Visão mecanicista do desenvolvimento da fibrose intestinal mediada por TNBS e avaliação dos efeitos inibitórios da rapamicina

Resumo

Neste estudo, nós descrevemos um procedimento detalhado da fibrose intestinal TNBS-negociada, que exibe a patofisiologia comparável à fibrose de Crohn. Nós igualmente discutimos esta aproximação à luz do rapamicina facilitamos efeitos inibitórios na fibrose intestinal.

Resumo

Foram realizados estudos significativos para compreender a gestão eficaz da fibrose intestinal. No entanto, a falta de melhor conhecimento da fibrose tem dificultado o desenvolvimento de um fármaco preventivo. Principalmente, encontrar um modelo animal adequado é desafiador na compreensão do mecanismo da patologia de fibrose intestinal associada à doença de Crohn. Aqui, nós adotamos um método eficaz onde a exposição química de tnbs aos RECOS dos ratos produz ulceração substancialmente profundo e inflamação crônica, e os ratos então desenvolvem cronicamente a fibrose intestinal. Também, nós descrevemos uma técnica onde uma injeção do rapamicina mostre efeitos inibitórios na fibrose tnbs-negociada no modelo do rato. Para avaliar o mecanismo subjacente da fibrose, nós discutimos metodicamente um procedimento para purificante pilhas de Cx3Cr1 + do própria do lamina de camundongos tnbs-tratados e de controle. Este protocolo detalhado será útil para os pesquisadores que estão investigando o mecanismo de fibrose e pavimentar o caminho para encontrar uma melhor invenção terapêutica para a fibrose intestinal associada à doença de Crohn.

Introdução

A desregulação da homeostase imune no intestino leva à inflamação patogênica e tem sido amplamente conhecida por causar doença inflamatória intestinal (IBD)^1,2. A fibrose intestinal é uma consequência crônica de doenças inflamatórias intestinais (DII), como a doença de Crohn (DC)³. A fisiopatologia irreversível da DC inclui estenose intestinal ou estenoses de fibrose, o que limita as opções de tratamento, e sem medicamentos atualmente disponíveis, o único tratamento é a cirurgia. Em última análise, o desenvolvimento de terapias eficazes para combater a inflamação inadequada é muito necessário para estudar o mecanismo de CD, e isso vai nos levar um passo mais perto disso.

Uma variedade de modelos genéticos do rato está disponível para estudar IBD que inclui IL10 ko, SAMP/yit e transferência de pilha elevada adoptiva de CD45⁺RB em ratos de scid^4,5,6. Aqui, nós mostramos o procedimento para a fibrose TNBS-negociada no modelo do rato do CD, que é comparável à patologia da fibrose de Crohn humana. O modelo induzido por TNBS tem certas vantagens. Este modelo é tecnicamente simples; o início da doença é rápido, barato, e poderia extensamente ser usado em animais diferentes (por exemplo, rato, rato e cobaia⁷). A coadministração de etanol e tnbs (^{2, 4}, 6-trinitrobenzeno sulfônico Acid) danifica abruptamente a barreira intestinal e expõe a proteína do tecido do cólon para tnbs e elicita respostas imunológicas substanciais^8,9. A exposição repetida de tnbs conduz a um processo de reparo exagerar que responde à inflamação e ao ferimento, e desenvolve uma reação fibrótica no intestino. Assim, o modelo de fibrose induzida por TNBS serve para ser um modelo muito convincente para estudar a fibrose intestinal associada a Crohn.

Além disso, os fagócitos mononucleares são as células primárias que arbitram a resposta imune inata à patogênese e lesão no intestino^10,11,12,13. Para elucidar o mecanismo celular e estabelecer o papel dos fagócitos Cx3Cr1⁺ mononucleares no modelo de fibrose tnbs, mostramos o procedimento de purificação dos fagócitos mononucleares. A análise das células Cx3Cr1⁺ é um passo essencial para avaliar os marcadores inflamatórios e determinar o mecanismo concomitante de fibrose intestinal. Coletivamente, este procedimento detalhado para a fibrose de TNBS será útil explicar os mecanismos celulares da fibrose intestinal.

Protocolo

Para este manuscrito, todas as amostras humanas foram adquiridas de acordo com o protocolo aprovado pelo Conselho de revisão do Instituto (IRB) e pela Comissão de pesquisa humana na faculdade de medicina de Albany. Todas as pesquisas envolvendo animais foram rigorosamente seguidas de acordo com o protocolo aprovado pelo Comitê institucional de cuidados e uso de animais da faculdade de medicina de Albany, bem como o guia nacional de institutos de saúde para o cuidado e uso de animais de laboratório .

