Caracterização de vesículas extracelulares derivadas de células imunes e estudo do impacto funcional no ambiente celular

Quentin Lemaire; Marie Duhamel; Antonella Raffo-Romero; Michel Salzet; Christophe Lefebvre

doi:10.3791/60118

Artigo de método

Caracterização de vesículas extracelulares derivadas de células imunes e estudo do impacto funcional no ambiente celular

DOI:

10.3791/60118

⸱

2 de junho de 2020

Quentin Lemaire¹ , Marie Duhamel¹ , Antonella Raffo-Romero¹ , Michel Salzet¹ , Christophe Lefebvre¹

¹U1192-Laboratoire Protéomique, Réponse Inflammatoire et Spectrométrie de Masse (PRISM), Univ. Lille, INSERM

Neste artigo

Resumo

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O presente relatório destaca os requisitos cronológicos para o isolamento da vesícula extracelular (EV) de microglia ou macrófagos sanguíneos. Os EVs derivados de microglia foram avaliados como reguladores do crescimento do neurite, enquanto os EVs derivados do macrófago sanguíneo foram estudados no controle da invasão celular C6 glioma em ensaios in vitro. O objetivo é entender melhor essas funções de EV como mediadores imunológicos em microambientes específicos.

Resumo

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O estado neuroinflamatório do sistema nervoso central (SNC) desempenha um papel fundamental nas condições fisiológicas e patológicas. Microglia, as células imunes residentes no cérebro, e às vezes os macrófagos derivados da medula óssea (BMDMs), regulam o perfil inflamatório de seu microambiente no CNS. Aceita-se agora que as populações de vesícula extracelular (EV) de células imunes agem como mediadores imunológicos. Assim, sua coleta e isolamento são importantes para identificar seus conteúdos, mas também avaliar seus efeitos biológicos sobre as células receptoras. Os dados atuais destacam os requisitos cronológicos para o isolamento de EV de células microglia ou macrófagos sanguíneos, incluindo as etapas de ultracentrugação e exclusão de tamanho (SEC). Uma análise proteômica não direcionada permitiu a validação de assinaturas proteicas como marcadores EV e caracterizou o conteúdo de EV biologicamente ativo. Os EVs derivados de microglia também foram usados funcionalmente na cultura primária dos neurônios para avaliar sua importância como mediadores imunológicos no crescimento de neurite. Os resultados mostraram que os EVs derivados de microglia contribuem para facilitar o crescimento do neurite in vitro. Em paralelo, os EVs derivados do macrófago sanguíneo foram usados funcionalmente como mediadores imunológicos em culturas eferóides de células glioma C6, os resultados mostrando que esses EVs controlam a invasão celular glioma in vitro. Este relatório destaca a possibilidade de avaliar as funções de células imunes mediadas pelo EV, mas também entender as bases moleculares de tal comunicação. Essa decifração poderia promover o uso de vesículas naturais e/ou a preparação in vitro de vesículas terapêuticas, a fim de imitar propriedades imunes no microambiente das patologias do SNC.

Introdução

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Muitas neuropatologias estão relacionadas ao estado neuro-inflamatório, que é um mecanismo complexo que é cada vez mais considerado, mas ainda mal compreendido porque os processos imunológicos são diversos e dependem do ambiente celular. De fato, os transtornos do SNC não envolvem sistematicamente os mesmos sinais de ativação e populações de células imunes e, portanto, as respostas pró ou anti-inflamatórias são difíceis de avaliar como causas ou consequências das patologias. Os macrófagos residentes no cérebro chamados "microglia" parecem estar na interface entre o sistema nervoso e imunológico¹. A microglia tem origem mielóide e é derivada do saco de gema durante hematopeiese primitiva para colonizar o cérebro, enquanto macrófagos periféricos são derivados do fígado fetal durante hematopoiese definitiva para se tornarem macrófagos periféricos². As células microglia se comunicam com neurônios e células gliais derivadas de neurônios, como astrócitos e oligodendrócitos³. Vários estudos recentes demonstraram que a microglia está envolvida na plasticidade neuronal durante o desenvolvimento do CNS e na homeostase do tecido adulto, e também no estado inflamatório associado às doenças neurodegenerativas^4,^,⁵. Caso contrário, a integridade da barreira cerebral sanguínea pode ser comprometida em outras patologias do CNS. As respostas imunes, especialmente no câncer multiforme glioblastoma, não são suportadas apenas por células microglia, pois a barreira cerebral sanguínea é reorganizada através de processos angiogênicos e a presença de vasos linfáticos^6,^,⁷. Portanto, uma grande infiltração de macrófagos derivados da medula óssea (BMDMs) ocorre no tumor cerebral ao longo de mecanismos de angiogênese dependentes do tumor⁸. As células cancerígenas exercem uma influência significativa sobre os BMDMs infiltrados que levam a propriedades imunossupressores e crescimento do tumor⁹. Assim, a comunicação entre as células imunes e seu microambiente cerebral é difícil de entender, pois a origem celular e os sinais de ativação são diversos¹⁰^,¹¹. É, portanto, interessante apreender as funções de assinaturas moleculares associadas às células imunes em condições fisiológicas. Nesse sentido, a comunicação celular-celular entre células imunes e microambiente celular pode ser estudada através da liberação de vesículas extracelulares (EVs).

