Este protocolo descreve um método da purificação para a proteína obrigatória tag-livre de recombinação do cálcio S100A12 e seus oligômeros íon-induzidos para ensaios humanos da estimulação do monocyte.
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Artigo de método
Purificação do S100A12 humano e seus Oligomers íon-induzidos para a estimulação imune da pilha
Neste artigo
Resumo
Resumo
Neste protocolo, nós descrevemos um método para purificar a proteína cálcio-obrigatória humana S100A12 e seus oligômeros íon-induzidos da cultura de Escherichia coli para estimulações imunes da pilha. Este protocolo baseia-se em uma estratégia de cromatografia em duas etapas, que compreende a pré-purificação de proteínas em uma coluna de cromatografia de troca de ânions e uma etapa de polimento subsequente em uma coluna de interação hidrofóbica. Esta estratégia produz S100A12 proteína de alta pureza e rendimento a custos gerenciáveis. Para ensaios funcionais em células imunes eventual contaminação de endotoxina remanescente requer monitoramento cuidadoso e mais etapas de limpeza para obter proteína livre de endotoxina. A maioria das contaminações da endotoxina pode ser excluída por cromatografia de troca de ânions. Para esgotar contaminações residuais, este protocolo descreve uma etapa da remoção com filtros centrífugos. Dependendo do íon-força disponível S100A12 pode arranjar em homomultimers diferentes. Para investigar o relacionamento entre a estrutura e a função, este protocolo descreve mais mais o íon-tratamento da proteína S100A12 seguida pelo reticulação químico para estabilizar S100A12 oligômeros e sua separação subseqüente pelo tamanho-exclusão Cromatografia. Finalmente, nós descrevemos um ensaio Cell-Based que confirme a atividade biológica da proteína purified e confirme a preparação LPS-livre.
Introdução
S100A12 é uma proteína de ligação de cálcio que é predominantemente produzida por granulócitos humanos. A proteína é superexpressa durante a inflamação (sistêmica) e seus níveis séricos, particularmente em (auto) doenças inflamatórias como a artrite idiopática juvenil sistêmica (Aijs), a febre familiar do Mediterrâneo (FMF) ou a doença de Kawasaki (KD) pode informar sobre atividade da doença e resposta à terapêutica. Dependendo dos receptores de reconhecimento de padrão (PRRs), como os receptores Toll-like (TLRs), o sistema imunológico inato pode ser ativado por padrões moleculares associados a patógenos (PAMPs), como lipopolissacarídeos (LPS) ou danos associados a pa....
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Protocolo
Nota: Por favor, consulte a tabela complementar 1 para preparação de buffers e soluções de estoque.
1. expressão protéica em E. coli
-
Clonagem
- Clone tag-free Human S100A12 (seqüência de referência NCBI: NP_ 005612.1) em vetor de expressão bacteriana pET11b. Para expressar a proteína, transforme a construção em E. coli BL21 (de3).
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Cultura
- Prepare uma cultura inicial inoculando uma única colônia em 5 mL de meio de crescimento (caldo LB com 100 μg/mL de ampicilina) em um tubo de 14 mL de fundo redondo. Inc....
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Resultados
Após a pré-purificação na coluna AIEX (Figura 1a-C) e subsequente HIC dependente de cálcio (Figura 2a, B), obteve-se proteína altamente pura (Figura 2C). Além, as medidas do endotoxina revelaram a remoção bem sucedida dos LPS. O teor de LPS após AIEX foi medido numa diluição de 1:10 acima do limite de detecção do ensaio, ou seja, acima de 500 EU/mL. Após a primeira filtração através de uma unidade d.......