1. coleção de espécimes intestinais humanos

1. Colete amostras de tecido humano de acordo com os protocolos do Comitê de pesquisa da instituição.
2. Adquira o tecido intestinal (ileocolonic) de um paciente CD diagnosticado com a fibrose e as amostras de controle dos pacientes sem a história de IBDs.
3. Use parte do tecido intestinal para a imunohistologia, uma outra parte do tecido para analisar o mRNA, e uma parte final para a expressão da proteína de genes/marcadores fibrótica e do citocinas.
4. Para a análise de imunohistologia, primeiro fixar a amostra de tecido humano em 4% paraformaldeído para pelo menos 48 h e, em seguida, transferi-lo para um tubo contendo 70% etanol por pelo menos 16 h. Use este tecido fixo para fazer um bloco embebido em parafina e corte 5 μm de tecido grosso secções utilizando um micrótomo tecidual.
5. Usando uma escova, espalhe delicadamente para fora cada seção do corte em uma corrediça de vidro para manchar.
6. Deslize a lâmina da seção do tecido com mancha do Tricrômico para detectar o depósito do colagénio, e com a mancha do αsma para detectar miofibroblastos (veja a seção 3 para a informação detalhada sobre o Tricrômico e a coloração de αsma). Examine as secções manchadas um microscópio de luz.
7. Processe outra parte da amostra de tecido humano obtida para fazer o lisado da proteína para detectar o αsma através do borrão ocidental (veja a seção 7 para a informação detalhada sobre a análise ocidental do borrão).
8. Obter RNA da parte final da amostra de tecido humano usando um reagente de extração (tabela de materiais) e converter mRNA em cDNA via RT-PCR.
9. Analise genes fibróticos e citocinas por qPCR (ver seção 6 para obter informações detalhadas sobre a preparação de mRNA).

2. indução de fibrose TNBS e tratamento da rapamicina em camundongos

1. Realizar pesquisas de animais de acordo com os protocolos de pesquisa animal aprovados pela instituição.
2. Barbear ratos adultos ao redor da área do pescoço, a fim de pré-sensibilização para TNBS através da exposição cutânea. Mergulhe TNBS em um cotonete de algodão e, em seguida, aplique TNBS para a área raspada do pescoço do mouse.
   Nota: a pré-sensibilização é um passo muito importante, uma vez que melhora a resposta de hipersensibilidade tardia para iniciar a inflamação mediada por TNBS.
3. Oito dias após a pré-sensibilização, induzem a colite por administração intra-retal uma vez por semana durante seis semanas. Aplique quatro mg de TNBS (em etanol a 25%) utilizando um enema de 100 μL através de uma seringa de 1 mL ligada a um cateter de poliuretano francês 3,5 e dê aos ratos de controlo 100 μL de etanol a 25% apenas.
   1. Anestesiam camundongos com pentobarbital (25 mg/kg intraperitoneal) ou expõem-nos a 2,5% de isoflurano, juntamente com 1 L/min de oxigênio durante a administração de TNBS. Confirme a anestesia delicadamente beliscando os dedos do pé e procurando uma ausência de reflexo.
4. Use pomada veterinária nos olhos para evitar a secura enquanto os ratos estão anestesia.
5. Injetar rapamicina a 2 mg/kg/dia ou veículo (5% Tween-20 e 4% etanol) todos os dias da semana para 3-6 semanas, intraperitoneal, para ambos os controles e camundongos tratados com TNBS.
6. Use 6 semanas TNBS pós-tratado intestino camundongos para analisar os ensaios extracelulares, incluindo histologia, citometria de fluxo, western blotting e extração de RNA. Para colher órgãos, eutanizar camundongos usando CO₂ inalação e confirmar eutanásia com luxação cervical.
   1. Para colher órgãos, eutanizar camundongos usando CO₂ inalação e confirmar eutanásia com luxação cervical. Após a eutanásia, abra longitudinalmente o rato em seu lado ventral usando tesouras da classe cirúrgica e fórceps. Remova o cólon inteiro do reto para a área de Ilium terminal. Transfira rapidamente os dois pontos ao gelo-frio 1x HBSS e lave os dois pontos usando o mesmo amortecedor.
   2. Meça e compare os comprimentos do cólon do controle e dos camundongos tratados com TNBS. Faça esta etapa tão rapidamente como possível para evitar secar fora dos dois pontos a fim evitar mortes da pilha.
   3. Corte os dois pontos em pedaços pequenos e mantenha a-80 ° c para o armazenamento para finalidades futuras (análise do RNA/Western blot). Use outra parte do cólon para análise FACS.
   4. Certifique-se de cortar e recolher amostras de tecido Colônico de regiões semelhantes do cólon de ambos os animais tratados com TNBS e controle.
      Nota: uma mortalidade de 10% a 20% é esperada com a inoculação de TNBS, embora com experiência, a taxa de mortalidade pode ser significativamente reduzida.

