicilina) em um tubo de 14 mL de fundo redondo. Incubar durante a noite a 37 ° c com agitação em 220 rpm. Transfira 2 − 4 mL de cultura overnight para 400 mL de meio de crescimento num balão de 2 L Erlenmayer e incubar a cultura a 37 ° c com agitação a 220 rpm.
      Nota: A densidade inicial da cultura principal deve ser a densidade óptica em 600 nm (OD600) = 0,1.
    2. Monitore o OD600 durante o crescimento. Induzir a expressão protéica por adição de 1 M de isopropílico-ß-D-tiogalactopyranosid (IPTG) a uma concentração final de 1 mM em OD600 = 0,5 − 0,6. Incubar a 37 ° c e 220 rpm para 4 h adicionais.
      Nota: Geralmente, um OD600 de 0,6 será alcançado após 1.5 − 2.5 h em 37 ° c.
    3. Prepare 50 mL de tampão sonication dissolvendo 50 mM Tris, 50 mM NaCl e 1 mM de ácido etilenodiamina tetraacético (EDTA) em 40 mL de água desionizada. Ajuste o pH com HCl para 8,0 e faça até 50 mL. Adicionar inibidor da protease (1 comprimido por 50 mL de solução) e equilibrar o tampão a 4 ° c.
    4. Transfira a cultura bacteriana em frascos apropriados do centrifugador e colha as pilhas em 3.200 x g por 30 minutos em 4 ° c. Descarte o sobrenadante e resuma a pelota em 25 mL de tampão de sonicação gelada. Doravante, mantenha as células no gelo.
      Nota: as células resguardadas podem ser armazenadas a-20 ° c para a curto prazo e a-80 ° c para longo prazo.
  3. Sonication/lise
    1. SONICATE as células para 6 ciclos de 30 s no gelo. Após cada ciclo, as células de repouso para 30 − 60 s para proteger as células do superaquecimento.
    2. Transfira a suspensão da célula para um tubo de centrifugação de alta velocidade pré-refrigerado 50 mL e Centrifugue num rotor de ângulo fixo a 15.000 x g durante 30 min a 4 ° c. Decantar o lisado limpo que contém as proteínas citosómicas solúveis em um tubo de 50 mL fresco e descartar a pelota.