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Discussão
Neste protocolo, nós descrevemos a expressão bacteriana tag-livre do S100A12 humano e de sua purificação assim como a separação em oligômeros íon-induzidos diferentes para a estimulação imune da pilha. Comparado à literatura publicada na purificação da proteína S100A128,23,24, o uso de CAcl elevado2 (25 milímetros) na cromatografia hydrofóbica-interação é a nosso conhecimento original. Vários protocolos aplicando conc.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Este estudo foi apoiado por subvenções do programa de pesquisa médica inovadora intramural da faculdade de medicina da Universidade de Muenster (KE121201 a CK) e da Fundação alemã de pesquisa (DFG, Fo354/3-1 para D.F.).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| vetor pET11b | Novagen | ||
| BL21(DE3) competente E. coli | New England Biolabs | C2527 | |
| 100x Aminoácidos não essenciais | Merck | K 0293 | |
| 25% HCl | Carl Roth | X897.1 | |
| 4− 20% Mini-PROTEAN TGX Protein Gels | BioRad | 4561093 | |
| Ampicilina de sódio sal | Carl Roth | HP62.1 | |
| BS3 (bis(sulfosuccinimidil)suberato) - 50 mg | ThermoFisher Scientific | 21580 | |
| Cálcio clorido Dihydrat | Carl Roth | 5239.1 | |
| Coomassie Briliant Blue R250 Solução Descolorante | BioRad | 1610438 | |
| Solução de coloração Coomassie Briliant Blue R250 | BioRad | 1610436 | |
| EasySep Kit de enriquecimento de monócitos humanos | Stemcell | 19059 | Kit de isolamento de células negativas magnéticas |
| EDTA sal dissódico di-hidratado | Carl Roth | 8043.1 | |
| EGTA | Carl Roth | 3054.3 | |
| EndoLISA | Hyglos | 609033 | Detecção de endotoxinas ensaio |
| Água ultrapura sem endotoxinas | Sigma-Aldrich | TMS-011-A | Água ultrapura para preparação de tampões livres de endotoxinas |
| EndoTrap red | Hyglos | 321063 | Resina de remoção de endotoxinas |
| FBS (inativada pelo calor) | Gibco | 10270 | |
| HBSS, sem cálcio, sem magnésio | ThermoFisher Scientific | 14175053 | |
| Hepes | Carl Roth | 9105 | |
| Hepes (teste de endotoxina de alta qualidade) | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| hTNF-alfa - Conjunto OptEia ELISA | BD | 555212 | |
| IPTG (isopropil-ß-D-tiogalactopiranosida) | Carl Roth | CN08.1 | |
| L-Glutamina (200 mM) | Merck | K 0282 | |
| LB-Medium | Carl Roth | X968.1 | |
| Lipopolissacarídeos de E. coli O55:B5 | Merck | L6529 | |
| Pancoll, humano | PAN Biotech | P04-60500 | Solução de separação (centrifugação por gradiente de densidade) |
| Penicilina/Estreptomicina (10.000 U/mL) | Merck | A 2212 | |
| Phenyl Sepharose High Performance | GE Healthcare | 17-1082-01 | Resina para cromatografia de interação hidrofóbica |
| Polimixina B | Invivogen | tlrl-pmb | |
| Comprimidos inibidores de protease | Roche | 11873580001 | |
| Q Sepharose Fast Flow | GE Healthcare | 17-0510-01 | Resina para cromatografia de troca |
| aniônica Tampão RoboSep | Stemcell | 20104 | Tampão de separação celular (seção 5.1.4) |
| RPMI 1640 Médio | Merck | F 1215 | |
| Cloreto de sódio (NaCl) | Carl Roth | 3957.2 | |
| Hidróxido de sódio | Carl Roth | P031.1 | |
| Base Tris | Carl Roth | 4855.3 | |
| Cloreto de zinco | Carl Roth | T887 | |
| Labware | |||
| 0,45 µ filtro de seringa m | Merck | SLHA033SS | |
| tubos de fundo redondo de 14 mL | BD | 352059 | |
| balão Erlenmyer de 2 L | Carl Roth | LY98.1 | |
| placas de suspensão de 24 poços | Greiner | 662102 | |
| copo de medição de 5 L | Carl Roth | CKN3.1 | |
| tubos de centrífuga cônicos de 50 mL | Corning | 430829 | |
| Tubos de centrífuga de alta velocidade de 50 mL | Eppendorf | 3,01,22,178 | |
| Unidade de Filtro Centrífugo Amicon Ultra-15 MWCO 3 kDa | Unidade de | ||
| Amicon Ultra-15 MWCO 50 kDa | Merck | UFC905024 | |
| Prato de cultura (100 mm) | Sarstedt | 83.3902 | |
| Tubos de diálise | Closures Spectrum | 132738 | |
| Ímã EasySep 'The Big Easy'Stemcell | 18001 | ||
| Tubos coletores de fração 5 mL | Filme Greiner | 115101 | |
| Lumox, 25 µ m, 305 mm x 40 m | Sarstedt | 94,60,77,316 | Filme para placas de cultura de monócitos |
| Membrana de diálise Spectra/Por (3,5 kDa) | Spectrum | 132724 | |
| Unidade de filtro Steritop | Merck | SCGPT01RE | |
| Equipamento | |||
| 37 ° C Incubadora (com agitação) | New Brunswick Scientific | Innova 42 | |
| Ä Purificador KTA UPC 10 | GE Healthcare | FPLC Sistema | |
| Coletor de frações | GE Healthcare | Frac-920 | |
| Centrífuga (com rotor A-4-81) | Eppendorf | 5810R | |
| Rotor de ângulo fixo | Eppendorf | F-34-6-38 | |
| Mini Protean Tetra Cell | BioRad | 1658000EDU | |
| Nanofotômetro | Implen | P330 | |
| Sonicator | Brandelin | UW2070 | |
| Leitor de fluorescência | Tecan | medidor de pH M200PRO | |
| Knick | 765 |
Referências
- Liston, A., Masters, S. L. Homeostasis-altering molecular processes as mechanisms of inflammasome activation. Nature Reviews Immunology. 17 (3), 208-214 (2017).
- Kessel, C., Holzinger, D., Foell, D. Phago....
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Reimpressões e permissões
