Method Article

Caracterização de vesículas extracelulares derivadas de células imunes e estudo do impacto funcional no ambiente celular

DOI:

10.3791/60118

⸱

June 2nd, 2020

 ,  ,  ,  , 
1U1192-Laboratoire Protéomique, Réponse Inflammatoire et Spectrométrie de Masse (PRISM), Univ. Lille, INSERM

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O presente relatório destaca os requisitos cronológicos para o isolamento da vesícula extracelular (EV) de microglia ou macrófagos sanguíneos. Os EVs derivados de microglia foram avaliados como reguladores do crescimento do neurite, enquanto os EVs derivados do macrófago sanguíneo foram estudados no controle da invasão celular C6 glioma em ensaios in vitro. O objetivo é entender melhor essas funções de EV como mediadores imunológicos em microambientes específicos.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O estado neuroinflamatório do sistema nervoso central (SNC) desempenha um papel fundamental nas condições fisiológicas e patológicas. Microglia, as células imunes residentes no cérebro, e às vezes os macrófagos derivados da medula óssea (BMDMs), regulam o perfil inflamatório de seu microambiente no CNS. Aceita-se agora que as populações de vesícula extracelular (EV) de células imunes agem como mediadores imunológicos. Assim, sua coleta e isolamento são importantes para identificar seus conteúdos, mas também avaliar seus efeitos biológicos sobre as células receptoras. Os dados atuais destacam os requisitos cronológicos para o isolamento de EV de células microglia ou macrófagos sanguíneos, incluindo as etapas de ultracentrugação e exclusão de tamanho (SEC). Uma análise proteômica não direcionada permitiu a validação de assinaturas proteicas como marcadores EV e caracterizou o conteúdo de EV biologicamente ativo. Os EVs derivados de microglia também foram usados funcionalmente na cultura primária dos neurônios para avaliar sua importância como mediadores imunológicos no crescimento de neurite. Os resultados mostraram que os EVs derivados de microglia contribuem para facilitar o crescimento do neurite in vitro. Em paralelo, os EVs derivados do macrófago sanguíneo foram usados funcionalmente como mediadores imunológicos em culturas eferóides de células glioma C6, os resultados mostrando que esses EVs controlam a invasão celular glioma in vitro. Este relatório destaca a possibilidade de avaliar as funções de células imunes mediadas pelo EV, mas também entender as bases moleculares de tal comunicação. Essa decifração poderia promover o uso de vesículas naturais e/ou a preparação in vitro de vesículas terapêuticas, a fim de imitar propriedades imunes no microambiente das patologias do SNC.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Muitas neuropatologias estão relacionadas ao estado neuro-inflamatório, que é um mecanismo complexo que é cada vez mais considerado, mas ainda mal compreendido porque os processos imunológicos são diversos e dependem do ambiente celular. De fato, os transtornos do SNC não envolvem sistematicamente os mesmos sinais de ativação e populações de células imunes e, portanto, as respostas pró ou anti-inflamatórias são difíceis de avaliar como causas ou consequências das patologias. Os macrófagos residentes no cérebro chamados "microglia" parecem estar na interface entre o sistema nervoso e imunológico1. A microglia tem origem mielóide e é derivada do ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Cultura Primária de Microglia/Macrófagos