3. avaliação imuno-histopatológica da fibrose intestinal

1. Corrigir tecidos humanos e/ou camundongos em 4% paraformaldeído para 48 h, e depois transferir para 70% etanol por 16 h.
   Nota: paraformaldeído é um produto químico neurotóxico para evitar inalar; usar uma máscara facial ao usá-lo.
2. A parafina incorpora os tecidos fixos dos dois pontos, fatia a uma espessura de 5 μm, e põr diretamente os tecidos sobre corrediças de vidro para a histologia.
3. Realize a coloração de H & e e trichrome Blue de acordo com as instruções do fabricante para detectar colágeno.
   1. Brevemente, primeiro desparaffinize seções submergindo o slide contendo seções em duas câmaras de xileno por 5 min em cada câmara.
   2. Enxágüe lâminas com álcool 100% por 1 min; Repita este passo três vezes. Enxague novamente com água da torneira durante 1 min.
   3. Depois disso, mergulhe as lâminas na solução de Bouin pré-aquecida a 56 ° c por 60 min. a solução de Bouin é amarela na aparência; Lave depois de tirar os slides da solução de Bouin em água da torneira por 3 min ou até que as lâminas se tornaram incolor.
   4. Mergulhe as lâminas na solução de hematoxilina de Mayer modificada por 7 min à temperatura ambiente.
   5. Lâminas de mancha por imersão em trichrome mancha por 5-8 min. imediatamente, enxaguar slides em água corrente para 5-10 s para remover o excesso de mancha de trichrome.
   6. Deshidratar slides com 100% de álcool por 1 min. Repita este procedimento três vezes.
   7. Limpar slides com xileno por 1 min e repita o passo 3x.
   8. Montagem de slides com suportes de montagem (tabela de materiais).
4. Segure com cuidado a lamínula em uma extremidade com fórceps e deixe-a cobrir a seção inteira sem ter nenhumas bolhas. Se houver algumas bolhas, remova rapidamente as bolhas tocando na lamínula.
5. Use imunocoloração para detectar αSMA.
   1. Bloqueie as secções do cólon no tampão de bloqueio (0,2% Triton X-100 e 5% de soro de cabra normal em 1X PBS) durante 1 h à temperatura ambiente.
   2. Incubar com 100 μL de anticorpo primário diluído para αSMA (tabela de materiais) na solução de slides (0,2% Triton X-100 e 3% de soro de cabra normal em 1X PBS; anti-αsma 1:200) a 4 ° c durante a noite.
   3. Lave as secções três vezes com 1X PBS.
   4. Use a cabra anti-mouse IgG (H + L) conjugada com Alexa fluor 488 (tabela de materiais) como um anticorpo secundário para 2 H à temperatura ambiente.
   5. Lave as secções três vezes com 1X PBS.
   6. Use DAPI para neutralizar o núcleo por 5 min.
   7. Lave as secções três vezes com 1X PBS.
   8. Monte corrediças com suportes de montagem fluorescentes (tabela dos materiais), e selo com um lamela usando o lustrador de prego.
6. Adquira imagens usando o microscópio confocal do LSM 880 e as imagens do processo usando o software do microscópio.
7. Quantifique imagens tomando uma média de várias áreas selecionadas na mesma seção com o ImageJ.

4. isolação do própria intestinal do lamina e da purificação de fagócitos de Cx3Cr1⁺ mononucleares

