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Artigo de método

Um modelo de spheroid 3D como um sistema mais fisiológico para fibroblastos associados ao cancro diferenciação e invasão in vitro estudos

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DOI:

10.3791/60122

⸱

8 de agosto de 2019

 , 
1Institute of Physiological Chemistry and Pathobiochemistry, University of Münster, 2Instituto de Medicina Molecular, Lisbon

Neste artigo

Resumo

O objetivo deste protocolo é estabelecer um modelo in vitro 3D para estudar a diferenciação de fibroblastos Cancer-associados (CAFs) em um tumor a granel-como o ambiente, que pode ser abordado em diferentes sistemas de análise, tais como a imunofluorescência, transcricional análise e imagens de células de vida.

Resumo

Definir o modelo ideal para um estudo in vitro é essencial, principalmente se estudar processos fisiológicos como a diferenciação de células. No estroma do tumor, os fibroblastos do anfitrião são estimulados por pilhas de cancro para diferenciar-se. Assim, adquirem um phenotype que contribua ao microambiente do tumor e apoie a progressão do tumor. Ao usar o modelo esferóide, foi criado um sistema modelo in vitro 3D, no qual analisamos o papel do laminin-332 e sua integrina receptor α3β1 nesse processo de diferenciação. Este sistema do modelo do esferóide reproduz não somente as condições do microambiente do tumor em uma maneira mais exata, mas igualmente é um modelo muito versátil desde que permite estudos a jusante diferentes, tais como a mancha imunofluorescente de ambos intra e extracelular marcadores, bem como as proteínas da matriz extracelular depositadas. Além disso, análises transcricional por qPCR, citometria de fluxo e invasão celular podem ser estudadas com este modelo. Aqui, nós descrevemos um protocolo de um modelo do esferóide para avaliar o papel do integrina α3β1 de CAFS e seu ligand ectopicamente depositado, laminin-332, na diferenciação e em suportar a invasão de pilhas de cancro pancreatic.

Introdução

O microambiente tumoral é um nicho muito complexo e extremamente importante para a manutenção e progressão das células tumorais1. É formado não só pelas células cancerosas, mas também por fibroblastos stromal. As pilhas do tumor são cercadas por um estroma que seja específico e diferente do estroma de tecidos normais2. Laminin-332 é uma proteína da matriz extracelular expressada ectopicamente no estroma de tumores diferentes, como do adenocarcinoma pancreatic3. Além disso, a composição bioquímica do ECM e também suas propriedades biofísicas, como rigidez e tensão, mudam dentro do volume tumoral4. Este estroma do tumor, ou "estroma reactivo", é causado por uma adaptação dos fibroblasto às pilhas de cancro vizinhas e pelo recrutamento de outros jogadores muito importantes que desenvolvem um ambiente favorável e de suporte para a progressão do tumor. A diferenciação de fibroblasto stromal conduz aos fibroblastos Cancer-associados (CAF). Essas células podem ser identificadas por meio de diferentes marcadores como α-actina de músculo liso (αSMA)5 ou antígeno neural/glial 2 (NG2)6.

O modelo in vitro mais adequado para recapitular o microambiente tumoral (TME) com CAFS é difícil de selecionar. O método para imitar parâmetros fisiológicos do TME de forma rentável e reprodutível deve ser considerado para tal sistema modelo. Dentro do TME, diferentes processos, como a proliferação, diferenciação, migração e invasão dos diferentes tipos de células ocorrem. Estes processos celulares podem ser realizados individualmente com diferentes métodos. No entanto, as condições experimentais devem considerar as interações celulares com a ECM do estroma tumoral, uma vez que a rigidez do substrato influencia o processo de diferenciação da CAF. R.G. Wells comentou sobre o impacto da rigidez matricial no comportamento celular e destacou que a organização citoesquelética e o status de diferenciação observados em células cultivadas in vitro podem ser artefactos7. Diferentes estímulos parecem estar envolvidos na diferenciação do Caf, incluindo a tensão mecânica5,7. Para evitar isso, substratos macios 2D podem ser possíveis abordagens para estudos de diferenciação, pois contorna o problema do plástico de prato de cultura rígida. Uma superfície 2D macia, em que os fibroblastos podem ser crescidos, pode ser colagénio-eu revestido géis do poliacrilamida, por meio de que a rigidez do gel pode ser manipulada pela concentração de poliacrilamida e pelo cross-linker do gel. A adesão e a formação de fibras de estresse ricas em αSMA são aprimoradas em fibroblastos, juntamente com a rigidez do gel8. Estes resultados salientam a importância dos andaimes de substrato macio para modelos de diferenciação in vitro mais fisiológicos. Entretanto, em nossas mãos a reprodutibilidade experimental e a imagem latente destes géis eram desafiantes. Para superar essas deficiências, mudamos o sistema de substrato 2D macio para um modelo de esferóide 3D para estudos de diferenciação e invasão. Este modelo é mais clinicamente relevante e, semelhante a um organoide in vitro, recapitula interações celulares in vivo, produção e deposição de ECM, bem como o comportamento celular9.