Os EVs estão sendo estudados cada vez mais na regulação das funções imunológicas em condições saudáveis e patológicas¹²^,¹³. Duas populações, exosóis e microvesículos, podem ser levadas em conta. Eles apresentam diferentes biogêneses e faixas de tamanho. Os exossomos são vesículas de ~30-150 nm de diâmetro e são gerados a partir do sistema endosomal e secretados durante a fusão de corpos multivesiculares (MVBs) com a membrana plasmática. Os microvesículos têm cerca de 100-1.000 nm de diâmetro e são gerados por um brotamento externo da membrana plasmática^{celular 14}. Como a discriminação exósia versus microvesícula ainda é difícil de perceber de acordo com o tamanho e os padrões moleculares, usaremos apenas o termo EVs no presente relatório. A comunicação associada ao EV no CNS representa um mecanismo ancestral, uma vez que estudos mostraram seu envolvimento em espécies invertebradas, incluindo nematoides, insetos ou annelids¹⁵^,¹⁶. Além disso, os resultados que mostram que os EVs podem se comunicar com células de diferentes espécies demonstram que esse mecanismo é um sistema de bloqueio de chaves, baseado primeiro no reconhecimento de moléculas superficiais entre vesículas e células receptoras e, em seguida, permitindo a absorção de mediadores^16,^,¹⁷. De fato, os EVs contêm muitas moléculas como proteínas (por exemplo, enzimas, transdução de sinais, fator biogênese), lipídios (por exemplo, ceramida, colesterol) ou ácidos nucleicos (por exemplo, DNA, mRNA ou miRNAs) agindo como reguladores diretos ou indiretos das atividades celulares receptoras¹⁴. É por isso que estudos metodológicos também foram realizados em células imunes para isolar EVs e caracterizar plenamente suas assinaturas proteicas¹⁸^,¹⁹.

Os primeiros estudos demonstraram a liberação de exosóis da microglia primária cultivada como um mecanismo indutor após uma ativação Wnt3a ou dependente de serotonina²⁰^,²¹. Funcionalmente no CNS, os EVs derivados de microglia regulam a liberação de vesícula sináptica por terminais pré-sinápticos em neurônios que contribuem para o controle da excitabilidade neuronal²²^,²³. EVs derivados de microglia também poderiam propagar a resposta inflamatória mediada por citocinas em grandes regiões cerebrais²⁴^,²⁵. É importante ressaltar que os diversos ligantes para a família receptora de pedágio podem ativar produções específicas de EVs na microglia²⁶. Por exemplo, estudos in vitro mostram que as linhas celulares Microglia BV2 ativadas pelo LPS produzem conteúdoes diferenciados de EV, incluindo citocinas pró-inflamatórias²⁷. Portanto, a diversidade funcional de subpopulações de células imunes no CNS, microglia e BMDMs infiltrados, pode ser avaliada através de suas próprias populações de EV, incluindo o impacto do EV nas células receptoras e a identificação de conteúdos de EV.

Descrevemos anteriormente métodos para avaliar as propriedades funcionais dos EVs derivados de microglia e BMDM após seu isolamento¹⁶^,¹⁹. No presente relatório, propomos avaliar independentemente o efeito dos EVs derivados de microglia no crescimento do neurite e o efeito dos EVs derivados do macrófago no controle de agregados celulares glioma. Este estudo também propõe uma ampla análise proteômica das frações de EV, a fim de validar o procedimento de isolamento do EV, bem como identificar as assinaturas proteicas biologicamente ativas. Os efeitos benéficos e a decifração molecular do conteúdo de EV poderiam ajudar sua possível manipulação e uso como agentes terapêuticos em distúrbios cerebrais.

