Teste de imunohistoquímica para a detecção de antígenos lyssavírus a partir de tecidos fixos formalina

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo de teste de imunohistoquímica para a detecção de antígenos do vírus da raiva como um teste de diagnóstico alternativo para tecidos fixos de formalina.

Resumo

Uma das principais modalidades de diagnóstico para raiva é a detecção do complexo de ribonucleoproteína viral (RNP) nas amostras de tecido infectado. Embora o teste de anticorpos fluorescentes diretos (DFA) ou o teste imunohistoquímico rápido direto (DRIT) sejam mais comumente utilizados para a detecção de antígenos, ambos os testes requerem tecidos frescos e/ou congelados para impressões em lâminas antes da detecção de antígenos usando anticorpos. Se as amostras forem coletadas e fixadas em formalina, nenhum dos testes é ideal para a detecção de antígenos, no entanto, os testes podem ser realizados pela imunohistoquímica convencional (IHC) após a incorporação em blocos de parafina e secção. Com este método IHC, os tecidos são manchados com anticorpos antirraiva, seções são desparafinadas, antígenos recuperados por proteólise parcial ou outros métodos, e incubados com anticorpos primários e secundários. Os antígenos são manchados usando peroxidase de rabanete / amino etil carbazole e contra-manchados com hematoxilina para a visualização usando um microscópio leve. Além da detecção específica de antígenos, a fixação de formalina oferece outras vantagens como a determinação de alterações histológicas, condições relaxadas para armazenamento e transporte de amostras (sob temperaturas ambientes), capacidade de testar casos retrospectivos e maior segurança biológica através da inativação de agentes infecciosos.

Introdução

A raiva é uma encefalite progressiva aguda causada pelo sentido negativo vírus RNA pertencentes ao gênero lyssavirus¹. Quase 99% de todas as mortes humanas causadas pela infecção pelo vírus da raiva (RABV), o tipo de membro do gênero, é transmitida por cães². O diagnóstico de raiva de animais suspeitos baseia-se na detecção de antígeno (principalmente nucleoproteína codificada viral, n proteína) em complexo com RNA genômico (complexo de ribonucleoproteína, RNP) no tecido cerebral³. A detecção de antígeno pelo teste de anticorpo fluorescente direto (DFA) é considerada o padrão-ouro para o diagnóstico da raiva⁴. O método utiliza material cerebral congelado fresco ou fresco, uma impressão de toque em um slide, fixação em acetona, coloração usando isothionato fluorescente comercialmente disponível (FITC) rotulados anticorpos monoclonais ou policclonais (mAbs/pAbs) e lidos pela microscopia de fluorescência⁵. O teste de DFA é rápido, sensível e específico para detecção de antígeno de raiva em tecido cerebral fresco. Recentemente, foi demonstrado um teste imunohistoquímico rápido direto (DRIT), a técnica de imunohistoquímica modificada (IHC), que apresentou sensibilidade semelhante à DFA, mas oferece a vantagem da microscopia leve para visualização⁶. Embora o método de detecção utilizado no DRIT seja semelhante ao IHC, a etapa inicial utiliza tecidos frescos ou congelados para gerar impressões de toque da amostra seguidas de fixação em formalina.

IHC é uma técnica amplamente utilizada para determinar alterações histológicas e detecção de proteínas usando anticorpos específicos em tecidos fixos de formalina embutidos em blocos de parafina. IHC é um teste alternativo estabelecido para a detecção de antígenos da raiva nas seções teciduais⁷. A IHC tem sido particularmente utilizada para o diagnóstico de casos retrospectivos que apresentaram doenças neurológicas para determinar a carga da raiva⁸. Tecidos fixos de formalina embutidos em parafina preservam as proteínas para a detecção mesmo após vários anos quando armazenados à temperatura ambiente⁹. O tratamento formalin modifica as proteínas ao intercruzar e alterar as cadeias laterais de aminoácidos, o que pode tornar os epítoes não mais reativos contra anticorpos¹⁰. Embora o teste de IHC para detecção de antígenos da raiva envolva mAbs ou pAbs, este último é vantajoso, pois múltiplos epítopos e lyssavírus divergentes podem ser detectados¹¹.

As etapas padrão envolvidas no IHC são a fixação formalina de tecidos, incorporação em blocos de parafina, secção de tecidos, desparafinação e hidratação, recuperação de epítopes, reatividade contra anticorpos primários e secundários e o desenvolvimento usando substratos cromogênicos. Este manuscrito descreve um relato detalhado do protocolo para diagnóstico de raiva. Para detecção de antígeno da raiva, o soro de camundongos imunizado com RABV (pAbs) gerado nos Centros de Controle e Prevenção de Doenças dos EUA (CDC) Atlanta, Geórgia, em combinação com anticorpos secundários anti-camundongos biotinilados são utilizados. O Abs biotinilado é detectado pela adição do complexo de peroxidase de rabanete streptavidin-horseradish (HRP), seguido pelo desenvolvimento de cores com substrato de amino-etilcarbazol.