Spheroids são formados quando as células não têm um substrato para aderir. Quando as células são deixadas sem uma superfície adesiva, elas agregam para formar uma estrutura mais ou menos esférica. Se os esferoides são compor de um tipo de pilha, são chamados homospheroids; se compor de dois ou mais tipos diferentes da pilha formam heterospheroids.

Entre os diferentes métodos para a preparação do esferóide, realizamos o protocolo usando placas de fundo redondo não aderentes 96-well. É muito eficaz em relação aos custos. Aqui, nós produzimos ambos os homospheroids dos fibroblasto, CAF ou CAFs que faltam a subunidade do integrina α3 para examinar o processo da diferenciação e heterospheroids de CAFs ou de integrina α3 KO CAFs e pilhas pancreatic da carcinoma do duto (AsPC-I e PANC-I) para estudar a invasão na matriz circundante.

O alvo para estes estudos era usar CAFs preliminar isolados das biópsias pancreatic humanas da carcinoma. No entanto, as biópsias para obter as células são escassas e, por essa razão, os CAFs utilizados nestes estudos foram imortalizados usando Lentivirus contendo HTERT. Eles são chamados de iCAFs, e suas contrapartes normais, fibroblastos pancreáticos primários humanos, são denominados iNFs. Os fibroblasto pancreatic humanos e as pilhas pancreatic da carcinoma do duto, AsPC-I e PANC-I, estão disponíveis comercialmente.

Este protocolo foi utilizado para estudar o efeito da interação laminina-332-integrina no processo de diferenciação da CAF. Para comprovar a especificidade dessa interação e sua função, foram utilizados compostos inibidores: BM2, um anticorpo monoclonal que bloqueia o local de ligação da integrina a cadeia10de laminina-332 α3, ou lebein 1, um composto derivado de veneno de cobra que bloqueia a integrinas de ligação à laminina α3β1, α6β1 e α7β111,12.

Para o ensaio da invasão, as pilhas tinham sido transacidas com o Lentivirus que contem o cDNA que codifica mCherry (iCAFs e integrina α3 KO iCAFs) ou GFP (AsPC-I e PANC-I) para distinguir os tipos diferentes da pilha nos heterospheroids. A transdução das células para imortalizá-las e/ou rotulá-las com a expressão de proteína fluorescente (mCherry e GFP) é descrita em um estudo prévio13, que deve ser consultado para obter mais informações.

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Protocolo

1. esferoides 3D como um modelo in vitro para a diferenciação de fibroblast/CAF usando diferentes compostos inibidores de TGF-β1 da interação célula-matriz

  1. Misture 1 parte de solução de metilcelulose de 6 mg/mL e 3 partes de meios de cultura celular, MEM suplementado com 1% de soro bovino fetal inativado por calor (FBS) e 1% de penicilina/estreptomicina para obter a solução de formação de esferóide.
  2. Ressuscitou os fibroblastos normais imortalizados recentemente descongelados (iNFs), o CAF imortalizado (iCAFs) ou a integrina α3β1 KO iCAF (passagem até 25) na solução de formação de esferóides. Se preparando 1 96 placa de poço, prepare um excesso de solução de formação de esferóide, 10 mL e adicione 75.000 células, tendo em mente que cada esferóide é composto por 750 células, e que 100 μL são distribuídos por cada poço da placa.
  3. Se as citocinas ou os inibidores da integrina forem incluídos no estudo, adicione estes compostos à suspensão celular, a fim de incorporá-los nos esferóides durante a sua formação. Note-se que as iNFs são estimuladas com 10 ng/mL de TGF-β1, a fim de desencadear a diferenciação. Se for caso disso, adicionar compostos inibidores juntamente com TGF-β1, tais como 20 μg/mL BM2 ou 10 μg/mL de lebein 1.
  4. Prepare os homospheroídeos da CAF da mesma maneira, mas sem o estímulo TGF-β1, já que eles são diferenciados. Prepare o integrina α3 KO CAF homospheroids sem a adição de qualquer composto.
  5. Distribua a solução da formação do esferóide em uma placa do multi-poço do fundo redondo 96 adicionando 100 μl da solução em cada poço. Toda vez que a solução esferóide é distribuída nos poços, misture bem pipetando para cima e para baixo, várias vezes.
  6. Coloc a placa na incubadora da cultura da pilha para 24 h para permitir que um esferóide seja dado forma em cada poço.
  7. Colete os esferóides após cerca de 24 h e use-os para diferentes finalidades a jusante: coloração imunofluorescente, tempo real (RT) q-PCR e citometria de fluxo. Para detectar a expressão de antígenos intra e extracelulares, incluindo a deposição de proteínas de ECM dentro do esferóide, use coloração imunofluorescente. Após a desintegração de esferoides em únicas pilhas, quantifique o receptor membrana-ancorado pelo fluxo cytometry. Para detectar a ativação do gene e as mudanças transcricional, use o RT q-PCR do mRNA isolado das pilhas do esferóide.