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Protocolo

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1. Cultura Primária de Microglia/Macrófagos

Cultura primária da microglia
1. Microglia primária de rato comercial de cultura (2 x 10⁶ células) (ver a Tabela de Materiais) no meio de Águia modificada (DMEM) modificado de Dulbecco, complementado com soro 10% livre de exosome, 100 U/mL de penicilina, 100 μg/mL streptomicina e 9,0 g/L de glicose a 37 °C e 5% DE CO₂.
2. Colete o meio condicionado após uma cultura de 48h e prossiga para o isolamento dos EVs.
Cultura primária dos macrófagos
1. Macrófagos primários de ratos comerciais de cultura (1 x 10⁶ células) no meio fornecido pelo fabricante (ver a Tabela de Materiais) a 37 °C e 5% de CO_2,com soro exossomo livre.
2. Colete o meio condicionado após uma cultura de 24h e prossiga para o isolamento dos EVs.

2. Isolamento de EVs

Pré-isolamento de EVs de meios condicionados
1. Transfira o meio de cultura condicionada de culturas microglia ou macrófago (passos 1.1.2 ou 1.2.2) para um tubo cônico.
2. Centrifugar a 1.200 x g por 10 min a temperatura ambiente (RT) para pelotar as células.
3. Transfira o supernatante para um novo tubo cônico. Centrifugar a 1.200 x g por 20 min no RT para eliminar corpos apoptóticos.
4. Transfira o supernatante para um tubo de policarbonato de 10,4 mL e transfira o tubo para um rotor Ti de 70,1. Ultracentrifuuge a 100.000 x g por 90 min a 4 °C para pelotar os EVs.
5. Descarte o supernascimento e resuspenque a pelota contendo EVs em 200 μL de 0,20 μm de tampão de fosfato filtrado (PBS).
Isolamento de EVs
1. Elaboração da coluna de cromatografia de exclusão de tamanho caseiro (SEC)
  1. Esvazie uma coluna de cromatografia de vidro (comprimento: 26 cm; diâmetro: 0,6 cm) (ver a Tabela dos Materiais),lave e esterilize-a.
  2. Coloque um filtro de 60 μm na parte inferior da coluna.
  3. Empilhe a coluna com matriz de base de filtragem de gel de agarose cruzada para criar uma fase estacionária de 0,6 cm de diâmetro e uma altura de 20 cm.
  4. Enxágüe a fase com 50 mL de PBS filtrado de 0,20 μm. Armazene a 4 °C para ser usado mais tarde, se necessário.
2. Coloque a pelota EV resuspended em cima da fase estacionária da coluna SEC.
3. Colete 20 frações sequenciais de 250 μL enquanto continua adicionando PBS filtrado de 0,20 μm na parte superior da fase estacionária para evitar a secagem da coluna. Armazene as frações a -20 °C, se necessário.
  NOTA: Um armazenamento maior do que uma semana pode ser realizado a -80 °C para manter a integridade do EV para análise molecular.
A análise de espectrometria de massa da ionização de massa de desorpção a laser assistida por matriz (MALDI) das frações SEC
1. Prossiga para o isolamento EV conforme descrito na seção 2.2.
2. Resuspene a pelota EV com 200 μL de solução de mistura de calibração de peptídeo (ver a Tabela de Materiais).
3. Prossiga para a coleta de EV conforme descrito nas seções 2.2.1 a 2.2.3.
4. Seque completamente a fração com um concentrador de vácuo.
5. Reconstituir as frações com 10 μL de ácido trifluoroacético (TFA).
6. Misture 1 μL de fração reconstituída com 1 μL de matriz de ácido α-ciano-4-hidroxicinâmico (HCCA) em uma placa de aço polida MALDI.
7. Analise todas as frações com um espectrômetro de massa MALDI.
8. Analisar espectros gerados com software dedicado (ver Tabela de Materiais).

