Este protocolo descreve um método colorimétrico novo para a deteção antimaláricos do primaquina (pmq) em urinas sintéticos e em serums humanos.
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Artigo de método
Reação aperfeiçoada de Griess para a determinação UV-VIS e nu-olho do Primaquine anti-malarial
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Neste artigo
Resumo
Resumo
A primaquina (PMQ), uma importante droga antimalarial, tem sido recomendada pela Organização Mundial de saúde (OMS) para o tratamento de infecções que ameaçam a vida causadas por P. vivax e ovale. No entanto, o PMQ tem efeitos adversos indesejados que levam à hemólise aguda em pacientes com deficiência de glicose-6-fosfato desidrogenase (G6PD). Há uma necessidade de desenvolver métodos simples e confiáveis para a determinação do PMQ com o objetivo de monitoramento de dosagem. No início de 2019, temos relatado uma abordagem baseada em UV-VIS e olho nu para quantificação colorimétrica PMQ. A detecção foi baseada em uma reação de Griess-like entre o PMQ e as anilinas, que podem gerar produtos azo coloridos. O limite de detecção para a medição direta de PMQ em urina sintética está na faixa de nanomolar. Além disso, este método mostrou o grande potencial para a quantificação de PMQ das amostras humanas do soro em concentrações clìnica relevantes. Neste protocolo, descreveremos os detalhes técnicos sobre as sínteses e caracterização de produtos azo coloridos, a preparação do reagente e os procedimentos para determinação do PMQ.
Introdução
O pmq é uma das mais importantes drogas antimaláricas, ele funciona não apenas como um schizontocida tecidual para prevenir a recidiva, mas também como um gametocitocide para interromper a transmissão da doença1,2,3,4. A hemólise intravascular é um dos efeitos colaterais relacionados ao PMQ, que se torna extremamente grave naqueles deficientes em G6PD. Sabe-se que a desordem genética de G6PD é distribuída no mundo inteiro com uma freqüência do gene entre 3-30% em áreas endêmicas da malária. A gravidade da fraqueza do pmq depende do grau de deficiência de G6PD, bem como da dose e da duração da exposição ao pmq5,6. Para reduzir o risco, a OMS recomendou uma dose única baixa (0,25 mg base/kg) de PMQ para o tratamento da malária. No entanto, isso ainda é desafiado pelas variações na sensibilidade do fármaco do paciente5,7. A monitorização da dose é necessária para avaliar a farmacocinética após a administração de PMQ, que pode efetuar o ajuste posológico para um tratamento bem-sucedido com toxicidade limitada.
A cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) é a técnica mais utilizada para a determinação clínica do PMQ. Endoh et al. relataram um sistema de HPLC com detector de UV para quantificação sérica de PMQ usando uma coluna de gel de polímero C-188. Em seu sistema, as proteínas do soro foram precipitadas primeiramente com acetonitrile, e então o PMQ no sobrenadante foi separado para a HPLC. A curva de calibração foi linear sobre a faixa de concentração de 0,01-1,0 μg/mL8. Outro método baseado em uma HPLC de fase reversa com detecção de UV a 254 nm foi relatado para a quantificação de PMQ e seus principais metabólitos9. A curva de calibração para PMQ foi linear na faixa entre 0,025-100 μg/mL. Uma extração líquida-líquida adicional com hexano misto e acetato de etila como fase orgânica foi utilizada para a separação do PMQ com recuperação percentual alcançada para 89%9. Mais recentemente, Miranda et al. desenvolveram um método UPLC com detecção de UV a 260 nm para análise de PMQ em formulações de comprimidos com limite de detecção a 3 μg/mL10.
Embora os métodos da HPLC apresentem a sensibilidade prometedora na determinação da droga e a sensibilidade pode mais ser melhorada se o HPLC é equipado com um espectrómetro maciço, há ainda algumas desvantagens. As medidas diretas da droga em líquidos biológicos são geralmente inacessíveis pela HPLC, desde que muitas biomoléculas podem extremamente influenciar a análise. Extrações adicionais são necessárias para remover moléculas endógenas antes daanálise de HPLC11,12. Além disso, a deteção de PMQ por um detector HPLC-UV é executada tipicamente em seu comprimento de onda máximo da absorção (260 nanômetro).; no entanto, existem muitas moléculas endógenas em fluidos biológicos com uma forte absorvência a 260 nm (por exemplo, aminoácidos, vitaminas, ácidos nucleicos e pigmentos urocromo), interferindo assim com a detecção de UV do PMQ. Há a necessidade de desenvolver métodos simples e rentáveis para a determinação do PMQ com sensibilidade e seletividade razoáveis.