2. purificação de proteínas

  1. Cromatografia de troca aniónica
    1. Diálise
      1. Prepare a cromatografia de troca aniónica (AIEX) tampão A dissolvendo 20 mM de Tris, 1 mM de EDTA e 1 mM de etileno glicol-bis (2-aminoetilether)-N, N, N ', n'-ácido tetraacético (EGTA) em água desionizada e ajuste o pH para 8,5 com HCl. Para A diálise Prepare 2 x 5 L e para cromatografia 2x 1 L de tampão AIEX A.
        Nota: O volume do dialisato deve estar em aproximadamente 100 vezes o volume de amostra. Todos os buffers utilizados para cromatografia devem ser filtrados (0,45 μm ou menor) e desgaseificados (por exemplo, por banho Ultrassônico ou vácuo degassing).
      2. Corte a tubulação da diálise (corte do peso molecular [MWCO]: 3,5 kDa) em um comprimento apropriado com espaço adicional para que o ar assegure a flutuabilidade da amostra acima da barra de giro do stir.
        Nota: O glicerol preserva a membrana e deve ser removido antes do uso.
      3. Para reduzir a viscosidade da solução proteica limpa a partir do passo 1.3.2, diluir a solução com 25 mL de tampão AIEX a para facilitar a aplicação subsequente à coluna de cromatografia. Prenda o primeiro fecho no tubo, coloque a amostra na membrana e prenda o segundo fecho pelo menos 1 cm da extremidade superior da tubagem.
      4. Coloque o recipiente de 5 L com o tampão AIEX a em uma placa de agitação, adicione uma barra de agitação e a membrana preenchida com solução proteica. Ajuste a velocidade para girar a amostra evitando interferências com a barra de agitação rotativa. Dialyze para 12 − 24 h em 4 ° c, a seguir substitua o amortecedor do dialisato (amortecedor a de AIex) por uma preparação pre-cooled fresca e continue por pelo menos 4 horas adicionais. Transfira a solução de proteína Dialítica para um tubo de 50 mL e filtre através de uma unidade de filtro de 0,45 μm.
        Nota: Armazenamento possível.
    2. Cromatografia
    3. Inicie o sistema de cromatografia líquida (FPLC) com manutenção geral, conecte os buffers de coluna AIEX A e AIEX B (AIEX buffer A com 1 M NaCl) e a resina de troca de ânions contendo coluna. Consulte a tabela 1 para obter parâmetros cromatográficos gerais.
      Nota: os buffers, a coluna e o equipamento FPLC devem ser equilibrados com a mesma temperatura antes de iniciar a corrida (consultar os parâmetros cromatográficos na tabela 1, tabela 2, tabela 3, tabela 4e tabela 5).
    4. Equilibrar a coluna com o tampão AIex a, depois carregar a amostra na coluna e eluir as proteínas com um gradiente linear de 0% a 100% tampão de sal alto (AIex B). Consulte a tabela 2 para obter um protocolo de método detalhado.
    5. Colete 2 mL de frações durante a eluição e analise 10 μL de cada fração em uma eletroforese de gel de poliacrilamida de sódio de 15% com coloração Coomassie (SDS-PAGE). Pool as frações contendo proteína S100A12 para diálise.
      Nota: O peso molecular de S100A12 é 10.575 da.
  2. Cromatografia de interação hidrofóbica dependente de cálcio (HIC)
    1. Diálise
      1. Dialyze a solução da proteína de encontro a 20 milímetros Tris, 140 milímetro NaCl, pH 7,5 que segue o procedimento descrito na seção 2.1.1.
    2. Cromatografia
      1. Prepare 1 L de tampão de cromatografia HIC A dissolvendo 20 mM Tris, 140 mM NaCl e 25 mM CaCl2 em água deionizada e ajuste o pH para 7,5. Para HIC tampão B, dissolver 20 mM Tris, 140 mM NaCl e 50 mM EDTA. Ajuste o pH para 7,0 e filtre e Degas os buffers. Adicionar CaCl2 à amostra a uma concentração final de 25 mm e filtrar por 0,45 μm. equilibram os amortecedores HIC e a amostra a 4 ° c (temperatura da coluna).
      2. Inicie o sistema de cromatografia líquida com manutenção geral, conecte os buffers de coluna HIC A e B e a coluna. Consulte a tabela 3 para obter mais parâmetros cromatográficos.
      3. Equilibrar a coluna, carregar a amostra e estender o bloco ' lavar amostra não acoplada ' até que o sinal UV atinja o nível basal novamente. Comece então a eluição com um quelante do cálcio que contem o amortecedor (EDTA). Consulte a tabela 4 para obter um protocolo de método detalhado.
        Nota: As experiências precedentes mostraram que um excesso do cálcio parece ser benéfico para a ligação de S100A12 à resina da cromatografia.
      4. Colete frações de pico de 2 mL e analise 10 μL de cada fração em uma página de SDS 15% Coomassie manchada. Piscina pura S100A12 frações e Dialize contra HEPES-tampão salino (HBS; 20 mm HEPES, 140 mm NaCl, pH 7,0) como descrito na secção 2.1.1.
        Nota: o coeficiente de extinção da S100A12 monomérica é 2980 M-1 cm-1.