3. Caracterização de EVs

Análise de rastreamento de nanopartículas (NTA)
NOTA: A análise NTA é realizada com um instrumento de análise de rastreamento de nanopartículas (ver a Tabela de Materiais) e uma bomba de seringa automatizada.
1. Faça uma diluição (intervalo de 1:50 a 1:500) de cada fração SEC a partir da etapa 2.2.3 com PBS filtrado de 0,20 μm.
2. Vórtice a solução para eliminar agregados EV.
3. Coloque a solução diluída em uma seringa de 1 mL e coloque-a na bomba de seringa automatizada.
4. Ajuste a configuração da câmera para o nível de ganho de tela (3) e o nível da câmera (13).
5. Clique em Executar e inicie o script a seguir.
  1. Carregar a amostra na câmara de análise (taxa de infusão: 1.000 para 15 s).
  2. Diminuir e estabilizar o fluxo de velocidade para gravação de vídeo (taxa de infusão: 25 para 15 s). Capture três vídeos consecutivos de 60 s do fluxo de partículas.
  3. Ajuste o nível da câmera (13) e o limiar de detecção (3) antes da análise dos vídeos. Clique em Configurações| Ok para iniciar a análise e clique em Exportar quando a análise for feita.
6. Entre cada análise de fração, lave com 1 mL de PBS filtrado de 0,20 μm.
Análise de microscopia eletrônica (EM)
1. Isole os EVs descritos na seção 2.
  NOTA: Condições estéreis não são necessárias.
2. Repita a seção 3.1 para quantificar os EVs.
  NOTA: Apenas frações positivas serão usadas para análise EM.
3. Use um filtro centrífugo de 50 kDa (ver Tabela de Materiais) para concentrar frações SEC contendo EV.
4. Resuspend EVs concentrados em 30 μL de 2% paraformaldeído (PFA).
5. Carregue 10 μL da amostra em uma rede de cobre revestida de carbono.
6. Incubar por 20 minutos em um ambiente molhado.
7. Repita as etapas 3.2.5 e 3.2.6 para uma boa absorção da amostra na grade.
8. Transfira a rede para uma queda de 1% de glutaraldeído na PBS por 5 min na RT.
9. Lave a amostra com água ultrauso várias vezes.
10. Contraste a amostra por 10 minutos no gelo com uma mistura de acetato de 4% de urilo e 2% de metilcelulose (1:9, v/v). Remova o excesso da mistura usando um papel filtro.
11. Seque a amostra e observe-a sob um microscópio eletrônico de transmissão a 200 kV (ver a Tabela de Materiais).
Análise de manchas ocidentais
1. Extração de proteínas
  1. Repita as etapas 3.2.1 a 3.2.3 para isolar e concentrar EVs.
  2. Misture 50 μL de tampão RIPA (cloreto de sódio de 150 mM [NaCl], 50 mM Tris, 5 mM Ethylene glycol-bis (2-aminoetil)-N,N′,N′,N′-tetraacetic acid [EGTA], 2 mM Ethylenediamina-tetraacético ácido [EDTA], Flúor de sódio de 100 mM [NaF], pirofosfato de sódio de 10 mM, 1% Não-ide P-40, 1 mM De físride de fenilmetanossulfonil [PMSF], 1x inibidor de protease) com a amostra de EV (25 μL resultante da concentração de EV no filtro) para 5 min no gelo para extrair proteínas.
  3. Sonicate para 5 s (amplitude: 500 W; frequência: 20 kHz), 3 vezes no gelo.
  4. Remova os detritos vesiculares por centrifugação a 20.000 x g por 10 minutos, a 4 °C.
  5. Colete o supernante e meça a concentração de proteínas com o método de ensaio proteico de Bradford.
2. Sulfato de sulfato de sódio eletroforese de gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) e mancha ocidental
  1. Misture extratos de proteína (30 μg) com tampão amostral de Laemmli 5c (v/v).
  2. Carregue a mistura de proteína em um gel de poliacrilamida de 12%.
  3. Migrem as proteínas no gel com tampão TGS (25 mM Tris pH 8,5, 192 mM Glycine e 0,1% SDS), a 70 V para 15 min e 120 V por 45 min.
  4. Transfira as proteínas para a membrana nitrocelulose com sistema semi-seco a 230 V por 30 minutos.
  5. Saturar a membrana por 1h em RT com tampão de bloqueio (0,05% Tween 20 w/v, 5% leite em pó em pó em 0,1 M PBS, pH 7.4).