1. Abra longitudinalmente os dois pontos no gelo-frio solução de sal equilibrado de Hank (HBSS; Tabela de materiais) e lave os dois pontos com o mesmo tampão.
2. Corte cerca de 5 cm pequenos pedaços de tecidos de cólon usando tesouras estéreis em HBSS.
3. Transfira partes pequenas do tecido do cólon em um tubo cónico de 50 mL que contem 10 mL do amortecedor da pre-digestão (1x HBSS com 5% FBS, 5 milímetros de EDTA e de 1 milímetro DTT), e agitar por 20 minutos em 100 RPM em uma incubadora de 37 ° c¹¹.
   Nota: a incubação do tecido Colônico em 37 ° c em 100 RPM que agita a condição permite a digestão eficiente do tecido do colagenase e o rendimento elevado de pilhas viáveis.
4. Descarte o epitélio Colônico destacado passando por um filtro de células de 40 μm.
5. Recolher o tecido remanescente do filtro e digeri-los em tampão de digestão contendo Collagenase tipo IV e DNase I (tabela de materiais) em 1x HBSS com 5% FBS por 20 min a 37 ° c a 100 RPM.
6. Vórtice os tecidos digeridos por aproximadamente 20 s e passe através de um filtro de células de 40 μm para obter frações própria de lâmina.
7. Centrifugue as frações da lâmina própria para a pelota para baixo as pilhas em 700 x g em 4 ° c
8. Para excluir as células mortas da lâmina própria use um gradiente de densidade (tabela de materiais).
   Nota: a mídia de gradiente de densidade usada aqui (tabela de materiais) pode causar perda de células mononucleares; no entanto, ele remove muito as células mortas da preparação, que aumenta globalmente a pureza.
   1. Faça 100 mL cada uma das soluções de mídia de gradiente de densidade de 30% e 70%. Suspender as células obtidas em 10 mL da solução de 30% e sobrepor-se em cima de 5 mL da solução de 70% em um tubo de 15 mL.
   2. Centrifugue o gradiente em uma condição livre de freio em 1.000 x g e temperatura ambiente. Colete a fase do anel branco contendo linfócitos da lâmina própria, que será entre as camadas de gradiente de 30% e 70%.
9. Lave as células obtidas por re-suspendendo no gelo-frio HBSS e centrífuga em 500 x g, 20 ° c, por 10 min. re-suspender as células em FACS (fluorescência-ativado célula de triagem) tampão (PBS, pH 7,4, com 1% BSA e 2 mm EDTA).
10. Purify os fagócitos mononucleares da purificação das pilhas coletadas usando grânulos magnéticos e/ou classificação de FACS.
    1. Purificação magnética
       1. Antes de manchar com anticorpos, primeira superfície da pilha do bloco de pilhas do própria do lamina incubando com o bloqueador do anti-rato CD16/CD32 FC por 15 minutos no gelo.
       2. Incubar as células com anticorpos anti-Cx3Cr1-PE (phycoerythrin) juntamente com microgrânulos anti-PE (tabela de materiais) por 30 min no gelo, para capturar as células ligadas. Lave as células com o tampão FACS.
       3. Passar as células de anticorpo/talão ligado através de uma coluna de classificação de célula magnética ativada em um campo magnético para remover células não acopladas. Lave três vezes com o tampão FACS. Retire a coluna do campo magnético e empurre o êmbolo na coluna para produzir células ligadas ao cordão.
    2. Classificação FACS
       Nota: a classificação de FACS pode ser usada no lugar da purificação magnética. Embora a purificação magnética seja um método fácil e rentável, limita-se apenas a purificar células únicas, não para subpopulações de células. Portanto, para isolar subpopulações de células, o método de classificação FACS é um método eficaz de classificação de células únicas, bem como subpopulações de células.
       1. Obstrua pilhas do própria do lamina com o bloqueador do anti-rato CD16/CD32 FC (tabela dos materiais).
       2. Células de mancha incubando com anticorpos CD64, CD11c, CD11b, Cx3Cr1, Ly6C, e MHCII.
       3. Classifique usando um cytometer do fluxo de FACS, gating para CD11c-CD64⁺ CD11b⁺ Cx3Cr1⁺ Ly6C^- Cells para purificar a população de Cx3Cr1 (P3 + P4).
11. Lyse ordenou pilhas para a preparação total do RNA e detecte marcadores do citocinas e do fibrótica (veja a seção 6 para a preparação do RNA e do cDNA).
12. Analise a expressão de mRNA dos marcadores fibrótica e da análise inflamatório do citocinas das suspensões isoladas da único-pilha da purificação magnética.
13. Para análise de FACS, bloqueie as células com bloqueador de FC CD16/CD32 (tabela de materiais) antes de se manchar com anticorpos contra marcadores superficiais ou intracelulares.

