O objetivo deste protocolo é estabelecer um modelo in vitro 3D para estudar a diferenciação de fibroblastos Cancer-associados (CAFs) em um tumor a granel-como o ambiente, que pode ser abordado em diferentes sistemas de análise, tais como a imunofluorescência, transcricional análise e imagens de células de vida.
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Artigo de método
Um modelo de spheroid 3D como um sistema mais fisiológico para fibroblastos associados ao cancro diferenciação e invasão in vitro estudos
Neste artigo
Resumo
Resumo
Definir o modelo ideal para um estudo in vitro é essencial, principalmente se estudar processos fisiológicos como a diferenciação de células. No estroma do tumor, os fibroblastos do anfitrião são estimulados por pilhas de cancro para diferenciar-se. Assim, adquirem um phenotype que contribua ao microambiente do tumor e apoie a progressão do tumor. Ao usar o modelo esferóide, foi criado um sistema modelo in vitro 3D, no qual analisamos o papel do laminin-332 e sua integrina receptor α3β1 nesse processo de diferenciação. Este sistema do modelo do esferóide reproduz não somente as condições do microambiente do tumor em uma maneira mais exata, mas igualmente é um modelo muito versátil desde que permite estudos a jusante diferentes, tais como a mancha imunofluorescente de ambos intra e extracelular marcadores, bem como as proteínas da matriz extracelular depositadas. Além disso, análises transcricional por qPCR, citometria de fluxo e invasão celular podem ser estudadas com este modelo. Aqui, nós descrevemos um protocolo de um modelo do esferóide para avaliar o papel do integrina α3β1 de CAFS e seu ligand ectopicamente depositado, laminin-332, na diferenciação e em suportar a invasão de pilhas de cancro pancreatic.
Introdução
O microambiente tumoral é um nicho muito complexo e extremamente importante para a manutenção e progressão das células tumorais1. É formado não só pelas células cancerosas, mas também por fibroblastos stromal. As pilhas do tumor são cercadas por um estroma que seja específico e diferente do estroma de tecidos normais2. Laminin-332 é uma proteína da matriz extracelular expressada ectopicamente no estroma de tumores diferentes, como do adenocarcinoma pancreatic3. Além disso, a composição bioquímica do ECM e também suas propriedades biofísicas, como rigidez e tensão, mudam dentro do volume tumoral
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Protocolo
1. esferoides 3D como um modelo in vitro para a diferenciação de fibroblast/CAF usando diferentes compostos inibidores de TGF-β1 da interação célula-matriz
- Misture 1 parte de solução de metilcelulose de 6 mg/mL e 3 partes de meios de cultura celular, MEM suplementado com 1% de soro bovino fetal inativado por calor (FBS) e 1% de penicilina/estreptomicina para obter a solução de formação de esferóide.
- Ressuscitou os fibroblastos normais imortalizados recentemente descongelados (iNFs), o CAF imortalizado (iCAFs) ou a integrina α3β1 KO iCAF (passagem até 25) na solução de formação de esferóides. Se preparando 1 96 placa de poço, prepare um excesso de s....
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Resultados
Os resultados deste delineamento experimental são publicados em Martins cavaco et al.13, o que é recomendado para posterior leitura das conclusões extraídas desses experimentos.
A Figura 1, uma imagem representativa de um esferóide imunofluorescente, mostra a imunocoloração da subunidade de integrina α3 de fibroblastos imortalizados normais e de CAFS imortalizados (
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Discussão
Desenvolver um modelo in vitro adequado para estudar a diferenciação da CAF é uma tarefa desafiadora. Após o emprego de diferentes abordagens, concluímos que um modelo esferóide 3D é o modelo mais prático, fisiológico e clinicamente relevante, no qual a interação entre células de carcinoma pancreática com CAFs imortalizados pode ser estudada. Este modelo impediu a diferenciação espontânea dos fibroblasto, devido aos estressores artefatual tais como a rigidez do plástico da cultura da pilha, pelo menos em condições de cul.......
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Divulgações
Os autores não declaram conflito de interesses. Este material reflecte apenas os pontos de vista do autor e a União Europeia não é responsável por qualquer utilização que possa ser feita das informações nele contidas.
Agradecimentos
Reconhecemos a ajuda de Barbara Schedding na preparação do BM2 e do lebein-1. Reconhecemos a Àgnes Noel por compartilhar sua expertise em ensaios de esferóides. Agradecemos Sonja Schelhaas e Michael Schäfers por sua ajuda na manipulação de transfecção lentivirais condições S2. Reconhecemos a assistência de Sabine von Rüden na preparação de CAFs de tecido de câncer pancreático.