A reação de Griess foi apresentada pela primeira vez em 1879 como um teste colorimétrico para a detecção de nitrito13,14,15,16. Recentemente, esta reação tem sido extensivamente explorada para detectar não só nitrito, mas também outras moléculas biologicamente relevantes17,18,19,20. Nós temos relatado previamente o primeiro estudo sistemático de uma reação inesperada de Griess com PMQ (Figura 1). Neste sistema, o pmq é capaz de formar e coloridos quando acoplado com anilinas substituídas na presença de íons nitrito condições ácidas. Descobrimos ainda que a cor dos e variou de amarelo a azul ao aumentar o efeito de doação de elétrons do substituente nas anilinas21. Um método colorimétrico baseado na absorção UV-VIS para a quantificação de PMQ foi desenvolvido com a reação aperfeiçoada entre o 4-methoxyaniline e o PMQ. Este método demonstrou grande potencial para detecção sensível e seletiva de PMQ em fluidos biorelevantes. Aqui, pretendemos descrever os procedimentos detalhados para a determinação do PMQ com base nessa estratégia colorimétrica.
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Protocolo
1. síntese de AZOs coloridos
- Em um balão de fundo redondo de 25 mL (RBF), dissolva anilina (0,1 mmol) e bisfosfato de primaquina (45,5 mg, 0,1 mmol) em 10 mL de solução de H3po4 (5% v/v). Põr o RBF sobre um banho de gelo, adicione uma barra do stir com o tamanho apropriado na solução, e põr o RBF sobre uma placa do stir.
Nota: Para a síntese de azo 3G (Figura 2), utilizar 0,2 mmol de primaquina bisfosfato. - Dissolver NaNO2 (6,9 mg, 0,1 mmol) em 1 ml de água arrefecida e, em seguida, adicionar à mistura de reacção Dropwise. Retire o banho de gelo e mantenha a mistura de reacção agitada à temperatura ambiente.
- Monitore a reação com uma placa de cromatografia em camada fina (TLC) revestida com gel de sílica. Use uma mistura de diclorometano (DCM)/metanol (MeOH) (Vol/Vol = 5:1) como o eluente para TLC. O produto azo exibe manchas coloridas na placa TLC, que é fácil de distinguir por olhos nus. Pare a reação quando os pontos de PMQ desaparecem no TLC.
- Ajuste a mistura de reacção ao pH > 10 por NaOH (2 M) num banho de gelo. Use um funil de separação de 50 mL para extrair a mistura 3 vezes com 20 mL de acetato de etilo para cada um, combine e concentre a fase orgânica vácuo usando um evaporador rotativo.
Nota: Antes da extração, ajuste o valor de pH das soluções de reação acima de 10. Isso pode manter a amina primária como sua forma não-ionizada, facilitando assim a extração. - Purificar os resíduos por cromatografia flash com gel de sílica de fase reversa pressão normal, usando MeOH/H2o como o eluente. Seque a solução do produto através da liofilização para dar produtos azo desejados.
Nota: A mesma reação também pode ser realizada em soluções de HCl diluídas (0,2 M).
2. medições de UV-VIS e cálculo teórico
- Dissolver azo puro (50 μM) em água destilada ou em 5% H3po4 solução (pH 1,1), respectivamente. Grave os espectros de absorção UV-VIS (250-700 nm) num espectrofotômetro à temperatura ambiente (25 ° c). Exporte os dados como arquivos. xls/. xlsx para análise posterior.
-
Realize todos os cálculos teóricos para o próprio PMQ e produtos azo usando o programa Gaussian 16. Use a teoria funcional da densidade dependente do tempo (TD-DFT) com um jogo da base 6-31G. Inclua efeitos do solvente pelo formalismo polarizadas do modelo do continuum (PCM) usando a água.
- Use software (por exemplo, ChemDraw Office) para desenhar as estruturas e, em seguida, salvar a estrutura como um arquivo de entrada Gaussian (. gif).
- Abra o arquivo GIF com Gauss View e clique no botão calcular. Selecione configuração de cálculo Gaussian, opt + freqe Ground State-DFT-B3LYP-6-31G; em seguida, clique em Submit. A otimização de geometria gerará um arquivo. log.