  6. Incubar a membrana durante a noite a 4 °C com anticorpo anti-choque térmico monoclonal do rato 90 (HSP90) anticorpo diluído no tampão de bloqueio (1:100).
  7. Lave a membrana três vezes com PBS-Tween (PBS, 0,05% Tween 20 w/v) por 15 min.
  8. Incubar a membrana por 1 h no RT com rabanete de rabanete de rabanete conjugado anticorpo secundário IgG diluído em tampão de bloqueio (1:10.000).
    NOTA: Um controle negativo é realizado usando anticorpos secundários sozinho.
  9. Repita a etapa de lavagem (passo 3.3.2.7).
  10. Revele a membrana com chemiluminescence aprimorada (ECL) kit de substrato ocidental (ver Tabela de Materiais).
Análise proteômica
1. Extração de proteínas e digestão em gel
  1. Repita as etapas 3.2.1 a 3.2.3 para isolar e concentrar os EVs. Repita o passo 3.3.1 para extração de proteína EV.
  2. Realize a migração de proteínas no gel de empilhamento de um gel de poliacrilamida de 12%.
  3. Fixar as proteínas no gel com azul coomassie por 20 minutos na RT.
  4. Extire cada peça de gel colorida e corte-a em pequenos pedaços de 1 mm³.
  5. Lave as peças de gel sucessivamente com 300 μL de cada solução: água ultrauso por 15 min, 100% acetonitrila (ACN) para 15 min, 100 mM de bicarbonato de amônio (NH₄HCO₃) por 15 min, ACN:100 mM NH₄HCO₃ (1:1, v/v) por 15 min, e 100% ACN para 5 min com agitação contínua.
  6. Seque peças completamente em gel com concentrador de vácuo.
  7. Realize a redução da proteína com 100 μL de 100 mM NH₄HCO₃ contendo 10 mM dithiothreitol para 1 h a 56°C.
  8. Realize a alquilação proteica com 100 μL de 100 mM NH₄HCO₃ contendo iodoacetamida de 50 mM por 45 min no escuro em RT.
  9. Lave as peças de gel sucessivamente com 300 μL de cada solução: 100 mM de NH₄HCO₃ por 15 min, ACN:20 mM NH₄HCO₃ (1:1, v/v) por 15 min, e 100% ACN por 5 min com agitação contínua.
  10. Seque completamente as peças de gel com um concentrador de vácuo.
  11. Realize a digestão proteica com 50 μL de trippsina (12,5 μg/mL) em 20 mM NH₄HCO₃ durante a 37 °C.
  12. Extrair as proteínas digeridas do gel com 50 μL de 100% ACN por 30 min a 37 °C e depois 15 min na RT com agitação contínua.
  13. Repita os seguintes procedimentos de extração duas vezes: 50 μL de 5% TFA em 20 mM NH₄HCO₃ solução para 20 min com agitação contínua.
  14. Adicione 100 μL de 100% ACN por 10 minutos com agitação contínua.
  15. Proteínas digeridas secas com concentrador de vácuo e resuspend em 20 μL de 0,1% TFA.
  16. Desaltar a amostra utilizando uma ponta de pipeta de 10 μL com mídia de fase inversa C18 para dessel e concentrar peptídeos (ver a Tabela de Materiais) e peptídeos elutos com ácido fórmico ACN:0,1% (FA) (80:20, v/v).
  17. Seque completamente a amostra com um concentrador de vácuo e resuspend em 20 μL de ACN:0.1% FA (2:98, v/v) para espectrometria de massa cromatografia líquida tandem (LC-MS/MS).
2. Análise LC-MS/MS
  1. Carregue o peptídeo digerido no instrumento LC-MS/MS e realize a análise de amostras e dados de acordo com parâmetros descritos em detalhes em outros lugares⁴².
3. Análise de dados brutos
  1. Processe dados de espectrometria de massa para identificar proteínas e comparar proteínas identificadas de cada amostra com um pacote de software de proteômica quantitativa usando parâmetros padrão.
  2. Exportar, utilizando parâmetros padrão, a lista de proteínas exclusivas e super-representadas de amostras positivas de EV em um software que prevê redes proteicas e processos biológicos.
  3. Compare a lista de proteínas identificadas nas frações com os 100 principais marcadores EV do banco de dados de acesso aberto Exocarta (ver tabela de materiais).