5. análise de citometria de fluxo

1. Coloração e análise de superfície celular
   1. Resuspend 5-10 × 10⁵ células isoladas da lâmina própria em 50 ml de tampão FACS (1% BSA, 2 mm EDTA em PBS, pH 7,4).
   2. Incubar células com anti-mouse CD16/CD32 (tabela de materiais) em uma diluição 1:50 para bloquear receptores FC no gelo por 10 min.
   3. Lave as células com 500 μL de tampão FACS gelado para remover o anti-CD16/CD32 não acoplado antes da coloração da célula-superfície.
   4. Suspensões colónicas da único-pilha da mancha de superfície (10⁶ Cells/50 ml) com o anticorpo fluorescente-etiquetado na diluição 1:100 no gelo por 30 minutos para avaliar a propria Colônica do lamina.
   5. Lave as células rotuladas com 500 μL de tampão FACS gelado duas vezes para remover anticorpos não acoplados.
   6. Analise células mononucleares rotuladas por citometria de fluxo. Portão para viver, então para FSC⁺SSC⁺ seguido por CD11b⁺ Cx3Cr1⁺e, em seguida, analisar outros marcadores de ativação de macrófago, incluindo mhcii, CD80, CD86 e CD40.
2. Coloração e análise de citocinas intracelulares
   1. Para a coloração de citocinas intracelulares, fixar e permeabilizar as células manchadas de superfície usando um kit de solução de fixação/permeabilização (tabela de materiais); por favor, siga as instruções do fabricante para obter etapas detalhadas.
   2. Pilhas da lâmina própria da porta para vivo, então para FSC⁺SSC⁺ seguido por CD11b⁺ Cx3Cr1⁺IL23⁺ para detectar o nível intracelular de IL23 citocinas^{e CD11b + Cx3Cr1 + IL1β+} a detectam níveis intracelulares de citocinas IL1β.
3. coloração e análise de αSMA
   1. Lave as células com tampão FACS duas vezes por centrifugação a 200 x g e 4 ° c por 5 min para remover o excesso de tampão fixador.
   2. Para determinar o nível αSMA, permeabilize as células com um kit de solução de fixação/permeabilização (tabela de materiais).
   3. Incubar células com anticorpo anti-αSMA-AF488 (tabela de materiais) usando 1:1000 de diluição no gelo por 30 min.
   4. Lave as células duas vezes e, em seguida, fazer análise FACS. Portão para Live, FSC⁺SSC⁺ seguido pela detecção de αsma⁺ células em células colônicas.

6. isolação do RNA, RT-PCR, PCR do tempo real

1. Isolar o RNA de MACS ou FACS células purificadas ou cólon extirpado tecido homogeneizando-os em reagente de extração (tabela de materiais).
   Nota: Use óculos de segurança e outros equipamentos de proteção de laboratório ao trabalhar com este reagente, pois é um irritante do pulmão e da pele. Trabalhe com segurança em um capô.
2. Adicionar 0,5 μL de glicogênio livre de RNase de 20 μg/mL de solução de glicogênio (tabela de materiais) para melhorar a recuperação do RNA total antes da precipitação do RNA com isopropanol.
3. Ressuscitem o RNA pellet em 50 μL de água livre de RNase (tabela de materiais) e incubar a 55 ° c por 5 min para dissolver completamente o palato de RNA.
4. Leia as concentrações de RNA utilizando um espectrofotômetro a 260 nm.
5. Sintetizar cDNA usando 1 μg de RNA total e um kit de síntese de transcrição reversa (tabela de materiais).
6. Analise a expressão gênica usando 2 μL de cDNA como modelos via PCR em tempo real. Use um 96-bem PCR placa qPCR Master Mix Kit (tabela de materiais). Use os valores de TC para calcular a mudança de dobra da abundância de RNA após normalizar os valores de GAPDH/HPRT.

7. western blotting

1. Tecido de cólon lise usando tampão de Lise RIPA (1% NP40).
2. Resolva o lisado da proteína em um gel de bis-Tris de 8% em uma tensão constante de 80 V.
3. Transferência de gel-proteína para membrana de nitrocelulose (s) em tampão de transferência a frio rodando a uma corrente constante de 50 mA para 2 h a 4 ° c.
4. Bloquear regiões não específicas na membrana transferida de proteínas utilizando 5% de leite não gordo em TBST (25 mM Tris-HCl, pH 7,4, 1,5 M NaCl, 0, 5% Tween-20) durante pelo menos 1 h à temperatura ambiente.
5. Para detectar níveis de αSMA, incubar membrana (s) com anticorpo de detecção primária αSMA a 4 ° c durante a noite.
6. Lave as membranas 3-4 vezes usando TBST em intervalos de 15 min.
7. Incubar com anticorpo secundário conjugado com HRP (1:10000) em 5% de leite não gordo em TBST.
8. Desenvolva membranas usando um kit de desenvolvimento ECL.
9. Normalize intensidades do sinal da proteína com GAPDH como um controle do carregamento para a análise da densitometria.

8. análise estatística

1. Analise os dados usando o software de análise de dados de escolha, comparando entre o tipo selvagem e animais KO.
2. Considerar o valor de P de < 0,05 para ser significante (* P < 0, 5; * * P < 0, 1; * * * P < 0, 1).
3. Use o teste t de Student para testar as diferenças entre dois grupos e o teste ANOVA para análise entre mais de dois grupos.