- Seguindo o procedimento acima, use Gauss View para abrir este arquivo de log. Clique em calcular-configuração de cálculo Gaussian e selecione energia e td-SCF-DFT-B3LYP-6-31G-singlet somente. Em seguida, submeter. O cálculo de energia gerará outro arquivo de log e um arquivo de cubo.
- Use Gauss View para abrir o arquivo de log a partir do cálculo de energia. Clique em Results-UV/VIS para ver a absorção prevista.
- Use Gauss View para abrir o arquivo de cubo. Clique em resultados e selecione superfície e contornos-ações de superfície e nova superfície para ver as órbitas.
-
Compare os resultados da medida experimental e do cálculo Gaussian. Calcule o erro percentual entre os valores calculados e medidos, de acordo com a equação a seguir.
Erro = | (WMax Cal.-wMaxexper.) /WMaxexper. | × 100%
onde WMax Cal. representa o comprimento de onda máximo da absorvância do cálculo teórico e do exper de WMax . representa o comprimento de onda do resultado experimental.
3. determinação do PMQ
- Medição de pmq usando uma placa 96-well (Figura 5)
- Dissolver 4-methoxyaniline em 0,2 M HCl para uma solução de anilina de 200 mM, R1. Dissolver o nitrito de sódio em água destilada para obter uma solução de 5 mM, R2. Mantenha todas as soluções na geladeira a 4 ° c antes de usar.
- Adicione 100 μL de R1 em uma placa 96-well, e adicione 50 μL do PMQ que contem a amostra na placa para misturar com o R1. Em seguida, adicione 50 μL de R2 na placa. Misture as soluções através de pipetagem repetida.
- Mantenha a placa à temperatura ambiente durante 15 minutos e, em seguida, grave a absorvância UV-Vis a 504 nm. Repita 3x para cada teste. O produto do azo é estável com exposição clara do quarto; Não é necessário manter a placa a obscuridade.
- Exporte os dados como arquivos. xls/. xlsx para análise posterior.
- Curva de calibração para medição direta de PMQ em amostra de urina
- Prepare soluções de PMQ usando urina sintética com concentrações de PMQ em 0, 1, 2, 5, 10, 20, 50, 100, 200 μM, respectivamente.
- Adicione 100 μL de R1 em uma placa 96-well, e adicione 50 μL da solução da urina de PMQ para misturar com o R1. Em seguida, adicione 50 μL de R2 à mistura acima. Misture as soluções através de pipetagem repetida. Mantenha a placa à temperatura ambiente durante 15 minutos e, em seguida, grave a absorvância UV-Vis a 504 nm.
- Gerar uma curva de calibração com base na absorvência I504 e concentrações de pmq. Use os valores dos poços sem o PMQ como um espaço em branco e subtraia os valores em branco de todos os testes antes do processamento de dados.
- Realize um ajuste linear para gerar as equações lineares como y = ax + b, onde y é a intensidade da absorvência em 504 nm, X é a concentração de pmq, a é a inclinação, e b é o intercepto y da linha linear.
- Curva da calibração para a medida direta de PMQ em uma amostra humana do soro
- Prepare soluções de PMQ usando soro humano com concentrações de PMQ em 0, 1, 2, 5, 10, 20, 50, 100, 200, μM respectivamente.
- Adicione 100 μL de R1 em uma placa 96-well e adicione 50 μL da solução do soro de PMQ para misturar com o R1. Adicione 50 μL de R2 à mistura acima e misture as soluções por pipetagem repetida. Mantenha a placa à temperatura ambiente durante 15 minutos e, em seguida, grave a absorvância UV-Vis a 504 nm. Exporte os dados como arquivo. xls/. xlsx para análise posterior.
- Gerar uma curva de calibração com base na absorvência I504 e concentrações de pmq. Use os valores dos poços sem o PMQ como um espaço em branco e subtraia os valores em branco de todos os testes antes do processamento de dados.
- Realize um ajuste linear para gerar as equações lineares como y = ax + b, onde y é a intensidade da absorvência em 504 nm, X é a concentração de pmq, a é a inclinação, e b é o intercepto y da linha linear.
- Extração de PMQ do soro
- Adicione uma certa quantidade de PMQ no soro humano para simular o soro contendo PMQ. Para a extração de PMQ, adicione 6 mL de mistura de acetato de etila/hexano (7:1 v/v) em 2 mL de soro contendo PMQ em um tubo de centrífuga de 15 mL.