4. Ensaio de efeitos funcionais dos EVs

Ensaio de crescimento de Neurite na linha celular PC-12
1. Cultura linha celular PC12 em meio DMEM completo (2 mM L-glutamina, 10% soro de cavalo fetal (ESF), 5% de soro bovino fetal (FBS), 100 UI/mL penicilina, 100 μg/mL estreptomicina).
  NOTA: Os soros estão livres em todo o procedimento.
2. Adicione um copo de tampa (todos os poços) a uma placa de 24 poços; cubra a placa com poli-D-lysine (0,1 mg/mL) e sementes 260.000 células/bem.
3. Incubar as células a 37 °C abaixo de 5% de CO₂.
4. Após 24h de incubação, altere o meio de diferenciação médio para DMEM (DMEM com 2 mM L-glutamina, 0,1% ESF, 100 UI/mL penicilina, 100 μg/mL streptomicina) com 1 x 10⁶ EVs de microglia (da etapa 1.1.2).
  NOTA: A condição de controle é realizada sem EVs de microglia no meio de diferenciação.
5. No dia 4 após a semeadura, carregue todos os poços com 100 μL de meio DMEM completo.
6. No 7º dia após a semeadura, fixe as células com 4% de PFA por 20 min no RT e enxágue três vezes (10 min cada) com PBS.
7. Colorigue as células com falooidina conjugada por 30 minutos a 4 °C e enxágue 3 vezes (10 min cada) com PBS.
8. Manche as células com Hoechst diluído 33342 (1:10.000) por 30 minutos em RT e enxágue 3 vezes (10 min cada) com PBS.
9. Monte o vidro de cobertura em um slide com meio de montagem fluorescente (ver Tabela de Materiais).
10. Analise o slide com um microscópio confocal, tire 5 imagens aleatórias de cada slide.
11. Meça o crescimento do neurite usando um software de quantificação automatizado (comprimento total de neurite) conforme descrito em detalhes em outros lugares⁴³.
Neurite supera o crescimento em neurônios primários de ratos
1. Cubra uma lâmina de vidro de 8 poços com poli-D-lysine (0,1 mg/mL) e laminina (20 μg/mL).
2. Cultura ratos neurônios primários comerciais em meio de cultura apropriada (ver Tabela de Materiais) emplacando 50.000 células por poço e incubando as células a 37 °C sob 5% de CO₂ por 48 h.
  NOTA: Os soros estão livres de exosome em todo o procedimento.
3. Adicione 1 x 10⁶ EVs de microglia ao meio da cultura dos neurônios e incubar a 37 °C abaixo de 5% de CO₂ para 48 h a mais.
  NOTA: A condição de controle é realizada sem EVs de microglia no meio da cultura dos neurônios.
4. Siga os passos 4.1.6 a 4.1.9 para corrigir e manchar as células.
5. Siga os passos 4.1.10 e 4.1.11 para analisar o slide.
Invasão celular glioma
1. Células de glioma de rato C6 resuspend em meio DMEM completo (DMEM com 10% FBS, 2 mM L-glutamina, 1x antibióticos) contendo 5% de colágeno em uma concentração final de 8.000 células em 20 μL.
  NOTA: Os soros estão livres de exosome em todo o procedimento.
2. Coloque 5 mL de PBS NO fundo de um prato de cultura de tecido de 60 mm. Inverta a tampa e as gotas de depósito de 20 μL (8.000 células) de suspensão celular na parte inferior da tampa.
3. Inverta a tampa na câmara inferior cheia de PBS e incubar a placa a 37 °C e 5% de CO₂ por 72 h até formar esferoides celulares.
4. Adicione 1 x 10⁸ EVs de macrófago (da etapa 1.2.2) a uma mistura de colágeno de 2,2 mg/mL (2 mL de solução de colágeno bovino tipo I [3 mg/mL] com 250 μL de 10x mínimo essencial médio (MEM) e 500 μL de hidróxido de sódio de 0,1 M).
  NOTA: A condição de controle é realizada sem EVs de macrófago na mistura de colágeno.
5. Distribua a mistura de colágeno contendo EVs em uma placa de 24 poços para incorporar esferoides celulares.
6. Implante os esferoides de células recém-formados no centro de cada poço.
7. Incubar a placa por 30 min a 37°C e 5% de CO₂ para solidificar o gel.
8. Depois disso, sobreponha 400 μL de meio DMEM completo na matriz de colágeno em cada poço.
9. Incubar o sistema completo por um total de 6 dias a 37 °C e 5% de CO₂.
  NOTA: A invasão celular fora do esferoide é monitorada pela fotografia digital usando um microscópio de luz invertido usando um objetivo de 4x/0.10 N.A.
10. Adquira imagens de cada poço todos os dias.
11. Processar imagens e quantificar a invasão de áreas esferoides celulares usando o software como descrito anteriormente no detalhe⁴².
  NOTA: Áreas de invasão e esferoides foram normalizadas para cada dia para a invasão e áreas esferoides medidas no dia 0.