2. coloração imunofluorescente de esferóides

  1. Colete os esferóides após cerca de 24 h em um tubo de reação de 1,5 mL por condição experimental ou por proteína a ser analisado. Por exemplo, coloque os esferóides de iNFs estimulados com TGF-β1 em um tubo diferente das iNFs de controle, que não foram tratadas. Para evitar a ruptura de esferóides devido a forças de cisalhamento muito fortes, corte a extremidade da ponta da pipeta para ampliar o orifício. Inclua pelo menos 5-10 esferóides em um tubo de reação, para permitir réplicas e levar em conta as possíveis perdas durante as etapas de lavagem.
  2. Centrifugue os esferóides com uma centrífuga de bancada para cerca de 30-60 s em 1.000 x g. Retire cuidadosamente o sobrenadante contendo metilcelulose introduzindo pipetagem, sem perturbar os esferóides peletizados.
  3. Lave com 50 μL de 1X PBS. Repita a etapa de centrifugação e Retire cuidadosamente a PBS introduzindo pipetagem, conforme descrito em 2,2.
  4. Dependendo da proteína a ser manchada, fixar com 50 μL de paraformaldeído 4% em PBS por 20 minutos à temperatura ambiente (para αSMA, NG2 e integrina α3β1) ou com 50 μL de metanol por 10 min a-20 ° c (para laminina-332 subunidades).
  5. Repita a etapa de lavagem conforme explicado nas etapas 2.2-2.3.
  6. Permeabilize as células com 0,1% Triton-X em PBS por 4 min à temperatura ambiente.
  7. Repita a etapa de lavagem conforme explicado nas etapas 2.2-2.3 três vezes.
  8. Incubar os esferóides em PBS contendo 5% de FBS e 2% de BSA, por 1 h em RT para bloquear sítios de interação protéico não específicos.
  9. Incubar os esferóides com 30 μL de anticorpos primários em PBS, 2,5% FBS e 1% BSA a 4 ° c durante a noite. Foram utilizados os seguintes anticorpos primários: anti-αSMA CY-3 conjugados e NG2 a 5 μg/mL; BM2 anti-laminina α3, 6F12 anti-laminina β3 e anti-laminina γ 2 20 μg/mL.
  10. Repita a etapa de lavagem conforme explicado nas etapas 2.2-2.3 três vezes.
  11. Incubar os esferóides com 30 μL de anticorpos secundários em PBS, 2,5% FBS e 1% BSA em RT por 90 min. Os seguintes anticorpos secundários utilizados foram: Alexa 488 anti-coelho e anti-rato (5 μg/mL).
  12. Repita a etapa de lavagem conforme explicado nas etapas 2.2-2.3 três vezes.
  13. Incubar as células com 30 μL de solução de coloração DAPI durante 4 min à temperatura ambiente.
  14. Repita a etapa de lavagem conforme explicado nas etapas 2.2-2.3.
  15. Coloc os esferoides em uma corrediça de vidro, em uma gota de PBS, usando um Pipet de vidro de Pasteur.
  16. Imagem os esferoides pela microscopia de fluorescência em um microscópio da exploração do laser usando uma ampliação de 10x. Tome a seção transversal ótica diferente do esferóide em planos óticos diferentes de uma z-pilha (15-20 planos da pilha). Para estabelecer os ajustes do laser no microscópio, use um esferóide compor das pilhas negativas para o antígeno do interesse ou um esferóide manchado somente com o anticorpo secundário. Reutilizar as mesmas configurações para todas as amostras que serão comparadas.
  17. Analise as imagens microscópicas com o software ImageJ como publicado anteriormente14. As etapas são resumidas na Figura 1 suplementar. Como pano de fundo, determine a densidade de sinal integrada de uma região de interesse (ROI) livre de células. Calcule a fluorescência total corrigida da célula (TCCF) como:
    figure-protocol-1
  18. Determine a fluorescência total corrigida (TCF) dos esferóides como o TCCF normalizado para a área de esferóide e o número de pilhas.
    figure-protocol-2