- Adicionar 100 μL de solução de hidróxido de sódio (2 M) ao sistema de extracção. Agitar violentamente o tubo usando um misturador Vortex para 30 s. colete a camada orgânica e concentre-a usando um evaporador rotativo vácuo.
- Redissolva o resíduo com 200 μL de água destilada e remova os componentes lipídicos insolúveis por filtração através de uma membrana em forma de disco com tamanho de poros de 220 nm. Use a solução final para o teste.
- Determine o PMQ do soro com extração
- Siga as etapas 3,2 ou 3,3 para gerar a curva de calibração para PMQ em água destilada. Extraia o pmq de soros contendo pmq de acordo com a etapa 3,4.
- Adicionar 100 μL de R1 e 50 μL de solução de PMQ em uma placa de 96 poços. Adicione 50 μL de R2 à mistura acima, e misture as soluções por pipetagem repetida.
- Mantenha a placa à temperatura ambiente durante 15 min e grave a absorvância UV-Vis a 504 nm. Use os poços com R1 e R2 mas sem PMQ como controles. Exporte os dados como arquivos. xls/. xlsx para análise posterior.
- Subtrair os valores de controle dos valores de absorbância I504 para cada teste e, em seguida, use o resultado para cálculos de concentração de acordo com a equação do forro da curva de calibração.
Nota: O limite de detecção (LOD) para PMQ em todos os casos pode ser calculado de acordo com um método padrão22. O cálculo baseou-se na função de calibração: LOD = 3,3 × SD/b, onde SD é o desvio padrão do espaço em branco e b é a inclinação da linha de regressão
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Resultados
Para otimizar as condições de reação (Figura 2), várias anilinas foram usadas para o casal com pmq através da reação de Griess. Nós alcançamos uma série de e com cores diferentes. Verificou-se que anilinas com um elétron doar substituente pode causar uma mudança de vermelho no espectro de absorção UV-VIS. Os cálculos teóricos foram realizados por meio da teoria funcional da densidade dependente do tempo (TD-DFT). Conforme apresentado na Figura 2a, o resultado do...
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Discussão
Nós descrevemos um método colorimétrico para a quantificação conveniente de PMQ. É potencialmente o método de corrente mais simples e rentável. Mais importante, este método oferece permite a medição de PMQ com base no olho nu sem usar nenhum equipamento.
A reação aperfeiçoada de Griess para a deteção de PMQ pode gerar um azo da cor vermelha com uma absorção máxima em 504 nanômetro. A influência potencial da absorção UV-VIS de biomoléculas endógenas é limitada, fazendo assim o método prometedor...
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Divulgações
Os autores não têm nada a declarar.
Agradecimentos
Os autores reconhecem a concessão do start-up da Universidade de Guangzhou da medicina chinesa e do projeto de treinamento da pesquisa científica da juventude de GZUCM (2019QNPY06). Nós igualmente reconhecemos o centro médico da pesquisa de Lingnan da Universidade de Guangzhou da medicina chinesa para o apoio em facilidades.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 4-Metoxianilina | Aladdin | K1709027 | |
| 2,4-Dimetoxianilina | Heowns | 10154207 | |
| 3,4-Dimetoxianilina | Bidepharm | BD21914 | |
| 4-Metilanilina | Adamas-beta | P1414526 | |
| 4-Nitroanilina | Macklin | C10191447 | |
| 96-poços, Flat Botton | Labserv | ||
| Gaussian@16 software | Gaussian, Inc | Versão: x86-64 habilitado para SSE4_2 / Linux | |
| Ácido clorídrico | GCRF | 20180902 | |
| esboço de Marvin (software) | Edição gratuita CHEMAXON | : 15.6.29 | |
| Ácido fosfórico | Macklin | C10112815 | |
| Primaquina bisifosfato | 3A Produtos Químicos | ||
| sódio | Alfa Aesar | 5006K18R | |
| Sulfonamidas | TCI (shanghai) | GCPLO-BP | |
| Varioskan LUX Leitor de placas | Thermo Fisher | fornecido com o software SkanIt 4.1 |
Referências
- Fernando, D., Rodrigo, C., Rajapakse, S. Primaquine in vivax malaria: an update and review on management issues. Malar Journal. 10, 351(2011).