  1. Cultura primária da microglia
    1. Microglia primária de rato comercial de cultura (2 x 106 células) (ver a Tabela de Materiais) no meio de Águia modificada (DMEM) modificado de Dulbecco, complementado com soro 10% livre de exosome, 100 U/mL de penicilina, 100 μg/mL streptomicina e 9,0 g/L de glicose a 37 °C e 5% DE CO2.
    2. Colete o meio condicionado após uma cultura de 48h e prossiga para o isolamento dos EVs.
  2. Cultura primária dos macrófagos
    1. Macrófagos primários de ratos comerciais de cultura (1....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Um dos principais desafios para atribuir efeitos biológicos a vesículas extracelulares (EVs) é a capacidade de isolar os EVs de todo o meio da cultura. Neste relatório, apresentamos um método utilizando a ultrassom (UC) e a cromatografia de exclusão de tamanho (SEC) que está acoplado à análise em larga escala de assinaturas proteicas para validar marcadores EV e identificar compostos bioativos. Os EVs derivados de macrófago ou microglia foram isolados do meio condicionado após uma cultura de 24 h ou 48h, respectivamente<.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O sistema nervoso central (SNC) é um tecido complexo no qual a comunicação célula-celular regula as funções neuronais normais necessárias para a homeostase30. Os EVs são agora amplamente estudados e descritos como importantes cargas moleculares para a comunicação célula-celular31. Eles fornecem especificamente um coquetel de mediadores para células receptoras, afetando assim suas funções em condições saudáveis e patológicas32. Estudos recentes indica.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O trabalho apresentado contou com o apoio da Ministère de L'Education Nationale, de L'Enseignement Supérieur et de la Recherche e INSERM. Agradecemos o BICeL- Campus Scientific City Facility pelo acesso a instrumentos e conselhos técnicos. Agradecemos a Jean-Pascal Gimeno, Soulaimane Aboulouard e Isabelle Fournier pela assistência de espectrometria de massa. Agradecemos tanina árabe, Christelle van Camp, Françoise le Marrec-Croq, Jacopo Vizioli e Pierre-Eric Sautière por sua forte contribuição para os desenvolvimentos científicos e técnicos.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
12% Mini-PROTÉICO  TGX Géis de Proteína Pré-moldadosBio-rad4561045EDU 
AcetonitrilaFisher ChemicalsA955-1 
Filtro centrífugo Amicon 50 kDaMerckUFC505024 
Bicarbonato de amônioSigma-Aldrich9830 
HSP90 (RRID: AB_675659)Santa-cruzsc-13119 
Suplemento B27 PlusGibcoA3582801 
Misturador de Vórtice BenchMixer V2Benchmark ScientificBV1003 
Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate (Bradford)Bio-Rad5000006 
C18 ZipTipsMerck MilliporeZTC18S096 
Célula de glioma de rato C6ATCC ATCCCCL-107 
Tubos canônicosSarstedt62.554.002 
CentrífugaEppendorf5804000010 
Incubadora CO2ThermoFisher  
Microscópio confocal LSM880Carl ZeissLSM880 
Tampa de vidroMarienfeld111580 
Prato de Cultura (60 mm)Sarstedt82.1473 
DitiotreitolSigma-Aldrich43819 
DMEMGibco41966029 
Cromatógrafo Líquido EASY-nLC 1000ThermoFisher  
Microscópio eletrônico JEM-2100JEOL&nbsp; 
Ácido etilenoglicol-bis(2-aminoetiléter)-N,N,N′,N′-tetracéticoSigma-Aldrich03777-10G 
Ácido etilenodiaminotetracéticoSigma-AldrichED-100G 
Exo-FBSOzymeEXO-FBS-50A-1Exossomo esgotado FBS
ExoCarta banco de dados (top 100 proteínas de Evs)  http://www.exocarta.org/
Soro Fetal BovinoGibco16140071 
Soro Fetal de CavaloBiowestS0960-500 
Filtropur S 0.2Sarstedt83.1826.001 
Marca Fisher  Sonda Q500 Sonicator com SondaFisherbrand12893543 
FlexAnalysisBrucker  
Meio de montagem de fluorescênciaAgilentS3023 
Ácido fórmicoSigma-Aldrich695076 
Grades de cobre revestidas de carbono FormvarAgar scientific LtdAGS162-3 