3. detecção e remoção de endotoxina

  1. Detecção de endotoxina
    1. Para determinar a contaminação da endotoxina, medir as concentrações de proteínas diluídas a partir do passo 2.2.2.4. (por exemplo, 1:10 e 1:100 em HBS) usando um ensaio de detecção de endotoxina fluorescente (tabela de materiais) com base em ensaio IMUNOENZIMÁTICO (ELISA). Realize este ensaio seguindo o protocolo do fabricante.
      Nota: Use soluções HBS recém-preparadas dissolvidas em água desionizada ultrapura para evitar (nova) contaminação por endotoxina pelo tampão.
  2. Remoção de endotoxina e concentração de proteínas
    1. Carregar 15 mL de amostra em uma unidade de filtro centrífugo 50 kDa e centrifugar a 3.200 x g e 10 ° c por aproximadamente 10 min. Transfira o fluxo-através em uma embarcação fresca (no gelo) e reabasteça e Centrifugue o tubo do filtro de 50 kda tão frequentemente como necessário. Lave a membrana do filtro duas vezes com HBS para recuperar o máximo de proteína possível após cada passo.
    2. Concentre o fluxo de contenção de S100A12 usando um filtro centrífugo de 3 kDa até que o volume seja reduzido para um quinto até um décimo do volume de carregamento inicial (centrifugação a 3.200 x g, 10 ° c por aproximadamente 30 min). Encha o filtro sempre que necessário, enxague a membrana e transfira a solução concentrada para um novo tubo após cada recarga. Descarte o fluxo. Filtrar novamente através 50 kDa como descrito acima.
      Nota: Durante este procedimento, a perda de proteína é notável (até 50%), mas a preparação restante da proteína é esgotada completamente do LPS. Este método rende cerca de 10 − 15 mg de proteína de 400 mL de cultura.
    3. Ajuste a solução proteica para 1 mg/mL com HBS livre de endotoxina e meça o conteúdo LPS conforme descrito na etapa 3.1.1. Caso a solução proteica ainda não seja testada como livre de LPS (< 0,1 EU/mL), elimine as contaminações remanescentes usando uma resina de remoção de endotoxina.
      Nota: Com uma concentração proteica de 1 mg/mL, a contaminação de 0,1 EU/mL LPS equivale a aproximadamente 0, 1 pg de proteína LPS/μg.

4. separação química da reticulação e do Oligomer

  1. Reticulação química
    1. Prepare soluções de estoque altamente puras (endotoxina-livres) de 1 M de CaCl2 e 100 mm de ZnCl2 em água desionizada ultrapura (tabela de materiais). Use este buffer, feito recentemente, para a próxima etapa.
    2. Incubar 10 mL de S100A12 purificados endotoxina-livres (concentração 1 mg/mL em HBS) durante 30 min à temperatura ambiente (RT) com 25 mM de CaCl2 para dimeric/tetrameric, ou 25 mm CAcl2 e 1 mm ZnCl2 para HEXAMERIC/tetrameric S100A12 oligômeros.
    3. Prepare o chapéu cabeado dissolvendo 8 mgs de BS3 em 500 μL de água endotoxina-livre diretamente antes do uso (o chapéu cabeado de 8 mg para a solução de proteína íon-cravada de 10 ml iguala uma concentração final de 1,4 milímetros). Misture o chapéu cabeado e a amostra introduzindo com pipeta e incubar por 30 minutos adicionais em RT. extinguir a reacção adicionando 1 M de Tris-HCl, pH 7,5 a uma concentração final de 50 mm e filtrar através de 0,45 μm.
  2. Cromatografia de exclusão de tamanho
    1. Equilibrar a amostra reticulada a 12 − 15 ° c (temperatura da coluna) e iniciar o sistema de cromatografia líquida com manutenção geral. Conecte o buffer de coluna (HBS) e a coluna de exclusão de tamanho. Consulte a tabela 5 para obter informações detalhadas.
    2. Equilibram a coluna em HBS, carregam a amostra e coletam frações máximas (1 − 2 mL) durante a corrida. Analise essas frações em um gradiente de 4 − 20% de SDS-PAGE e frações de pool com as principais bandas do complexo proteico desejado.
      Nota: A hidrólise de reagentes do éster do NHS como BS3 em soluções aquosas conduz a uma absorvância forte em 280 nanômetro. Chapéu cabeado não acoplado (peso molecular: 572 g/mol) elutos no final da corrida e resulta em um pico forte.
    3. Concentre as soluções utilizando unidades filtrantes centrífugas com MWCOs de 10 kDa (dímero), 30 kDa (tetramer) ou 50 kDa (hexamer). Determine a contaminação da endotoxina conforme descrito na seção 3,1. Se necessário, retire os LPS restantes com uma resina de remoção de endotoxina seguindo as recomendações do fabricante (tabela de materiais).