Protocolo

Enquanto o protocolo IHC foi realizado em tecidos fixos de formalina, que inativam rabv se presente, protocolos de biossegurança apropriados devem ser devidamente seguidos. Todos os procedimentos de biossegurança estão descritos na Biossegurança nos Laboratórios Microbiológicos e Biomédicos (BMBL) 5ª Edição (https://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/index.htm), incluindo o uso de equipamentos de proteção individual (EPI) adequados e exigência de vacinação conforme descrito¹². Além disso, deve ser seguida a contenção e manuseio adequados de produtos químicos perigosos (como formalina, AEC e xileno), (por exemplo, capuzes de fumaça).

1. Fixação formalina de tecidos

1. Coloque 3-5 mm de tecido cerebral coletado após a necropsia¹³ em 10% de solução de formalina tamponada fosfato (1:20 a 1:50 razão tecido/formalina) para 24-72 h.
   ATENÇÃO: Formalina é um fixador tóxico.
2. Registo o peso aproximado do tecido (tamanho), o tipo de tecido (áreas cerebrais) e o volume de formalina. É importante que os laboratórios documentem e mantenham registros sobre os tempos de fixação.
3. Para maior armazenamento de tecido após fixação de formalina e antes do processamento, coloque o tecido em 70% de etanol.

2. Processamento de tecidos

1. Após a fixação da amostra, disseque o tecido para incluir as áreas cerebrais importantes, por exemplo, seções transversais do tronco cerebral, cerebelo (3 lóbulos) ou hipocampo (ambos hipocampi) cortaram de 3 a 5 mm de espessura e colocados em de processamento.
2. Processe as fitas de tecido para infiltração de cera de parafina, embutidas em blocos de parafina e seccionadas (3 a 6 μm) em um microtome.

3. Preparação de Materiais / Pratos de coloração

1. Configure o prato de coloração¹⁴ (Tabela de Materiais),conforme mostrado na Figura 1. Encha cada prato com 250 mL da solução.
2. Preparação da solução de estoque de substrato 3-Amino-9-ethylcarbizol (AEC)
   1. Dissolva um comprimido de 20 mg de 3-amino 9-ethylcarbazole (AEC) em 5 mL de N,N, dimetilformamida usando uma pipeta de vidro.
      ATENÇÃO: A AEC é um cancerígeno.
3. Preparação da solução de estoque protease (por exemplo, Pronase) para a recuperação de antígenos
   1. Dissolva 7 mg do protease em 200 mL de PBS.
4. Preparação do tampão de enxaguar PBS-T
   1. Adicione 10 mL de Tween 80 a 990 mL de PBS. Misture bem para formar uma solução homogênea.

4. Desparafinação e reidratação tecidual

1. Faça uma seção de parafina de 5 μm usando um microtome, flutue-a em um banho de água a 38 °C e colete em lâminas de vidro. Rotule os slides com uma caneta/marcador resistente ao reagente.
2. Coloque os slides sobre uma bandeja e derreta em um forno de 55-60 °C por 1 h. Não aumente a temperatura acima de 60 °C, pois pode destruir o antígeno viral.
3. Retire os slides do forno e desparafinar imediatamente em 3 lavagem de xileno consecutivo de 5 min cada nos pratos 1, 2 e 3.
4. Reidratar as seções no slide por imersões sequenciais na diminuição da diluição do etanol para a água desionizada: (4 a 11 é um mergulho enxaguar) prato 4: xileno/100% etanol (1:1); prato 5: 100% etanol; prato 6: 100% etanol; prato 7: 95% etanol; prato 8: 95% etanol; prato 9: 80% etanol; prato 10: 70% etanol; prato 11: água deionizada(Figura 1. Configuração de pratos).
   ATENÇÃO: O xileno é um produto químico perigoso e o trabalho deve ser conduzido em um capô de fumaça.

5. Recuperação de antígeno proteolítico

1. Trate slides com a protease (2,5 μg/mL de PBS) por 30 min para recuperação de antígeno proteolítico no prato 12.
2. Em seguida, enxágue em PBS-T por 10 min (prato 13).
3. Trate com 3% de peróxido de hidrogênio por 10 min (prato 14).
4. Novamente, lave com PBS-T por 10 min (prato 15).