- Deng, C., et al. Large-scale Artemisinin-Piperaquine Mass Drug Administration With or Without Primaquine Dramatically Reduces Malaria in a Highly Endemic Region of Africa. Clinical Infectious Diseases. 67 (11), 1670-1676 (2018).
- Pavic, K., et al. Primaquine hybrids as promising antimycobacterial and antimalarial agents. European Journal of Medical Chemistry. 143, 769-779 (2018).
- McQueen, A., et al. Synthesis, characterization, and cellular localization of a fluorescent probe of the antimalarial 8-aminoquinoline primaquine. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 27 (20), 4597-4600 (2017).
- Ashley, E. A., Recht, J., White, N. J. Primaquine: the risks and the benefits. Malaria Journal. 13 (1), 418(2014).
- Watson, J., Taylor, W. R., Menard, D., Kheng, S., White, N. J. Modelling primaquine-induced haemolysis in G6PD deficiency. Elife. 6, (2017).
- Beutler, E. Glucose-6-phosphate dehydrogenase deficiency: a historical perspective. Blood. 111 (1), 16-24 (2008).
- Endoh, Y. S., et al. High-performance liquid chromatographic determination of pamaquine, primaquine and carboxy primaquine in calf plasma using electrochemical detection. Journal of Chromatography B: Biomedical Sciences and Applications. 579 (1), 123-129 (1992).
- Dua, V. K., Kar, P. K., Sarin, R., Sharma, V. P. High-performance liquid chromatographic determination of primaquine and carboxyprimaquine concentrations in plasma and blood cells in Plasmodium vivax malaria cases following chronic dosage with primaquine. Journal of Chromatography B: Biomedical Applications. 675 (1), 93-98 (1996).
- Miranda, T. A., Silva, P. H. R., Pianetti, G. A., César, I. C. Simultaneous quantitation of chloroquine and primaquine by UPLC-DAD and comparison with a HPLC-DAD method. Malaria Journal. 14, 29(2015).
- Tatsuno, M., Nishikawa, M., Katagi, M., Tsuchihashi, H. Simultaneous determination of illicit drugs in human urine by liquid chromatography-mass spectrometry. Journal of Analytical Toxicology. 20 (5), 281-286 (1996).
- Erni, F. Use of high-performance liquid chromatography in the pharmaceutical industry. Journal of Chromatography A. 507, 141-149 (1990).
- Tsikas, D. Analysis of nitrite and nitrate in biological fluids by assays based on the Griess reaction: Appraisal of the Griess reaction in the l-arginine/nitric oxide area of research. Journal of Chromatography B. 851 (1), 51-70 (2007).
- Zurcher, D. M., Adhia, Y. J., Romero, J. D., McNeil, A. J. Modifying a known gelator scaffold for nitrite detection. Chemical Communications. 50 (58), 7813-7816 (2014).
- Kunduru, K. R., Basu, A., Tsah, T., Domb, A. J. Polymer with pendant diazo-coupling functionality for colorimetric detection of nitrates. Sensors and Actuators B: Chemical. 251, 21-26 (2017).
- Li, D., Ma, Y., Duan, H., Deng, W., Li, D. Griess reaction-based paper strip for colorimetric/fluorescent/SERS triple sensing of nitrite. Biosensors and Bioelectronics. 99, 389-398 (2018).
- Deng, T., et al. A novel strategy for colorimetric detection of hydroxyl radicals based on a modified Griess test. Talanta. 195, 152-157 (2019).
- Pang, H., et al. A photo-responsive macroscopic switch constructed using a chiral azo-calix[4]arene functionalized silicon surface. Chemical Communications (Camb). 54 (24), 2978-2981 (2018).
- Kaur, N., Dhaka, G., Singh, J. Simple naked-eye ratiometric and colorimetric receptor for anions based on azo dye featuring with benzimidazole unit. Tetrahedron Letters. 56 (9), 1162-1165 (2015).
- Liu, F., Lou, J., Hristov, D. X-Ray responsive nanoparticles with triggered release of nitrite, a precursor of reactive nitrogen species, for enhanced cancer radiosensitization. Nanoscale. 9 (38), 14627-14634 (2017).
- Deng, T., et al. An unexpected Griess reaction on the important anti-malarial drug primaquine and its application for drug determination. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 171, 8-14 (2019).
- Shrivastava, A., Gupta, V. Methods for the determination of limit of detection and limit of quantitation of the analytical methods. Chronicles of Young Scientists. 2 (1), 21-25 (2011).
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Reimpressões e permissões