Resultados

Nós adotamos o modelo do rato da colite de TNBS para estudar e elucidar os mecanismos subjacentes da fibrose intestinal⁸. Aqui, nós executamos um estudo detalhado do curso do tempo da colite TNBS-negociada, onde TNBS estêve administrado rectal semanal aos ratos do tipo selvagem por até seis semanas como representado esquematicamente (Figura 1a). Após seis semanas de tratamento com TNBS, observou-se que os comprimentos colônicos encurtam progressivamente ao longo do tratamento com TNBS, a partir de uma média de 5 ± 0,5 cm no grupo controle para 3 ± 0,5 cm no grupo TNBS; Essa análise quantitativa do comprimento do cólon representa uma redução muito aparente do comprimento do cólon (Figura 1B). Para garantir que o modelo de doença de Crohn do TNBS é comparável ao modelo de fibrose humana de Crohn e não foi um artefato relacionado à metodologia, analisamos os marcadores fibróticos em vários níveis em um estudo detalhado do curso de tempo para a injeção de TNBS para o tipo selvagem . A acumulação de pilhas positivas do actínio do músculo alfa-liso (αsma) e a deposição do colagénio dentro das camadas submucosal foram relatadas em a maioria das incidências da fibrose e são consideradas como uma indicação para eventos fibrótica¹⁴. Nós encontramos que as seções dos dois pontos de camundongos TNBS-tratados que foram manchadas com o αSMA mostraram um aumento 4-6-fold na camada relativa ao cólon da submucosa manchada positivamente com o αSMA (Figura 1C). Além disso, a coloração azul Tricrômico para essas seções também mostrou um aumento de 2-4 vezes, sugerindo deposição significativa de colágeno, que valida a fibrose intestinal grave (Figura 1D). Nós avaliamos mais a ativação dos miofibroblastos detectando pilhas de αsma-positivas pela análise de FACS em dois pontos dos ratos tnbs-tratados e encontramos uma acumulação significativa de coloração de αsma-positive (Figura 1e). Além disso, constatou-se indução substancial na expressão de αSMA, Col-I e col-III mensuradas pela análise de qPCR em camundongos tratados com TNBS (Figura 1F). A expressão aumentada da proteína de αSMA na análise ocidental do borrão revelou a fibrose aumentada (Figura 1G). Globalmente, o tratamento da cinética do TNBS oferece uma oportunidade para acessar a resposta imune putativa em condições crônicas, que imita de perto a condição de fase crônica do CD e é essencial para o desenvolvimento da fibrose.

Para comparar a fibrose do TNBS com a fibrose associada de Crohn, analisamos a expressão de marcadores de fibrose e citocinas em biópsia de tecido fresco do íleo de pacientes com CD ativo ou remissão. Notàvel, nós encontramos a indução marcada do engrossamento de camadas αsma-positivas e o depósito aumentado do colagénio como detectado pela mancha do Tricrômico em seções ativas do CD (Figura 2A). Também realizamos a análise de Western blot e confirmamos a indução da expressão de αSMA em amostras de CD ativas (Figura 2B). Além disso, observou-se indução significativa de marcadores de fibrose, incluindo αSMA, Col1, como detectado pela análise de qPCR (Figura 2C).

Em seguida, para determinar um mecanismo para limitar a fibrose tnbs avaliamos os efeitos da rapamicina, um inibidor farmacológico da atividade do mTOR^15,16. Nesse sentido, tratamos camundongos com TNBS e rapamicina e analisamos A αSMA e o nível de colágeno na histologia do cólon e mostramos mensuração quantitativa de αSMA e colágeno no gráfico de densitometria (Figura 3A). Nossos dados sugerem que o rapamicina reduza a coloração de αsma-positive na camada submucosal e diminua a deposição do colagénio. Para validar e quantificar ainda mais as respostas fibróticas, determinamos as expressões αSMA, colágeno e TGFβ por qPCR e expressão de αSMA por citometria de fluxo em cólon tratado com TNBS (Figura 3B, 3C). Nós mostramos também Cx3Cr1⁺ os fagócitos mononucleares induzem uma resposta imune inflamatório à lesão⁹. Assim, nós queríamos ver se a administração de rapamicina em camundongos tnbs-tratados poderia reverter os efeitos inflamatórios e fibróticos. Conseqüentemente, nós purificamos os fagócitos mononucleares residentes de Cx3Cr1⁺ das suspensões Colônica da única pilha usando microesferas magnéticos (Figura 3D). Nós encontramos um nível aumentado de p-P70 e de p-S6 em Cx3Cr1⁺ fagócitos mononucleares residentes pela análise ocidental do borrão dos ratos tnbs-tratados, e este nível foi obstruído pelo rapamicina (Figura 3e). Além disso, verificou-se que o tratamento com rapamicina amortece os IL-23 e IL-1 β no grupo tratado com TNBS (Figura 3F). Além disso, estes resultados elucidar o mecanismo eficaz envolvido na indução de tnbs-fibrose e mostraram que o rapamicina atenua a indução da fibrose.