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Resultados

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Um dos principais desafios para atribuir efeitos biológicos a vesículas extracelulares (EVs) é a capacidade de isolar os EVs de todo o meio da cultura. Neste relatório, apresentamos um método utilizando a ultrassom (UC) e a cromatografia de exclusão de tamanho (SEC) que está acoplado à análise em larga escala de assinaturas proteicas para validar marcadores EV e identificar compostos bioativos. Os EVs derivados de macrófago ou microglia foram isolados do meio condicionado após uma cultura de 24 h ou 48h, respectivamente<...

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Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O sistema nervoso central (SNC) é um tecido complexo no qual a comunicação célula-celular regula as funções neuronais normais necessárias para a homeostase³⁰. Os EVs são agora amplamente estudados e descritos como importantes cargas moleculares para a comunicação célula-celular³¹. Eles fornecem especificamente um coquetel de mediadores para células receptoras, afetando assim suas funções em condições saudáveis e patológicas³². Estudos recentes indica...

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Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O trabalho apresentado contou com o apoio da Ministère de L'Education Nationale, de L'Enseignement Supérieur et de la Recherche e INSERM. Agradecemos o BICeL- Campus Scientific City Facility pelo acesso a instrumentos e conselhos técnicos. Agradecemos a Jean-Pascal Gimeno, Soulaimane Aboulouard e Isabelle Fournier pela assistência de espectrometria de massa. Agradecemos tanina árabe, Christelle van Camp, Françoise le Marrec-Croq, Jacopo Vizioli e Pierre-Eric Sautière por sua forte contribuição para os desenvolvimentos científicos e técnicos.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
12% Mini-PROTÉICO TGX Géis de Proteína Pré-moldados	Bio-rad	4561045EDU
Acetonitrila	Fisher Chemicals	A955-1
Filtro centrífugo Amicon 50 kDa	Merck	UFC505024
Bicarbonato de amônio	Sigma-Aldrich	9830
HSP90 (RRID: AB_675659)	Santa-cruz	sc-13119
Suplemento B27 Plus	Gibco	A3582801
Misturador de Vórtice BenchMixer V2	Benchmark Scientific	BV1003
Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate (Bradford)	Bio-Rad	5000006
C18 ZipTips	Merck Millipore	ZTC18S096
Célula de glioma de rato C6	ATCC ATCC	CCL-107
Tubos canônicos	Sarstedt	62.554.002
Centrífuga	Eppendorf	5804000010
Incubadora CO₂	ThermoFisher
Microscópio confocal LSM880	Carl Zeiss	LSM880
Tampa de vidro	Marienfeld	111580
Prato de Cultura (60 mm)	Sarstedt	82.1473
Ditiotreitol	Sigma-Aldrich	43819
DMEM	Gibco	41966029
Cromatógrafo Líquido EASY-nLC 1000	ThermoFisher
Microscópio eletrônico JEM-2100	JEOL&	nbsp;
Ácido etilenoglicol-bis(2-aminoetiléter)-N,N,N′,N′-tetracético	Sigma-Aldrich	03777-10G
Ácido etilenodiaminotetracético	Sigma-Aldrich	ED-100G
Exo-FBS	Ozyme	EXO-FBS-50A-1	Exossomo esgotado FBS
ExoCarta banco de dados (top 100 proteínas de Evs)			http://www.exocarta.org/
Soro Fetal Bovino	Gibco	16140071
Soro Fetal de Cavalo	Biowest	S0960-500
Filtropur S 0.2	Sarstedt	83.1826.001
Marca Fisher Sonda Q500 Sonicator com Sonda	Fisherbrand	12893543
FlexAnalysis	Brucker
Meio de montagem de fluorescência	Agilent	S3023
Ácido fórmico	Sigma-Aldrich	695076
Grades de cobre revestidas de carbono Formvar	Agar scientific Ltd	AGS162-3
Glicose	Sigma-Aldrich	G8769
Glutaraldeído	Sigma-Aldrich	340855
Hoechst 33342	Euromedex	17535-AAT
Idoacetamida	Sigma-Aldrich	I1149
