Artigo de método

Avaliação Hemodinâmica Invasiva para o Sistema Ventricular Direito e hipertensão arterial pulmonar induzida por hipóxia em camundongos

DOI:

10.3791/60090

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24 de outubro de 2019

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1Beijing Key Laboratory of Pre-clinical Research and Evaluation for Cardiovascular Implant Materials, State Key Laboratory of Cardiovascular Disease, Fuwai Hospital, National Centre for Cardiovascular Diseases, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, 2Laboratory Animal Center, Peking University, 3Center of Cardiac Surgery for Adults, State Key Laboratory of Cardiovascular Disease, Fuwai Hospital, National Centre for Cardiovascular Diseases, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College

Neste artigo

Resumo

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Aqui, apresentamos um protocolo para realizar uma avaliação hemodinâmica invasiva do ventrículo direito e artéria pulmonar em camundongos usando uma abordagem de cirurgia de caixa aberta.

Resumo

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A hipertensão arterial pulmonar (HAP) é uma doença cardiopulmonar crônica e grave. Os ratos são um modelo animal popular usado para imitar esta doença. No entanto, a avaliação da pressão ventricular direita (RVP) e da pressão pulmonar da artéria (PAP) permanece tecnicamente desafiadora em camundongos. RVP e PAP são mais difíceis de medir do que a pressão ventricular esquerda por causa das diferenças anatômicas entre os sistemas cardíaco esquerdo e direito. Neste artigo, descrevemos um método de medição hemodinâmica do coração direito estável e sua validação usando camundongos saudáveis e PAH. Este método é baseado na cirurgia open-chest e na sustentação mecânica da ventilação. É um procedimento complicado em comparação com procedimentos torácicos fechados. Enquanto um cirurgião bem treinado é necessário para esta cirurgia, a vantagem deste procedimento é que ele pode gerar parâmetros rvp e PAP ao mesmo tempo, por isso é um procedimento preferível para a avaliação dos modelos de HAP.

Introdução

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A hipertensão arterial pulmonar (HAP) é uma doença cardiopulmonar crônica e grave com elevação da pressão arterial pulmonar (PAP) e pressão ventricular direita (RVP) causada pela proliferação celular e fibrose de pequenas artérias pulmonares 1. Cateteres de artéria pulmonar, também chamados de cateteres Swan-Ganz2,são comumente usados no monitoramento clínico de RVP e PAP. Além disso, um sistema de monitoramento PAP sem fio tem sido usado clinicamente3,4,5. Para imitar a doença para estudo em camundongos, um ambiente hipóxico é usado para simular manifestações clínicas humanas da HAP6. Na avaliação do PAP em animais, os animais de grande porte são relativamente fáceis de monitorar através de cateteres de artéria pulmonar usando a mesma técnica que para os seres humanos, mas pequenos animais, como ratos e camundongos, são difíceis de avaliar por causa de seu pequeno tamanho corporal. A medida hemodinâmica do sistema ventricular direito em camundongos é possível com um cateter ultrapequeno tamanho 1 Fr7. Um método para medir RVP e PAP em camundongos tem sido relatado na literatura8,9, mas a metodologia carece de uma descrição detalhada. RVP e PAP são mais desafiadores para medir do que a pressão ventricular esquerda por causa das diferenças anatômicas entre os sistemas cardíaco esquerdo e direito.

Para obter parâmetros PAP e RVP no mesmo mouse, descrevemos uma abordagem baseada em cirurgia de caixa aberto para medições hemodinâmicas do coração direito, sua validação com camundongos saudáveis e PAH e como evitar a geração de dados artificiais durante o complicado peito aberto Cirurgia. Embora esta técnica seja melhor executada por um cirurgião bem treinado, tem a vantagem de poder avaliar pap e RVP no mesmo rato.

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Protocolo

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O protocolo animal foi revisado e aprovado pelo Institutional Animal Care and Use Committee no Fuwai Hospital, Chinese Academy of Medical Science, Peking Union Medical College (NO.0000287). Os animais experimentais foram alojados e alimentados de acordo com as diretrizes do bem-estar animal na China.

NOTA: Oito a 12 semanas de idade machos C57BL ratos foram alojados em um ambiente com um 12 h escuro / 12 h ciclo de luz. Os camundongos PAH foram alojados por 4 semanas uma concentração de oxigênio de 10%, mantidos por uma câmara de hipóxia controlada por oxigênio para induzir hipertensão pulmonar, e camundongos controle foram alojados no ar do quarto (21% de oxigênio) em condições idênticas. As medidas de RVP e PAP foram realizadas ao final das 4 semanas de desafio da hipóxia.

