Geração de Axolotis Quiméricos com Membros Haploides Mutantes através de enxerto embrionário

Resumo

Este objetivo deste protocolo é produzir axolotos quiméricos com membros dianteiros haploides derivados de tecido doador mutagenizado de Cas9 usando técnicas de enxerto de tecido embrionário.

Resumo

Um conjunto crescente de técnicas e recursos genéticos permite aos pesquisadores sondar as origens moleculares da capacidade de algumas espécies de salamandras, como axolotlas, de regenerar membros inteiros como adultos. Aqui, delineamos técnicas usadas para gerar axolotas quiméricas com membros dianteiros haploides haploides mutagenizados cas9 que podem ser usados para explorar a função genética e a fidelidade da regeneração dos membros. Combinamos várias técnicas embrionárias e genéticas, incluindo geração haploide via ativação in vitro, mutagênese CRISPR/Cas9 e enxerto de tecido em um protocolo para produzir um sistema único para triagem genética haploide em um organismo modelo de regeneração. Essa estratégia reduz o número de animais, espaço e tempo necessários para a análise funcional dos genes na regeneração dos membros. Isso também permite a investigação de funções específicas de regeneração de genes que podem ser necessárias para outros processos essenciais, como organogênese, morfose tecidual e outros processos embrionários essenciais. O método descrito aqui é uma plataforma única para a realização de triagem genética haploide em um sistema de modelo vertebrado.

Introdução

Historicamente, o enxerto de tecido embrionário em anfíbios tem sido uma técnica importante para explorar mecanismos fundamentais de biologia e regeneração do desenvolvimento. O axolotl, uma espécie de salamandra, possui uma impressionante capacidade de regenerar tecidos e estruturas complexas, como membros e órgãos após lesões ou amputação. Da mesma forma impressionante, eles podem receber, sem rejeição, enxertos teciduais de outros indivíduos nos estágios embrionário, juvenil e adulto^1,2,3. Regiões de embriões que produzem estruturas inteiras como membros, caudas, olhos e c....

Protocolo

Os procedimentos experimentais utilizados neste protocolo foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Yale (IACUC, 2017-10557) e estavam de acordo com todas as políticas e diretrizes federais que regem o uso de animais vertebrados. Todos os experimentos em animais foram realizados em Ambystoma mexicanum (axolotls) em instalações da Universidade de Yale.

1. Geração de embriões diploidedos

1. Obtenha embriões diploides GFP+ para servir como hospedeiros de enxerto através de acasalamento natural usando um ou dois pais gfp ²⁴.
2. Colete ovos di....

Resultados

O desenvolvimento de embriões haploides pode ser distinguido de embriões diploides pelo fenótipo²⁹da sua "síndrome haploide". Em estágio de enxerto, os embriões haploides exibem curvatura reduzida ao longo do eixo anterior-posterior e cerco incompleto do plugue de gema (Figura 3A). Um microscópio fluorescente pode ser usado para garantir que os embriões haploides estejam livres de expressão gfp paternalmente derivada

Discussão

Existem alguns passos críticos em nosso protocolo para gerar quimeras haplóide-ddiploide que o técnico operacional deve considerar para resultados consistentes de enxerto.

A razão mais provável para a geração haploide falhar é devido às más condições de ativação in vitro. As quantidades adequadas de espermatozoides motile devem ser usadas para ativar óvulos. Para prolongar a motilidade, as amostras de esperma devem ser sempre mantidas a 4 °C. Antes de aplicar qualquer amostra de esperma aos óv.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
#55 Dumont Forceps	Fine Science Tools	11295-1	Use apenas material Dumostar (pode ser autoclavado)
Anfotericina B	Sigma Aldrich	A2942-20ML	20 mL
Antibiótico-Antimicótico 100x	Thermo Fisher	15240062
Ciprofloxacina	Sigma Aldrich	17850-5G-F
Ficoll 400 (polissacarose 400)	bioworld	40600032-3	Ficoll 400
Gentamicin	Sigma Aldrich	G1914-250MG
Incubadora de Aquecimento/Resfriamento	RevSci	RS-IF-233
Gonadotrofina Coriônica Humana	Merk		Chorulon
Megascript T7 Kit de Transcrição	Thermo Fisher	AM1334	40 reações
Miroscópio Estágio de Resfriamento	Brook Industries	Proteína
PNAbio	CP01-200	NLS Cas9	4 tubos de ensaio de 50 µ g proteína cada
Plasmocin	Invivogen	ant-mpt-1	Nível de tratamento
Receitas
1,0x Solução de Ringer modificada de Marc (MMR)			0,1 M NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 0,1 mM EDTA, 5 mM HEPES (pH 7,8), ph 7,4
de			20 mM NaCl, 0,2 mM KCl, 0,8 mM NaHCO3, 0,2 mM CaCl2, 4 mM MgSO4, pH a 7,4

de feita sob encomenda Solução Holtfreter a 40%