GlicoseSigma-AldrichG8769 
GlutaraldeídoSigma-Aldrich340855 
Hoechst 33342Euromedex17535-AAT 
IdoacetamidaSigma-AldrichI1149 
InstantBlue Coomassie Protein StainExpedeonISB1L 
Microscópio de luz invertida CKX53Olympus  
L-glutaminaGibco25030-024 
LabTek II 8 poços  Nunc154534 
Laemmli 2xBio-Rad1610737 
LamininCorning354232 
Software MaxQuant (software de identificação de proteínas)  https://maxquant.net/maxquant/
MBT polonês stellBrucker8268711 
MEM 10xGibco21090-022 
MetilceluloseSigma-AldrichM6385-100G 
Água MiliQMerck Millipore  
Regilait de LeiteREGILAIT300 
Mini PROTEAN Célula de Eletroforese VerticalBio-Rad1658000FC 
Coluna FPLC MonoPGE Healthcare não está mais disponível
Nanosight NS300Malvern PanalyticalNS300 
Software NanoSight NTA v3.2Malvern Panalytical  
Bomba de seringa NanoSightMalvern Panalytical  
Gibco Neurobasal21103-049 
Membrana de nitroceluloseGE Healthcare10600007 
Nonidet P-40Fluka56741 
Nunc multidish 24 poçosThermoFisher82.1473 
ParaformaldeídoEletromicroscopia Ciência15713 
Linha celular PC-12ATCCATCC CRL-1721 
Penicilina-EstreptomicinaGibco15140-122 
Mistura de calibração de peptídeosLaserBio LabsC101 
Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch115-035-003 
Software Perseus (Processamento de proteínas identificadas)  https://maxquant.net/perseus/
Conjugado de faloidina-tetrametilrodaminaSanta-cruzsc-362065 
Fluoreto de fenilmetanosulfonilSigma-Aldrich78830 
Tampão de fosfato SalinoInvitrogen14190094sem cálcio, sem magnésio
pluriFiltro M/ 60 µ mpluriSelect43-50060 
Poli-D-lisinaSigma-AldrichP6407 
Tubos de centrífuga em policarbonatoBeckman Coulter355651 
Inibidor de ProteaseSigma-AldrichS8830-20TAB 
PureColCell Systems5005 
Espectrômetro de massa Q-ExactiveThermoFisher  
espectrômetro de massas rapifleXBrucker  
Neurônios corticais de ratoAplicações celularesR882N-20Origem celular: Derivado de córtices cerebrais do dia 18 cérebros embrionários de ratos Sprague Dawley
Macrófagos de rato & Meio de Cultura MicrogliaAplicações CelularesR620K-100Origem celular: Medula óssea de rato normal e saudável
Macrófagos primários de ratoAplicações celularesR8818-10a 
Microglia primária de ratoLonzaRG535 
Sepharose CL-2BGE Healthcare17014001 
Tripsina Modificada de Grau de SequenciamentoPromegaV5111 
DeslizeDustsher100204 
Cloreto de SódioScharlauSO0227 
Dodecil Sulfato de SódioSigma-AldrichL3771 
Fluoreto de SódioSigma-AldrichS7920-100G 
Hidróxido de sódioScharlabSO0420005P 
Pirofosfato de sódioSigma-AldrichS6422-100G 
Concentrador de Vácuo SpeedVacThermoFisher  
Software de cordas (redes de associação de proteínas funcionais)  https://string-db.org/
Substrato de Duração Prolongada SuperSignal West DuraThermoFisher34075 
Seringa 1.0 mLTerumo8SS01H1 
Célula de transferência semi-seca Trans-Blot SDBio-Rad1703940 
Ácido trifluoroacéticoSigma-AldrichT6508 
TrisInterchimUP031657 
Tris-GlicinaEuromedexEU0550 
Interpolação 20Sigma-AldrichP2287 
UltracentrífugaBeckman CoulterA95765 
Rotor de Ultracentrífuga 70.1 TiBeckman Coulter342184 
Acetato de uranilaAgar Scientific LtdAGR1260A 
Papel de filtro WhatmanSigma-AldrichWHA10347510 
Ácido &alfa;-ciano-4-hidroxicinâmicoSigma-AldrichC2020-25G 

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Thion, M. S., Ginhoux, F., Garel, S. Microglia and early brain development: An intimate journey. Science. 362 (6411), 185-189 (2018).
  2. Ginhoux, F., et al. Fate mapping analysis reveals that adult microglia derive from primitive macrophages. Science. 330<....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Extracellular VesiclesImmune CellsUltracentrifugationSize Exclusion ChromatographyNanoparticle Tracking AnalysisWestern BlotProteomics AnalysisNeurite OutgrowthGlioma Cell InvasionMicroglia derived EVs

Related Articles