1. Preparação pré-operatória

  1. Mergulhe o cateter transdutor de pressão (tamanho: 1 Fr) em 0,9% de soro lógico à temperatura ambiente por pelo menos 30 min antes do experimento hemodinâmico.
  2. Filtrar a solução de 2,2,2-Tribromoetanol com filtro de 0,22 μm e armazenar em refrigerador de 4 graus.
  3. Prepare ferramentas e suprimentos de cirurgia limpos, como luvas para cirurgia.
  4. Prepare 10 mL de 1,0% de solução de enzimas digestivas para limpeza de cateter.
  5. Conecte o cateter transdutor de pressão a um sistema de volume de pressão.
  6. Calibrar o transdutor de pressão antes de obter medidas de pressão para cada mouse.
    1. Vire o botão de calibração para 0 mmHg e 25 mmHg para enviar um sinal de pressão de verificação para o software de aquisição de dados e configurar a configuração de calibração no software.
    2. Vire o botão para Transducer e ajuste o botão de equilíbrio para a linha de base zero.
  7. Configure um estereoscópio padrão e uma tabela cirúrgica animal pequena temperatura-controlada para a manutenção da temperatura de corpo durante a cirurgia.
  8. Configure um sistema de iluminação leve para microcirurgia para fornecer luz suficiente sobre a área cirúrgica.

2. Cirurgia de peito aberto e medição hemodinâmica

  1. Camundongos anestesios com 250 mg/kg de 2,2,2-Tribromoetanol via injeção intraperitoneal (i.p.). Se necessário, repita doses suplementares em 1/3 a 1/2 da dose original durante o procedimento.
  2. Retire a pele do peito e pescoço usando uma loção de barbear e depilação (Figura 1A, 2A).
  3. Fixe cada rato na posição supina em uma tabela cirúrgica animal pequena temperatura-controlada para ajudar a manter a temperatura de corpo (37 °C) durante a cirurgia.
  4. Limpe o local cirúrgico com 70% de etano.
  5. Uma vez que a anestesia está em vigor, confirme a indução adequada da anestesia usando uma pitada do dedo do dedo do dedo do dedo do dedo do dedo do dedo.
  6. Faça uma incisão midline na pele do pescoço(Figura 1A).
  7. Dissecar o músculo esquelético usando fórceps curvos e expor a traqueia (Figura 1B, 1C).
  8. Realize a intubação pela boca usando um cateter de bainha intravenosa modificado de 22 G. Confirme que a tubulação está na traqueia usando fórceps (Figura 1D).
  9. Ligue a tubulação a um pequeno ventilador de animais. Calcule e defina taxa de respiração e volume de marés com base no peso corporal de acordo com o manual do usuário do ventilador10. Por exemplo, defina a taxa de respiração para 133/min e volume de marés para 180 μL para um mouse de 30 g com base no cálculo descrito.
  10. Fixe a tubulação para ventilação usando a fita adesiva.
  11. Confirme a indução adequada da anestesia usando uma pitada do dedo do dedo do dedo do dedo do dedo.
  12. Faça uma incisão midline na pele do peito e dissecar cuidadosamente os músculos do peito usando uma ferramenta cautery (Figura 2B, 2C).
  13. Corte o esterno usando uma tesoura no meio e exponha a cavidade torácica(Figura 2D).
  14. Evite qualquer sangramento usando a ferramenta cautery durante o procedimento de cirurgia de caixa aberta.
  15. Expor o ventrículo direito com os retratores(Figura 2E).
  16. Insira o cateter transdutor de pressão salina através de um pequeno túnel criado com uma agulha de 25 G no ventrículo direito para medir RVP (Figura 2F e Figura 3A, 3C).
  17. Segure o cabo de cateter e atravesse a válvula pulmonar de forma coaxial com a artéria pulmonar. Observe a forma de onda de pressão e obtenha um sinal PAP estável (Figura 3B, 3D).
  18. Registre dados hemodinâmicos usando o sistema e o software de aquisição de dados.
  19. Após as medições finais, eutanásia ratos humanamente através de injeção de i.p. de uma dose excessiva de 2,2,2-Solução de Tribromoetanol.
  20. Retire cuidadosamente o cateter do sistema cardíaco direito e coloque em uma seringa de 1 mL contendo 1% de solução de enzima digestiva.
  21. Use água destilada para lavar continuamente o cateter com cuidado e armazená-lo na caixa original.

3. Análise de dados para hemodinâmica

NOTA: Os dados hemodinâmicos foram registrados e analisados usando o software de análise11 (Tabela de Materiais).

  1. Para cada mouse, selecione pelo menos 10 ciclos cardíacos contínuos e estáveis sem ruído para obter os dados médios dos dados de RVP ou PAP para cada parâmetro.
  2. Use o teste tdo estudante para comparar os grupos normais do controle de ar e da hipóxia. NOTA: p < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo. Os dados são apresentados como a média ± SD.

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Resultados

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O cateter transdutor de pressão foi inserido no ventrículo direito(Figura 3A)através de um túnel expandido por uma agulha de 25 G, e uma forma de onda RVP típica (Figura 3C)foi obtida. O cateter foi continuamente ajustado e avançado lentamente e mantido no mesmo eixo que a artéria pulmonar ao passar pela válvula pulmonar(Figura 3B). Quando o sensor de pressão foi inserido com sucess...