Figura 1: a administração bem-sucedida de TNBS leva ao desenvolvimento de fibrose intestinal em camundongos. A. representação do diagrama esquemático do tratamento semanal de tnbs administrado a camundongos de tipo selvagem. Imagens de B. Colon e medida de comprimentos dos dois pontos dos ratos tnbs-tratados, colhidas nas semanas 0, 2, 4, e 6 tratamento do borne-tnsb. C-D. A análise histológica dos cortes do cólon manchou com o anticorpo de anti-αsma para a ativação de miofibroblastos e de coloração azul do Tricrômico para o colagénio; barra de escala 100 μm. E. Análise de FACS para identificar células αSMA-positivas no cólon e quantificação de células αSMA-positivas. F. marcadores fibróticos e citocinas detectadas pela qPCR. Análise de G. Western blot de αsma do lisado dos dois pontos de camundongos tnbs-tratados e do controle. Esta figura modificada está sendo reutilizada com a permissão da publicação precedente⁹ na imunologia Mucosal, 2019 por Mathur et al. estale por favor aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: a fibrose do TNBS é comparável à fibrose intestinal associada à doença de Crohn. A. imagens representativas de biópsias de cólon de controle, CD ativo mostrando um aumento significativo da coloração azul Tricrômico e coloração αsma-positiva em camadas submucosas, barra de escala 50 μm. B. Análise de Western blot de expressão e quantificação de αSMA. Análise de C. qPCR de marcadores fibrótica e de cytokines. Esta figura modificada está sendo reutilizada com a permissão da publicação precedente⁹ na imunologia Mucosal, 2019 por Mathur et al. estale por favor aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: o tratamento com rapamicina melhora efetivamente a fibrose induzida por TNBS. Análise histológica de A. Colon-imagens representativas da coloração de Miofibroblasto com anticorpo anti-αsma e coloração de colágeno com azul de trichrome, barra de escala 100 μm. B. qPCR análise de αsma, colágeno e TGFβ expressão em controle/ Os dois pontos de rato tratados com TNBS. Análise de C. FACS de αsma na única suspensão da pilha dos dois pontos do rato tratados com controle/tnbs. D. Schematic para a purificação de Cx3Cr1⁺ Cells da fração Colônica do própria do lamina e da análise de FACS de pilhas purified. Análise de e. Western blot de níveis de p-P70 e de p-S6 em fagócitos Cx3Cr1 + mononucleares purificados dos ratos tratados com tnbs e/ou Rapamycin. Análise de F. qPCR da expressão em fagocitos Cx3Cr1 + mononucleares purificados, que produz Il-23 e Il-1 β. Esta figura modificada está sendo reutilizada com a permissão da publicação precedente⁹ na imunologia Mucosal, 2019 por Mathur et al. estale por favor aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

Cicatrização de feridas ou reparação tecidual é um processo biológico rigorosamente regulado¹⁷. Durante a lesão tecidual com uma condição química, mecânica e de infecção, uma resposta inflamatória desencadeia o processo de reparo tecidual. No entanto, uma resposta inflamatória disregulada e patológica leva ao desenvolvimento de cicatrizes ou a uma reação fibrótica, o que pode prejudicar a função de reparo tecidual^9,18,19. Aqui, mostramos o procedimento para o modelo animal de fibrose induzida por TNBS, que compartilha significativamente a fisiopatologia com a doença de Crohn humana. A inoculação sucessiva da exposição química do TNBS para danificar o epitélio do camundongo provoca ulcerações profundas e induz o desenvolvimento da fibrose. Com um confiável, baixo custo, e rápida indução do início da doença, este método é amplamente aceito por vários grupos de pesquisa envolvidos em estudos de lesão tecidual, inflamação transmural e do eixo do intestino-cérebro.

Para implementar com sucesso o modelo de fibrose TNBS, existem várias etapas essenciais. Por exemplo, a dosagem e o sincronismo adequados da administração de TNBS são muito importantes. Uma inoculação de 6-8 semanas do tnbs permite A ulceração profunda do tecido e é altamente-recomendado para estudos fibrótica crônicos. O tamborete de Outcoming dos ratos e o reflexo retrógrado de TNBS inoculados são dois problemas principais, que poderiam conduzir à entrega de doses variáveis aos ratos. A pressão suave perto do reto de camundongos pode ajudar a liberar fezes antes da administração de TNBS. Segurando a cabeça do animal para baixo por alguns segundos dramaticamente ajuda a parar o refluxo reverso de TNBS. Manter os ratos em uma gaiola, colocando a gaiola em uma almofada de calor, e fornecendo os ratos com néctar de Napa também poderia ser estratégias úteis na prevenção de alta mortalidade.