3. RT q-PCR de homospheroids

  1. Para executar RT-qPCR, colete pelo menos 288 esferóides (correspondendo a placas 3 96-well) em um tubo de reação de 50 mL. Centrifugue por 5 min a 1.000 x g e Retire cuidadosamente o sobrenadante contendo metilcelulose introduzindo pipetagem sem perturbar os esferóides peletizados.
  2. Lave com 1 mL de 1X PBS e transfira os esferóides para um tubo de reacção de 1,5 mL. Centrifugue os esferóides com uma centrífuga de bancada para cerca de 30-60 s em 1.000 x g. Retire cuidadosamente a PBS introduzindo pipetagem, sem perturbar os esferóides peletizados.
  3. Dissociar os esferóides com 250 μL de 4 mg/mL de colagenase B, 50 μg/mL DNase I, 2% BSA, 1 mM CaCl2 em PBS a 37 ° c por cerca de 30-45 min, suavemente vortexing e pulsando intermitentemente por alguns segundos a cada 5 min.
  4. Repita a etapa de lavagem conforme explicado na etapa 3,2.
  5. Isole o RNA total das células de esferóides desintegrados usando um kit de isolamento de RNA comercial, de acordo com as instruções dos fabricantes.
  6. Reverter transcrito o mRNA isolado em cDNA com um kit comercial, de acordo com as instruções dos fabricantes.
  7. Quantificar os níveis de transcrição em repetições por PCR em tempo real. Os primers utilizados foram: α-SMA: FW 5 ′-CCGACCGAATGCAGAAG GA-3 ′, Rev 5 ′ ACAGAGTATTTGCGCTCCGAA-3 ′15; Corrente laminin α3: FW 5 ′-GCTCAGCTGTTTGTGGTTGA-3 ′, Rev 5 ′-TGTCTGCATCTGCCAATAGC-3 ′16; Laminin β3 Chain: FW 5 ′-GGCAGATGATTAGGGCAGCCGAGGAA-3 ′ rev 5 ′-CGGACCTGCTGGATTAGGAGCCGTGT-3 ′17; Laminin γ2 Chain: FW 5 ′-GATGGCATTCACTGCGAGAAG-3 ′ rev 5 ′-TCGAGCACTAAGAGAACCTTTGG-3 ′ 16; NG2: FW 5 ′-CTGCAGGTCTATGTCGGTCA-3 ′ rev 5 ′-TTGGCTTTGACCCTGACTATG-3 ′18; integrina α3 subunit: FW 5 '-AGGGGACCTTCAGGTGCA-3 ' Rev 5 '-TGTAGCCGGTGATTTACCAT-3 '19; TOP-1: FW 5 ′-CCAGACGGAAGCTCGGAAAC-3 ′ rev 5 ′-GTCCAGGAGGCTCTATCTTGAA-3 ′20.
  8. Corrija os valores de CT para o CT-valor de um gene de referência endógeno como TOP-1 usando a equação: 2-δδct. ΔΔCt = ΔCt (amostra-alvo) – ΔCt (amostra de referência) e ΔCt = TC do gene alvo ou gene de referência – TOP-I.