A investigação que conduz a estes resultados recebeu financiamento do programa de pessoas (acções Marie Curie) do sétimo programa-quadro da União Europeia 7. º PQ/2007-2013/no âmbito do acordo de subvenção REA n ◦ (316610) para J.A.E. Além disso, a J.A.E. e a A.C.M.C.....
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 4',6-Diamidino-2-Fenilindo, dicloridrato (DAPI) | SIGMA-ALDRICH | D9542-10 | |
| 6F12 anti-laminina β 3 subunidade Rato (monoclonal) | Caseiro | ||
| A3IIF5 Anti-&alfa; 3 subunidade de integrina Camundongo (monoclonal) | Gentilmente cedido pelo Prof. M. Hemler, Dana Faber-Cancer Institute, Boston | ||
| Acetona | SIGMA-ALDRICH | 32201 | |
| Albumina Fração V - BSA | AppliChem | A1391 | |
| Alexa fluor 488 Cabra (policlonal) anti-Mouse | Invitrogen | A11029 | |
| Alexa fluor 488 Cabra (policlonal) Coelho | Invitrogen | A11034 | |
| Anti-laminina e gama; 2 subunidades Camundongo (monoclonal) | Santa Cruz | sc-28330 | |
| Anti-NG2 Coelho (policlonal) Millipore, AB5320 | Millipore | AB5320 | |
| Anti-&alfa;-SMA-Cy3 Camundongo (monoclonal) | SIGMA-ALDRICH | C6198 | |
| AsPC-1 linha celular | ATCC | Gentilmente cedido pelo prof. Jorg Haier's | |
| Lab Bench centrífuga | Fisher Scientific | 50-589-620 | Sprout |
| BM2 anti-laminina &alfa; 3 subunidades Mouse (monoclonal) | Gentilmente cedido pela Prof. Patricia Rousselle, CNRS, Lyon | ||
| Cloreto de cálcio (CaCl2) | Centrífuga Thermo | ||
| Scientific | Multifuge 1S-R | ||
| Tubos de centrífuga 50 mL | Corning | 430290 | |
| Colagenase B | Roche | 11088831001 | |
| Colágeno-I, cauda de rato | Gibco | A10483-01 | |
| Microscópio confocal | Zeiss | LSM 700 e 800 | |
| DMEM (glicose alta 4,5 g/L) | Lonza | BE12-604F | |
| Dnase I | Citômetro | de fluxo 10104159001 | |
| Roche BD Biosciences | FACSCaliburTM | ||
| Matriz gelificante | ThermoFisher Scientific | A1413202 | Matrigel, Geltrex |
| Goat IgG, isotipo | DAKO | X 0907 | |
| Soro de Cavalo | SIGMA-ALDRICH | 12449-C | |
| Fibroblastos Pancreáticos Primários Humanos | PELOBiotech | PB-H-6201 | |
| Incubadora | Heraeus | B6060 | |
| Laminin-332 | Biolamina | LN332 | |
| MEM | Microplaca SIGMA-ALDRICH | M4655 | |
| , 96 poços, Greiner com fundo em U | 650101 | Bio-One | |
| Thermo Scientific | J1800AMNZ | ||
| Mouse IgG, isotipo | SIGMA-ALDRICH | I8765 | |
| Misturador rotativo de vários eixos | CAT | RM5 80V | |
| PANC-I | ATCC | Gentilmente cedido pelo Prof. Jorg | |
| Paraformaldeído de | Riedel-de Haë n | 16005 | |
| Penicilina/estreptomicina | Gibco | 15140-122 | |
| Kit de transcrição reversa QuantiTect | Qiagen | 205310 | |
| IgG de rato, isotipo | Invitrogen | 10700 | |
| Tubos de reação, 1,5 mL | Greiner Bio-One | 616201 | |
| Ciclador de PCR em tempo real | Qiagen | Rotor-Gene Q | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| Rotor Gene SYBR Green PCR Kit | Qiagen | 204074 | |
| RPMI | Lonza | BE12-702F | Adicione glicose a 4,5 g (filtro de 0,2 um) e 1% de piruvato de sódio |
| TritonX-100 | SIGMA-ALDRICH | X100RS | |
| Vó rtex | Scientific Industries | Vortex-Genie 2 | |
| μ-Slide Angiogênese, não revestido | Ibidi | 81501 |
Referências
- Pietilä, M., Ivaska, J., Mani, S. A. Whom to blame for metastasis, the epithelial-mesenchymal transition or the tumor microenvironment? Cancer Letters. 380 (1), 359-368 (2016).
- Heldin, C. -H., Rubin, K., Pietras, K., Ostman, A. High inters....
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Reimpressões e permissões