5. testes funcionais em monócitos

  1. Preparação de monócitos
    1. Isole monócitos de casacos Buffy humanos por centrifugação de gradiente de densidade e enriquecimento de monócitos subsequente usando um kit de separação de esferas magnéticas (tabela de materiais).
      Nota: Este protocolo resultará em aproximadamente 5 − 7 x 107 monócitos (um casaco Buffy) com uma pureza de 83 − 95%. Desde que o número, mas igualmente a compreensibilidade das pilhas depende fortemente do doador, o protocolo pode ter que ser escalado acima (dependendo da contagem de pilha exigida).
    2. Para a centrifugação da densidade, equilibram a solução da separação (densidade = 1, 77 g/mL) a RT e transferem 20 mL em 50 mL de tubos de centrifugação (2 tubos por o revestimento Buffy). Diluir o sangue do casaco Buffy humano com a solução de sal tamponada de Hank (HBSS) para um volume total de 60 mL e camada de 30 mL desta mistura cuidadosamente em cima do meio de separação. Centrífuga a 550 x g por 35 min em RT. desative o freio de centrífuga.
    3. Após a centrifugação, as células sanguíneas periféricas mononucleares (PBMCs) estão localizadas diretamente em cima do meio de separação. Transfira estas pilhas em um tubo de centrifugador fresco de 50 mL, faça até 50 mL com HBSS, e Centrifugue-o em 170 x g por 10 minutos aspirar o sobrenadante e ressuscitar a pelota da pilha em um volume pequeno de HBSS introduzindo com pipting.
    4. Encha o tubo até 50 mL e centrifugue em 290 x g por 10 min. aspirar o sobrenadante novamente, ressuscite as células em hbss (50 ml) e centrifugar a 170 x g por 10 min. contar as células e ressuscite-los em buffer de separação celular (tabela de materiais < /C9 >) a uma concentração de 5 x 107 células/ml.
      Nota: Em vez de HBSS, salina tampão fosfato (PBS) pode ser usado para lavar as células.
    5. Para o isolamento de monócitos de PBMCs, use um kit de isolamento magnético de células negativas e siga o protocolo do fabricante. Contagem de monócitos e ressuscição em meio de monócitos (RPMI 1640, 15% de soro de bezerro fetal inativado por calor [FCS], 4 mM L-glutamina, 100 U/mL de penicilina/estreptomicina) a uma concentração de 2 x 106 células/ml.
    6. Para os monócitos de cultura, os pratos de cultura de revestimento (por exemplo, 100 mm) com um hidrofóbico, filme permeável a gás, adequado para células de suspensão (tabela de materiais). Esterilize as placas usando a luz UV por aproximadamente 30 min. Transfira as pilhas a estas placas da cultura e deixe-as descansar sobre-noite em 37 ° c e em 5% CO2.
      Nota: Use 15 − 25 mL de suspensão celular por prato revestido.
  2. Estimulação de monócitos
    1. Estimulação com S100A12 (wildtype)
      Nota: Para distinguir a S100A12 não tratada (produto final da secção 2.2.2) de proteínas reticuladas, S100A12 a seguir é referida como "wildtype".
      1. Transfira as células descansadas em um tubo centrífugo de 50 mL e centrifugue a 350 x g por 10 min. Aspire o sobrenadante e ressuscitem o pellet celular em meio de estimulação (rpmi 1640, 5% de calor-INATIVADO FCS, 4 mm L-glutamina, 100 U/ml de penicilina/ estreptomicina) na concentração de 2 x 106 células/ml.
      2. Para estimulação, use 24 placas de suspensão bem e adicione 250 μL de suspensão celular por poço (0,5 x 106 células/poço). Adicionar 50 μg/ml de polimixina B aos poços pretendidos, seguidos por LPS em diferentes concentrações (25, 50, 100 e 200 PG/ml) ou tipo selvagem S100A12 (10, 20, 40, 60 μg/ml). Além disso, aplique a proteína ou não tratada ou calor-desnaturado (99 ° c, 10 min) em diferentes concentrações para as células.
        Nota: Um tratamento térmico curto desnatura a proteína S100A12 mas tem menos a nenhum efeito em LPs.
      3. Incubar placas para 4 h a 37 ° c e 5% CO2. Colha as células transferindo a suspensão celular de cada poço para 1,5 mL de tubos de reação. Centrifugador a 500 x g durante 10 min. Transfira os sobrenadantes para tubos frescos e meça a libertação de TNFα em diferentes diluições (por exemplo, 1:2, 1:5, 1:10) com um kit de TNFΑ Elisa humano seguindo as recomendações do fabricante.
    2. Estimulação com oligômeros S100A12
      1. Prepare e semeie monócitos em 24 placas de suspensão bem como descrito acima. Estimular células adicionando oligômeros S100A12 da etapa 4.2.3. em diferentes concentrações molares (125 nM, 250 nM, 500 nM, 1000 nM).
        Nota: A fim comparar as habilidades dos oligômeros diferentes para estimular monocytes, os oligômeros foram aplicados às pilhas em concentrações comparáveis do molar.
      2. Incubar por 4 h a 37 ° c e 5% CO2, colher as células e medir a libertação de TNFα nos sobrenadantes como descrito acima.