4. análise da citometria de fluxo da expressão da integrina

  1. Para análise citométrica de fluxo, colete pelo menos 288 esferoides (correspondendo a placas 3 96-well) em um tubo de reação de 50 mL. Centrifugue por 5 min a 1.000 x g e Retire cuidadosamente o sobrenadante contendo metilcelulose introduzindo pipetagem.
  2. Lave com 1 mL de 1X PBS e transfira os esferóides para um tubo de reacção de 1,5 mL. Repita a etapa de centrifugação e Retire cuidadosamente a PBS introduzindo pipetagem.
  3. Dissociar os esferoides conforme descrito na etapa 3,3.
  4. Repita a etapa de lavagem conforme explicado na etapa 4,2.
  5. Para bloquear sítios de ligação não específicos e impedir a ligação de anticorpos relevantes para a detecção aos receptores Fcγ (CD16, CD32 e CD64), incubar as células em 100 μL de PBS contendo 2% de soro de cavalo (ou soro de outra espécie animal, os anticorpos dos quais não serão utilizado no experimento) e 0,1% BSA por 20 min a 4 ° c com rotação.
  6. Em caso de coloração de marcadores intracelulares, fixar/permeabilizar as células conforme descrito na etapa 2.2-2.5.
  7. Incubar as células com os anticorpos primários em 100 μL de PBS contendo 2% de soro de cavalo e 0,1% de BSA por 30 min a 4 ° c com rotação. Diluir o anticorpo primário para 10 μg/mL.
  8. Lave com 100 μL de PBS + 0,1% de BSA três vezes, com etapas da centrifugação no centrifugador superior do banco em 1.000 x g no meio.
  9. Incubar as células com os anticorpos secundários em 100 μL de PBS contendo 2% de soro de cavalo e 0,1% de BSA por 30 min a 4 ° c com rotação. Diluir o anticorpo secundário para 10 μg/mL.
  10. Repita a etapa de lavagem conforme explicado na etapa 4,7.
  11. Analise 2,0 x 104 células manchadas em um citometro de fluxo. Portão para células únicas ao vivo através do gráfico de pontos FSC-SSC e analisar a fluorescência das células fechadas no canal apropriado para o fluoróforo selecionado.

5. ensaio de invasão usando heterospheroids

  1. Prepare a solução de formação de esferóides para heteroesferoides, contendo os diferentes tipos de células e médiuns correspondentes, como resumidos na tabela 1. As pilhas tinham sido transadas previamente com o Lentivirus que contem vetores para a expressão de mCherry ou de GFP.
  2. Encha 100 μL da solução de formação de esferóide em cada poço da placa e incubar a placa na incubadora da cultura celular por 24 h para permitir que um esferóide seja formado em cada poço.
  3. Preparar 60 μL de mistura de matriz gelatinosa contendo 2 mg/mL de colágeno de cauda de rato I, 30% de matriz de gelifying comercial e 2,5 μg/mL de laminina-332 num tubo de reacção de 1,5 mL. Distribua rapidamente 15 μL em 3 poços da câmara de angiogênese μ-slide. Incorpore um esferóide em cada poço que contem já o gel.
  4. Se necessário, ajuste ràpida a posição do esferóide ao centro do poço com uma pipeta o microscópio.
  5. Repita as etapas 5.2-5.3 para os heterospheroids seguintes e repita-os outra vez para os homospheroids.
  6. Incubar os géis na incubadora por 1 h para solidificar e, em seguida, sobrepor suavemente os géis com meio de cultura celular.
  7. Imagem os esferoides pela microscopia de fluorescência em um microscópio da exploração do laser. Tome a seção transversal ótica diferente do esferóide em planos óticos diferentes de uma z-pilha e em pontos diferentes do tempo da invasão (por exemplo, 0 h, 24 h, 48 h e 72 h).
  8. Analise as imagens contando o número de células cancerosas invasoras. As células invasoras são aquelas que deixaram o esferóide e entraram na área invasiva. A área invasiva é definida como a área do anel entre os perímetros externos e internos administrados pela célula invadida mais afastada e pela borda esferóide do esferóide no início dos experimentos de invasão, respectivamente, conforme descrito na Figura 2 suplementar .

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Resultados

Os resultados deste delineamento experimental são publicados em Martins cavaco et al.13, o que é recomendado para posterior leitura das conclusões extraídas desses experimentos.

A Figura 1, uma imagem representativa de um esferóide imunofluorescente, mostra a imunocoloração da subunidade de integrina α3 de fibroblastos imortalizados normais e de CAFS imortalizados (

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Discussão

Desenvolver um modelo in vitro adequado para estudar a diferenciação da CAF é uma tarefa desafiadora. Após o emprego de diferentes abordagens, concluímos que um modelo esferóide 3D é o modelo mais prático, fisiológico e clinicamente relevante, no qual a interação entre células de carcinoma pancreática com CAFs imortalizados pode ser estudada. Este modelo impediu a diferenciação espontânea dos fibroblasto, devido aos estressores artefatual tais como a rigidez do plástico da cultura da pilha, pelo menos em condições de cul...

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Divulgações

Os autores não declaram conflito de interesses. Este material reflecte apenas os pontos de vista do autor e a União Europeia não é responsável por qualquer utilização que possa ser feita das informações nele contidas.