Aqui, nós igualmente discutimos a inflamação do intestino durante a fibrose de tnbs e seu impacto na resposta fibrótica. o papel de mTOR/Autophagy é implicado extensamente na homeostase intestinal e na patogénese^20,21de IBD. Nós identificamos que a sinalização de mTOR/Autophagy é crítica para modular respostas pro-inflammatory das citocinas IL-23 e IL1β dos fagócitos mononucleares de Cx3Cr1⁺ que afetam a linha central pro-fibrotic Il-23/Il-22 (Figura 3A)⁹ . Desse modo, as únicas pilhas Cx3Cr1⁺ mononucleares de purificação para o de e a expressão de gene são uma etapa crítica do modelo. Nós discutimos em detalhe o protocolo para isolar o própria do lamina e fornecemos o procedimento da purificação para Cx3Cr1⁺ pilhas mononucleares usando grânulos magnéticos.

Coletivamente, apesar da presença de modelos genéticos e espontâneos para a doença de Crohn, TNBS-colite continua a ser uma potente ferramenta para estudar a imuno-patogénese da DC e tem o potencial para avaliar os tratamentos de fibrose de Crohn. A maior limitação do uso de modelos de fibrose induzida quimicamente como TNBS é a chance de alta variabilidade do usuário ao usuário e a possibilidade de outliers nos dados. Um tamanho amostral de 5-8 animais por grupo, juntamente com uma maior experiência do usuário, pode aumentar a consistência do modelo. Entretanto, encontrar um modelo genético apropriado que causa a fibrose espontânea de Crohn é e será garantido sempre.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Anti-mouse aSMA, AF488 conjugado, Clone#1A4	e-bioscience	53-9760-82
Anti-mouse aSMA, purificado Clone#M1/77	e-bioscience	149760-80
Anti-mouse CD11b, APCCy7 conjugado, Clone#M1/70	Biolegend Inc	101226
Anti-mouse CX3cr1 PE conjugado, Clone#SA011F11	Biolegend	149006
Anti-mouse bloco FC16/32 purificado CD16/32	Biolegend Inc	14-9760-80
MicroBeads Anti-PE	Miltenyi	130-105-639
Anti-coelho IgG, anticorpo ligado a HRP	e-bioscience	7074
Soro bovino Albumina	InvivoGen	tlrl-isdn
Colgenase tipo IV	Roche	1088866001
DAPI	SIGMA	D9542
DMEM	Corning	10013-CV
DNase I de pâncreas bovino	Roche	D263-5vl
Falcon® 40µ m Filtro de Células	Corning	352340
Kit de Solução de Fixação/Permeabilização com kit BD GolgiPlug BD	Bioscience	555028
FlowJo	FlowJo LLC	www.flowjo.com
Glicogênio	Roche	10901393001
Anticorpo Secundário de IgG (H+L) de Coelho, Alexa Fluor 488 conjugado	e-bioscience	5018
GraphPad Prism 7	GraphPad Software Inc	www.graphpad.com
H& Kit E Kit	American Mastertech	HXMMHPT
Imagem J	NIH	www.imagej.nih.gov/ij/
Mouse: C57BL/6J	Jackson Laboratories	664
MS Colunas	Miltenyi	130-042-201
Percol	GE Healthcare	17-0891-01
PMA/ Sal de ionomicina	Sigma	P8139
PowerUp SYBR Green Master Mix	Thermofisher	A25777
Coelho Anti rato GAPDH, Clone# D16H11	Sinalização celular	5174
Coelho Anti rato p70 S6 Quinase, Clone#49D7	Sinalização celular	2708
Coelho Anti rato Phospho-p70 S6 Quinase, Clone#S371	Sinalização celular	9208
Proteína Ribossômica Anti-S6 de Fosfo-S6 de Coelho (Ser235/236), Clone # D57.2.2E	Sinalização de Células	4858
Antí-Coelho de Camundongo S6 Sinalização de Célula de Proteína Ribossômica		2217
Rapamicina	LC LABORATORIES	1003799
TNBS	Sigma	92823
Kit de coloração de Trichorme	Kit Mastertech Americano	STOSTBPT
TRIzol	Life technologies	15596018
Verso cDNA Synthesis Kit	Thermofisher	AB1453B
Zen black 2.1	Carl Zeiss	www.zeis.com
Zen blue lite 2.3	Carl Zeiss	www.zeis.com