Apresentado aqui é um protocolo para o uso de alginato como polímero na microencapsulação de células imortalizadas para entrega a longo prazo de biológicos aos olhos de roedores.
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Artigo de método
Tecnologia celular encapsulada para a entrega de biológicos ao olho do rato
Neste artigo
Resumo
Resumo
Muitas terapêuticas atuais em desenvolvimento para doenças do pólo posterior do olho são biológicas. Estes medicamentos precisam ser administrados com freqüência, tipicamente através de injeções intravitreais. As células encapsuladas que expressam o biológico de escolha estão se tornando uma ferramenta para a produção e liberação de proteínas locais (por exemplo, via entrega de medicamentos a longo prazo). Além disso, os sistemas de encapsulamento utilizam materiais permeáveis que permitem a difusão de nutrientes, resíduos e fatores terapêuticos dentro e fora das células. Isso ocorre enquanto mascara as células da resposta imune do hospedeiro, evitando a necessidade de supressão do sistema imunológico hospedeiro. Este protocolo descreve o uso de alginato como um polímero em microencapsulamento juntamente com o método de eletrospray como uma técnica de microencapsulamento. As células ARPE-19, uma linha de células RPE humanas espontaneamente surgidas, tem sido usada em experimentos de terapia celular de longo prazo devido à sua funcionalidade de vida, e é usada aqui para encapsulamento e entrega das cápsulas aos olhos do rato. O manuscrito resume os passos para microencapsulamento celular, controle de qualidade e entrega ocular.
Introdução
As terapias baseadas em células representam técnicas biológicas revolucionárias que têm sido amplamente aplicadas na medicina. Recentemente, eles têm sido aplicados com sucesso no tratamento de doenças neurodegenerativas, doenças oculares e câncer. As terapias celulares abrangem uma ampla gama de campos, desde a substituição celular até a entrega de medicamentos, e este protocolo se concentra neste último. Microcápsulas de alginato biodegradável (MC) têm mostrado eficácia como um sistema de parto, e estão se tornando amplamente utilizadas no campo biomédico. O alginato tem sido utilizado na microencapsulação devido ao seu processo simples de gelagem, biodegradabilidad....
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Protocolo
Todos os experimentos foram realizados de acordo com a Declaração ARVO para o Uso de Animais em Pesquisa Oftalmológica e de Visão e foram aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais da Universidade Médica da Carolina do Sul sob o protocolo ID 00399.
1. Cultura Celular
- Gerar células epiteliais de pigmento da retina humana (ARPE-19) expressando o gene de escolha de acordo com os protocolos publicados14,15.
- Manter células no Meio Águia Modificada (DMEM) de Dulbecco suplementada com 10% de soro bovino fetal (FBS).
- Incubar as células a 37 °C e 5% de C....
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Resultados
As células ARPE-19 são uma linha celular rpe humana espontaneamente imortalizada que tem se mostrado passível de encapsulamento e sobrevivência a longo prazo após a implantação de cápsulas no olho. As ferramentas para encapsulamento de alginato são mostradas na Figura 1. Neste estudo, foi demonstrado que após o encapsulamento em alginato, as células em cápsulas de alginato foram confirmadas por imagem de campo brilhante(Figura 2A). Ensaios de mortos vivos foram .......
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Discussão
Esta técnica de encapsulamento celular é relativamente rápida e fácil de executar; no entanto, alguns pontos devem ser mantidos em mente para obter resultados precisos a jusante. As células devem ser mantidas na cultura em uma placa de Petri antes do encapsulamento e mantidas em confluência adequada. O encapsulamento deve ser realizado em uma capa de ventilação adequada com fluxo de ar regulado, se possível. Uma corrente de ar muito forte pode afetar a formação de cápsulas, especialmente em experimentos de longo prazo. U.......
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Divulgações
Os autores não declaram interesses financeiros concorrentes.
Agradecimentos
O estudo foi apoiado, em parte, por subvenções concedidas a B. R. pelos Institutos Nacionais de Saúde (R01EY019320), pelo Departamento de Assuntos dos Veteranos (RX000444 e BX003050) e pelo South Carolina SmartState Endowment.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Seringa de 3 mL | BD | 309656 | |
| 30 G 1" Agulha romba | SAI Tecnologia de infusão | B30-100 | |
| Sal de sódio de ácido algínico, de algas marrons | Sigma | A0682 | |
| Sulfato de atropina Solução oftalmólica (1%) | Akorn | NDC 17478-215-15 | para dilatação da pupila |
| BD 1 mL Seringa 26 G x 3/8 (0,45 mm x 10 mm) | Becton, Dickinson e Empresa | DG518105 500029609 REF 309625 | para gerar o orifício guia |
| Cloreto de cálcio, anidro, granular | Sigma | C1016 | |
| GenTeal Tears | Alcon | NDC 0078-0429-47 | para lubrificar os olhos durante a anestesia |
| Goniotaire: Hipromelose (2,5%) Solução Oftalmólica Demoliente (Estéril) | Altaire Pharmaceuticals Inc. | NDC 59390-182-13 | para lubrificar os olhos durante a anestesia |
| Hamilton Ponta da agulha/seringa: 27 G, Small Hub RN NDL, comprimento do cliente (12 mm), estilo de ponta 3, 6/PK | Hamilton | 7803-01 | para administração intravítrea de cápsulas |
| Seringa Hamilton: 2,5 µ L, Modelo 62 RN SYR, NDL Vendido separadamente | Hamilton | 7632-01 | para entrega intravítrea de cápsulas |
| Tampão HEPES, 1 M | Bioreagentes Fisher | BP299100 | |
| Gerador de alta tensão | ESD EMC Technology | ES813-D20 | |
| LIVE/DEAD Kit de Viabilidade/Citotoxicidade | Thermofisher Scientific | L3224 | |
| Cloridrato de L-Ornitina, 99% | Alfa Aesar | A12111 | |
| Neomicina e Polimixina B Sulfatos e Dexametasona Pomada Oftalmólica | SANDOZ | NDC 61314-631-36 | antibiótico para prevenir a infecção após injeção intravítrea |
| Solução Oftalmólica de Cloridrato de Fenolfrina (2,5%) | Akorn | NDC 17478-201-15 | para dilatação da pupila |
| Cloreto de Sódio | Sigma | S-5886 | |
| Seringa estéril filtros, 0,2 μ m | VWR | 28143-312 | |
| Bomba de seringa | GRASEBY | MS16A |
Referências
- Allen, T. M., Cullis, P. R. Drug delivery systems: entering the mainstream. Science. 303 (5665), 1818-1822 (2004).
- Tonnesen, H. H., Karlsen, J. Alginate in drug delivery systems. Drug Development and Industrial Pharmacy. 28 (6), 621-630 (2002).
- Vilos, C., Velasquez, L. A. <....
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Reimpressões e permissões