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Resultados

Após a pré-purificação na coluna AIEX (Figura 1a-C) e subsequente HIC dependente de cálcio (Figura 2a, B), obteve-se proteína altamente pura (Figura 2C). Além, as medidas do endotoxina revelaram a remoção bem sucedida dos LPS. O teor de LPS após AIEX foi medido numa diluição de 1:10 acima do limite de detecção do ensaio, ou seja, acima de 500 EU/mL. Após a primeira filtração através de uma unidade d...

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Discussão

Neste protocolo, nós descrevemos a expressão bacteriana tag-livre do S100A12 humano e de sua purificação assim como a separação em oligômeros íon-induzidos diferentes para a estimulação imune da pilha. Comparado à literatura publicada na purificação da proteína S100A128,23,24, o uso de CAcl elevado2 (25 milímetros) na cromatografia hydrofóbica-interação é a nosso conhecimento original. Vários protocolos aplicando conc...

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Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

Este estudo foi apoiado por subvenções do programa de pesquisa médica inovadora intramural da faculdade de medicina da Universidade de Muenster (KE121201 a CK) e da Fundação alemã de pesquisa (DFG, Fo354/3-1 para D.F.).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
vetor pET11bNovagen   
BL21(DE3) competente E. coliNew England BiolabsC2527 
       