InstantBlue Coomassie Protein Stain	Expedeon	ISB1L
Microscópio de luz invertida CKX53	Olympus
L-glutamina	Gibco	25030-024
LabTek II 8 poços	Nunc	154534
Laemmli 2x	Bio-Rad	1610737
Laminin	Corning	354232
Software MaxQuant (software de identificação de proteínas)			https://maxquant.net/maxquant/
MBT polonês stell	Brucker	8268711
MEM 10x	Gibco	21090-022
Metilcelulose	Sigma-Aldrich	M6385-100G
Água MiliQ	Merck Millipore
Regilait de Leite		REGILAIT300
Mini PROTEAN Célula de Eletroforese Vertical	Bio-Rad	1658000FC
Coluna FPLC MonoP	GE Healthcare		não está mais disponível
Nanosight NS300	Malvern Panalytical	NS300
Software NanoSight NTA v3.2	Malvern Panalytical
Bomba de seringa NanoSight	Malvern Panalytical
Gibco Neurobasal		21103-049
Membrana de nitrocelulose	GE Healthcare	10600007
Nonidet P-40	Fluka	56741
Nunc multidish 24 poços	ThermoFisher	82.1473
Paraformaldeído	Eletromicroscopia Ciência	15713
Linha celular PC-12	ATCC	ATCC CRL-1721
Penicilina-Estreptomicina	Gibco	15140-122
Mistura de calibração de peptídeos	LaserBio Labs	C101
Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	115-035-003
Software Perseus (Processamento de proteínas identificadas)			https://maxquant.net/perseus/
Conjugado de faloidina-tetrametilrodamina	Santa-cruz	sc-362065
Fluoreto de fenilmetanosulfonil	Sigma-Aldrich	78830
Tampão de fosfato Salino	Invitrogen	14190094	sem cálcio, sem magnésio
pluriFiltro M/ 60 µ m	pluriSelect	43-50060
Poli-D-lisina	Sigma-Aldrich	P6407
Tubos de centrífuga em policarbonato	Beckman Coulter	355651
Inibidor de Protease	Sigma-Aldrich	S8830-20TAB
PureCol	Cell Systems	5005
Espectrômetro de massa Q-Exactive	ThermoFisher
espectrômetro de massas rapifleX	Brucker
Neurônios corticais de rato	Aplicações celulares	R882N-20	Origem celular: Derivado de córtices cerebrais do dia 18 cérebros embrionários de ratos Sprague Dawley
Macrófagos de rato & Meio de Cultura Microglia	Aplicações Celulares	R620K-100	Origem celular: Medula óssea de rato normal e saudável
Macrófagos primários de rato	Aplicações celulares	R8818-10a
Microglia primária de rato	Lonza	RG535
Sepharose CL-2B	GE Healthcare	17014001
Tripsina Modificada de Grau de Sequenciamento	Promega	V5111
Deslize	Dustsher	100204
Cloreto de Sódio	Scharlau	SO0227
Dodecil Sulfato de Sódio	Sigma-Aldrich	L3771
Fluoreto de Sódio	Sigma-Aldrich	S7920-100G
Hidróxido de sódio	Scharlab	SO0420005P
Pirofosfato de sódio	Sigma-Aldrich	S6422-100G
Concentrador de Vácuo SpeedVac	ThermoFisher
Software de cordas (redes de associação de proteínas funcionais)			https://string-db.org/
Substrato de Duração Prolongada SuperSignal West Dura	ThermoFisher	34075
Seringa 1.0 mL	Terumo	8SS01H1
Célula de transferência semi-seca Trans-Blot SD	Bio-Rad	1703940
Ácido trifluoroacético	Sigma-Aldrich	T6508
Tris	Interchim	UP031657
Tris-Glicina	Euromedex	EU0550
Interpolação 20	Sigma-Aldrich	P2287
Ultracentrífuga	Beckman Coulter	A95765
Rotor de Ultracentrífuga 70.1 Ti	Beckman Coulter	342184
Acetato de uranila	Agar Scientific Ltd	AGR1260A
Papel de filtro Whatman	Sigma-Aldrich	WHA10347510
Ácido &alfa;-ciano-4-hidroxicinâmico	Sigma-Aldrich	C2020-25G

Referências

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Extracellular Vesicles Immune Cells Ultracentrifugation Size Exclusion Chromatography Nanoparticle Tracking Analysis Western Blot Proteomics Analysis Neurite Outgrowth Glioma Cell Invasion Microglia derived EVs

Caracterização de vesículas extracelulares derivadas de células imunes e estudo do impacto funcional no ambiente celular

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