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Discussão

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A intubação do traqueal é a primeira etapa importante para cirurgias da aberto-caixa. O método clássico de intubação traqueal para pequenos animais, como ratos ou camundongos, envolve fazer uma incisão em forma de T na traqueia e inserir diretamente tubos traqueais do tipo Y na traqueia. Na prática, descobrimos que este método não é fácil durante a operação. A tubulação do traqueal do Tipo Y é muito grande para pequenos animais e forma um ângulo com a traqueia. Assim, é difícil reparar a tubulação no lugar. Além disso, u...

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Divulgações

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Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

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Esta pesquisa é apoiada pelo Projeto de Pós-Graduação em Educação e Reforma Do Ensino da Faculdade de Medicina da União de Pequim (10023-2016-002-03), pelo Fuwai Hospital Youth Fund (2018-F09) e pelo Fundo diretor do Laboratório-Chave de Pesquisa Pré-clínica de Pequim e Avaliação de Materiais de ImplanteS Cardiovasculares (2018-PT2-ZR05).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
2,2,2-TribromoethanolSigma-AldrichT48402-5Gpara o
controlador de temperatura animalPhysitemp Instruments da anestesia, Inc.TCAT-2LVPara controle de temperatura
Pinça de dissecçãoFine Science Tools, Inc.11274-20Para cirurgia
Gemini Cautery SystemGeminiGEM 5917Para cirurgia
Cateter intravenoso (22G)BD angiocath381123Para intubação
LabChart 7.3ADInstrumentsPara análise de dados
Sistema de iluminação de luzOlympusPara cirurgia
Cateter Mikro-TipMillar Instruments, Houston, TXSPR-1000Para medição de pressão
Millar Pressure-Volume SystemsMillar Instruments, Houston, TXMVPS-300Para medição de pressão
Controlador de O2 e câmara de hipóxiaBiospherixProOx 110Para hipóxia crônica
Sistema de aquisição de dados PowerLabADInstrumentsPowerLab 16/30Para gravação de
dados TesouraFerramentas de Belas Ciências, Inc.14084-08Para cirurgia
Ventilador para pequenos animaisHarvard ApparatusMini-Vent 845Para cirurgia
EstereomicroscópioOlympusSZ61Para cirurgia
Fita cirúrgica3MPara cirurgia
Enzima Terg-a-zymeSigma-AldrichZ273287-1EAPara limpeza de cateteres

Referências

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  1. Humbert, M., et al. Advances in therapeutic interventions for patients with pulmonary arterial hypertension. Circulation. 130 (24), 2189-2208 (2014).
  2. Chatterjee, K. The Swan-Ganz catheters: past, present, and future: a viewpoint. Circulation. 119 (1), 147-152 (2009).
  3. Adamson, P. B., et al. CHAMPION trial rationale and design: the long-term safety and clinical efficacy of a wireless pulmonary artery pressure monitoring system. Journal of Cardiac Failure. 17 (1), 3-10 (2011).
  4. Abraham, W. T., et al. Wireless pulmonary artery haemodynamic monitoring in chronic heart failure: a randomised controlled trial. The Lancet. 377 (9766), 658-666 (2011).
  5. Adamson, P. B., et al. Wireless pulmonary artery pressure monitoring guides management to reduce decompensation in heart failure with preserved ejection fraction. Circulation: Heart Failure. 7 (6), 935-944 (2014).
  6. Shatat, M. A., et al. Endothelial Kruppel-like Factor 4 modulates pulmonary arterial hypertension. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 50 (3), 647-653 (2014).
  7. SPR-1000 Mouse Pressure Catheter. , Available from: https://millar.com/products/research/pressure/single-pressure-no-lumen/spr-1000 (2019).
  8. Tabima, D. M., Hacker, T. A., Chesler, N. C. Measuring right ventricular function in the normal and hypertensive mouse hearts using admittance-derived pressure-volume loops. American Journal of Physiology Heart and Circulatory Physiology. 299 (6), 2069-2075 (2010).
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  10. Harvard Inspira Advanced Safety Ventilator User's Manual. , Available from: http://www.harvardapparatus.com/media/harvard/pdf/Inspira_557058_9.pdf. (2019).
  11. LabChart. , Available from: https://www.adinstruments.com/products/labchart?creative=290739105773_keyword=labchart_matchtype=e_network=g_device=_gclid=CjwKCAjwxrzoBRBBEiwAbtX1n42I2S06KmccVncUHkmExU8KKOXXREyzx8bvTrxYMSze-ooE0atcbRoCliwQAvD_BwE (2019).
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  18. Bueno-Beti, C., Hadri, L., Hajjar, R. J., Sassi, Y. The Sugen 5416/Hypoxia mouse model of pulmonary arterial hypertension. Experimental Models of Cardiovascular Diseases. Methods in Molecular Biology. vol 1816. Ishikawa, K. , Humana Press. New York, NY. (2018).

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