100x Aminoácidos não essenciaisMerckK 0293
25% HClCarl RothX897.1
4− 20% Mini-PROTEAN TGX Protein GelsBioRad4561093
Ampicilina de sódio salCarl RothHP62.1
BS3 (bis(sulfosuccinimidil)suberato) - 50 mgThermoFisher Scientific21580
Cálcio clorido DihydratCarl Roth5239.1
Coomassie Briliant Blue R250 Solução DescoloranteBioRad1610438
Solução de coloração Coomassie Briliant Blue R250BioRad1610436
EasySep Kit de enriquecimento de monócitos humanosStemcell19059Kit de isolamento de células negativas magnéticas
EDTA sal dissódico di-hidratadoCarl Roth8043.1
EGTACarl Roth3054.3
EndoLISAHyglos609033Detecção de endotoxinas ensaio
Água ultrapura sem endotoxinasSigma-AldrichTMS-011-AÁgua ultrapura para preparação de tampões livres de endotoxinas
EndoTrap redHyglos321063Resina de remoção de endotoxinas
FBS (inativada pelo calor)Gibco10270
HBSS, sem cálcio, sem magnésioThermoFisher Scientific14175053
HepesCarl Roth9105
Hepes (teste de endotoxina de alta qualidade)Sigma-AldrichH4034
hTNF-alfa - Conjunto OptEia ELISABD555212
IPTG (isopropil-ß-D-tiogalactopiranosida)Carl RothCN08.1
L-Glutamina (200 mM)MerckK 0282
LB-MediumCarl RothX968.1
Lipopolissacarídeos de E. coli O55:B5MerckL6529
Pancoll, humanoPAN BiotechP04-60500Solução de separação (centrifugação por gradiente de densidade)
Penicilina/Estreptomicina (10.000 U/mL)MerckA 2212
Phenyl Sepharose High PerformanceGE Healthcare17-1082-01Resina para cromatografia de interação hidrofóbica
Polimixina BInvivogentlrl-pmb
Comprimidos inibidores de proteaseRoche11873580001
Q Sepharose Fast FlowGE Healthcare17-0510-01Resina para cromatografia de troca
aniônica Tampão RoboSepStemcell20104Tampão de separação celular (seção 5.1.4)
RPMI 1640 MédioMerckF 1215
Cloreto de sódio (NaCl)Carl Roth3957.2
Hidróxido de sódioCarl RothP031.1
Base TrisCarl Roth4855.3
Cloreto de zincoCarl RothT887
Labware
0,45 µ filtro de seringa mMerckSLHA033SS
tubos de fundo redondo de 14 mLBD352059
balão Erlenmyer de 2 LCarl RothLY98.1
placas de suspensão de 24 poçosGreiner662102
copo de medição de 5 LCarl RothCKN3.1
tubos de centrífuga cônicos de 50 mLCorning430829
Tubos de centrífuga de alta velocidade de 50 mLEppendorf3,01,22,178
Unidade de Filtro Centrífugo Amicon Ultra-15 MWCO 3 kDaUnidade de
Amicon Ultra-15 MWCO 50 kDaMerckUFC905024
Prato de cultura (100 mm)Sarstedt83.3902
Tubos de diáliseClosures Spectrum132738
Ímã EasySep 'The Big Easy'Stemcell18001
Tubos coletores de fração 5 mLFilme Greiner115101
Lumox, 25 µ m, 305 mm x 40 mSarstedt94,60,77,316Filme para placas de cultura de monócitos
Membrana de diálise Spectra/Por (3,5 kDa)Spectrum132724
Unidade de filtro SteritopMerckSCGPT01RE
Equipamento
37 ° C Incubadora (com agitação)New Brunswick ScientificInnova 42
Ä Purificador KTA UPC 10GE HealthcareFPLC Sistema
Coletor de fraçõesGE HealthcareFrac-920
Centrífuga (com rotor A-4-81)Eppendorf5810R
Rotor de ângulo fixoEppendorfF-34-6-38
Mini Protean Tetra CellBioRad1658000EDU
NanofotômetroImplenP330
SonicatorBrandelinUW2070
Leitor de fluorescênciaTecanmedidor de pH M200PRO
Knick765
Filtro Centrífugo Merck UFC900324 infinito