6. Procedimento de coloração

1. Manuseie slides um de cada vez mantendo os slides restantes submersos no buffer (não remova todo o suporte de lâminas - mantenha os slides molhados). Remova um slide e limpe o excesso de tampão (usando uma toalha de papel) ao redor da seção tecidual, tomando cuidado para não perturbar a seção do tecido. Incubar lâminas em uma câmara de umidade, feita colocando toalhas de papel umedecidas, no banco de laboratório superior¹⁴ em temperatura ambiente com soro de cabra normal (bloqueio) por 15 minutos.
2. Incubar com o anticorpo antirraiva primário pré-determinado ideal de diluição (1:250 diluição do soro antirrábica do camundongo, inédito) (controle positivo) e anticorpos de controle negativos à temperatura ambiente mesmo que acima (passo 6.1.) por 60 minutos sem lavagens no meio.
3. Depois de 60 min, lave com PBS-T por 10 min (prato 16).
4. Incubar com o anticorpo biotinilado (espécies específicas) em uma câmara de umidade à temperatura ambiente por 15 minutos (manuseando o mesmo que o passo 6.1.).
5. Lave com PBS-T por 10 min (prato 16).
6. Incubar com complexo Streptavidin-HRP em uma câmara de umidade à temperatura ambiente por 15 minutos (manuseando o mesmo que 6.1.).
7. Lave com PBS-T por 10 min (prato 16).
8. Incubar com substrato peroxidase, amino-etilcarbazol (AEC), em uma câmara de umidade em temperatura ambiente por 10 minutos. Faça AEC pouco antes de usar. Para isso, adicione 1 mL de solução de estoque AEC a 14 mL de tampão de acetato de 0,1M, pH 5.2. Adicione 0,15 mL de 3% H₂O₂. Filtre a mistura pouco antes do uso (filtro de 0,45 μm).
   NOTA: A solução de trabalho da AEC é apenas estável por 2-3 h. A solução de estoque AEC pode ser armazenada na geladeira por períodos mais longos.
9. Lave em água deionizada 10 min (prato 17)
10. Contra-manchada com hematoxilina de Gill diluída 1:2 com água deionizada por 2 min (prato 18).
11. Enxágüe o excesso de hematoxilina com enxaguação de água deionizada (prato 19 e 20).
12. Enxágüe no prato 30 s (solução bluing) da Torneira de Scott.
13. Lave em água deionizada 10 min (prato 22)
14. Remova slides um de cada vez - monte com meio de montagem solúvel em água.
15. Leia slides em um microscópio leve.

Resultados

A Figura 2 demonstra resultados representativos de coloração do IHC de amostras de controle positivas e negativas em diferentes tecidos cerebrais testados. A Figura 2A,D,G representa amostras positivas em 200x, enquanto a Figura 2B,E,H corresponde à ampliação de 400x, respectivamente. Figura 2A-C correspondem ao tronco c...

Discussão

Devido à alta taxa de letalidade da raiva após o início dos sintomas, o diagnóstico de animais suspeitos para infecção por RABV é extremamente crítico para um tratamento profilático pós-exposição adequado. O diagnóstico da raiva depende principalmente de técnicas baseadas em DFA, DRIT e PCR usando tecidos frescos ou congelados. Para testes de tecidos fixos de formalina, o teste IHC fornece um método alternativo para a detecção sensível e específica do antígeno RABV. Embora os tecidos fixados em formalina tenham proteínas...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
3% de peróxido de hidrogênio		Pharamacy	Fora da prateleira 3% H2O2
3-Amino-9-etilcarbazol (AEC)	Millipore Sigma	A6926
Tampão de acetato pH 5.2	Poly Scientific R& D Corp.	s140
Formalina Tamponada 10% Fosfato Tampolado	Fisher Scientific	SF100-4	Certificado
Lamínulas Corning	Fisher Scientific	12-553-471	24 X 50 mm
Etanol 190 Prova	Pharmco-AAPER	111000190
Etanol 200 Prova	Pharmco-AAPER	111000200
Formulação de hematoxilina de Gill #2	Fisher Scientific	CS401-1D
	HistoMark seracare	71-00-18	Anticorpo Primário de Camundongo
ImmunoHistoMount	Millipore Sigma	i1161	Mídia de montagem
N,N, Dimetil formamida GR	Fisher Scientific	D119
Phosphate Buffered Saline	HyClone	RR14440.01	01M, pH 7.2 (pH 7.2-7.6)
Plan-APOCHROMAT 40X/0.95 Objetivo	Vários fornecedores
Plan-APOCHROMATIC 20X/0.75 Objetivo	Vários fornecedores
Pronase	Millipore Sigma	53702	Protease, Streptomyces griseus
Scott's Tap Water	Poly Scientific R& D Corp.	s1887
Tissue-Tek Conjunto de manchas deslizantes	Fisher Scientific	50-294-72
TWEEN-80	Millipore Sigma	P1754
Xylene	Fisher Scientific	X3S-4	Grau Histológico
Zeiss Axioplan 2 imagem - microscópio	Vários fornecedores