Agradecimentos

Reconhecemos a ajuda de Barbara Schedding na preparação do BM2 e do lebein-1. Reconhecemos a Àgnes Noel por compartilhar sua expertise em ensaios de esferóides. Agradecemos Sonja Schelhaas e Michael Schäfers por sua ajuda na manipulação de transfecção lentivirais condições S2. Reconhecemos a assistência de Sabine von Rüden na preparação de CAFs de tecido de câncer pancreático.

A investigação que conduz a estes resultados recebeu financiamento do programa de pessoas (acções Marie Curie) do sétimo programa-quadro da União Europeia 7. º PQ/2007-2013/no âmbito do acordo de subvenção REA n ◦ (316610) para J.A.E. Além disso, a J.A.E. e a A.C.M.C. foram apoiadas financeiramente pela Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) dentro do cluster de excelência Cells-in-Motion (EXC 1003-CiM). Este projeto também foi apoiado por Wilhelm Sander Stiftung (Grant: 2016.113.1 to J.A.E.).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
4',6-Diamidino-2-Fenilindo, dicloridrato (DAPI)SIGMA-ALDRICHD9542-10
6F12 anti-laminina β 3 subunidade Rato (monoclonal)Caseiro
A3IIF5 Anti-&alfa; 3 subunidade de integrina Camundongo (monoclonal)Gentilmente cedido pelo Prof. M. Hemler, Dana Faber-Cancer Institute, Boston
AcetonaSIGMA-ALDRICH32201
Albumina Fração V - BSAAppliChemA1391
Alexa fluor 488 Cabra (policlonal) anti-MouseInvitrogenA11029
Alexa fluor 488 Cabra (policlonal) CoelhoInvitrogenA11034
Anti-laminina e gama; 2 subunidades Camundongo (monoclonal)Santa Cruzsc-28330
Anti-NG2 Coelho (policlonal) Millipore, AB5320MilliporeAB5320
Anti-&alfa;-SMA-Cy3 Camundongo (monoclonal)SIGMA-ALDRICHC6198
AsPC-1 linha celularATCCGentilmente cedido pelo prof. Jorg Haier's
Lab Bench centrífugaFisher Scientific50-589-620Sprout
BM2 anti-laminina &alfa; 3 subunidades Mouse (monoclonal)Gentilmente cedido pela Prof. Patricia Rousselle, CNRS, Lyon
Cloreto de cálcio (CaCl2)Centrífuga Thermo
ScientificMultifuge 1S-R
Tubos de centrífuga 50 mLCorning430290
Colagenase BRoche11088831001
Colágeno-I, cauda de ratoGibcoA10483-01
Microscópio confocalZeissLSM 700 e 800
DMEM (glicose alta 4,5 g/L)LonzaBE12-604F
Dnase ICitômetrode fluxo 10104159001
Roche BD BiosciencesFACSCaliburTM
Matriz gelificanteThermoFisher ScientificA1413202Matrigel, Geltrex
Goat IgG, isotipoDAKOX 0907
Soro de CavaloSIGMA-ALDRICH12449-C
Fibroblastos Pancreáticos Primários HumanosPELOBiotechPB-H-6201
IncubadoraHeraeusB6060
Laminin-332BiolaminaLN332
MEMMicroplaca SIGMA-ALDRICHM4655
, 96 poços, Greiner com fundo em U650101Bio-One
Thermo ScientificJ1800AMNZ
Mouse IgG, isotipoSIGMA-ALDRICHI8765
Misturador rotativo de vários eixosCATRM5 80V
PANC-IATCCGentilmente cedido pelo Prof. Jorg
Paraformaldeído deRiedel-de Haë n16005
Penicilina/estreptomicinaGibco15140-122
Kit de transcrição reversa QuantiTectQiagen205310
IgG de rato, isotipoInvitrogen10700
Tubos de reação, 1,5 mLGreiner Bio-One616201
Ciclador de PCR em tempo realQiagenRotor-Gene Q
RNeasy Mini KitQiagen74104
Rotor Gene SYBR Green PCR KitQiagen204074
RPMILonzaBE12-702FAdicione glicose a 4,5 g (filtro de 0,2 um) e 1% de piruvato de sódio
TritonX-100SIGMA-ALDRICHX100RS
Vó rtexScientific IndustriesVortex-Genie 2
μ-Slide Angiogênese, não revestidoIbidi81501
Lâminas de microscópio laboratório de Haier

Referências

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