Referências

  1. Liston, A., Masters, S. L. Homeostasis-altering molecular processes as mechanisms of inflammasome activation. Nature Reviews Immunology. 17 (3), 208-214 (2017).
  2. Kessel, C., Holzinger, D., Foell, D. Phagocyte-derived S100 proteins in autoinflammation: putative role in pathogenesis and usefulness as biomarkers. Clinical Immunology. 147 (3), 229-241 (2013).
  3. Baker, T. M., Nakashige, T. G., Nolan, E. M., Neidig, M. L. Magnetic circular dichroism studies of iron(ii) binding to human calprotectin. Chemical Science. 8 (2), 1369-1377 (2017).
  4. Nakashige, T. G., Zhang, B., Krebs, C., Nolan, E. M. Human calprotectin is an iron-sequestering host-defense protein. Nature Chemical Biology. 11 (10), 765-771 (2015).
  5. Nakashige, T. G., Zygiel, E. M., Drennan, C. L., Nolan, E. M. Nickel Sequestration by the Host-Defense Protein Human Calprotectin. Journal of the American Chemical Society. 139 (26), 8828-8836 (2017).
  6. Cunden, L. S., Gaillard, A., Nolan, E. M. Calcium Ions Tune the Zinc-Sequestering Properties and Antimicrobial Activity of Human S100A12. Chemical Science. 7 (2), 1338-1348 (2016).
  7. Moroz, O. V., et al. Structure of the human S100A12-copper complex: implications for host-parasite defence. Acta Crystallographica Section D, Biological Crystallography. 59 (Pt 5), 859-867 (2003).
  8. Moroz, O. V., Blagova, E. V., Wilkinson, A. J., Wilson, K. S., Bronstein, I. B. The crystal structures of human S100A12 in apo form and in complex with zinc: new insights into S100A12 oligomerisation. Journal of Molecular Biology. 391 (3), 536-551 (2009).
  9. Korndorfer, I. P., Brueckner, F., Skerra, A. The crystal structure of the human (S100A8/S100A9)2 heterotetramer, calprotectin, illustrates how conformational changes of interacting alpha-helices can determine specific association of two EF-hand proteins. Journal of Molecular Biology. 370 (5), 887-898 (2007).
  10. Moroz, O. V., et al. Both Ca2+ and Zn2+ are essential for S100A12 protein oligomerization and function. BMC Biochemistry. 10, 11(2009).
  11. Baudier, J., Glasser, N., Gerard, D. Ions binding to S100 proteins. I. Calcium- and zinc-binding properties of bovine brain S100 alpha alpha, S100a (alpha beta), and S100b (beta beta) protein: Zn2+ regulates Ca2+ binding on S100b protein. Journal of Biological Chemistry. 261 (18), 8192-8203 (1986).
  12. Dell’Angelica, E. C., Schleicher, C. H., Santome, J. A. Primary structure and binding properties of calgranulin C, a novel S100-like calcium-binding protein from pig granulocytes. Journal of Biological Chemistry. 269 (46), 28929-28936 (1994).
  13. Vogl, T., et al. S100A12 is expressed exclusively by granulocytes and acts independently from MRP8 and MRP14. Journal of Biological Chemistry. 274 (36), 25291-25296 (1999).
  14. Hofmann, M. A., et al. RAGE mediates a novel proinflammatory axis: a central cell surface receptor for S100/calgranulin polypeptides. Cell. 97 (7), 889-901 (1999).
  15. Foell, D., et al. Proinflammatory S100A12 Can Activate Human Monocytes via Toll-like Receptor 4. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 187 (12), 1324-1334 (2013).
  16. Kessel, C., et al. Calcium and zinc tune autoinflammatory Toll-like receptor 4 signaling by S100A12. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 142 (4), 1370-1373 (2018).
  17. Armaroli, G., et al. Monocyte-Derived Interleukin-1beta As the Driver of S100A12-Induced Sterile Inflammatory Activation of Human Coronary Artery Endothelial Cells: Implications for the Pathogenesis of Kawasaki Disease. Arthritis & Rheumatology. 71 (5), 792-804 (2019).
  18. GE Healthcare. Strategies for Protein Purification. Handbook. , Freiburg, Germany. (2010).
  19. Jackson, E., Little, S., Franklin, D. S., Gaddy, J. A., Damo, S. M. Expression, Purification, and Antimicrobial Activity of S100A12. Journal of Visualized Experiments. (123), (2017).
  20. Kiss, B., Ecsedi, P., Simon, M., Nyitray, L. Isolation and Characterization of S100 Protein-Protein Complexes. Methods in Molecular Biology. 1929, 325-338 (2019).
  21. Magalhaes, P. O., et al. Methods of endotoxin removal from biological preparations: a review. Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences. 10 (3), 388-404 (2007).
  22. Petsch, D., Anspach, F. B. Endotoxin removal from protein solutions. Journal of Biotechnology. 76 (2-3), 97-119 (2000).
  23. Heilmann, R. M., Suchodolski, J. S., Steiner, J. M. Purification and partial characterization of canine S100A12. Biochimie. 92 (12), 1914-1922 (2010).
  24. Hung, K. W., Hsu, C. C., Yu, C. Solution structure of human Ca2+-bound S100A12. Journal of Biomolecular NMR. 57 (3), 313-318 (2013).
  25. Endotoxin Removal. Application Note - Sartorius Stedim Biotech. , (2010).
  26. Hogasen, A. K. M., Abrahamsen, T. G. Polymyxin-B Stimulates Production of Complement Components and Cytokines in Human Monocytes. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 39 (2), 529-532 (1995).
  27. Valentinis, B., et al. Direct effects of polymyxin B on human dendritic cells maturation - The role of I kappa B-alpha/NF-kappa B and ERK1/2 pathways and adhesion. Journal of Biological Chemistry. 280 (14), 14264-14271 (2005).
  28. Teuber, M., Miller, I. R. Selective Binding of Polymyxin-B to Negatively Charged Lipid Monolayers. Biochimica Et Biophysica Acta. 467 (3), 280-289 (1977).

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