Tecnologia celular encapsulada para a entrega de biológicos ao olho do rato

Resumo

Apresentado aqui é um protocolo para o uso de alginato como polímero na microencapsulação de células imortalizadas para entrega a longo prazo de biológicos aos olhos de roedores.

Resumo

Muitas terapêuticas atuais em desenvolvimento para doenças do pólo posterior do olho são biológicas. Estes medicamentos precisam ser administrados com freqüência, tipicamente através de injeções intravitreais. As células encapsuladas que expressam o biológico de escolha estão se tornando uma ferramenta para a produção e liberação de proteínas locais (por exemplo, via entrega de medicamentos a longo prazo). Além disso, os sistemas de encapsulamento utilizam materiais permeáveis que permitem a difusão de nutrientes, resíduos e fatores terapêuticos dentro e fora das células. Isso ocorre enquanto mascara as células da resposta imune do hospedeiro, evitando a necessidade de supressão do sistema imunológico hospedeiro. Este protocolo descreve o uso de alginato como um polímero em microencapsulamento juntamente com o método de eletrospray como uma técnica de microencapsulamento. As células ARPE-19, uma linha de células RPE humanas espontaneamente surgidas, tem sido usada em experimentos de terapia celular de longo prazo devido à sua funcionalidade de vida, e é usada aqui para encapsulamento e entrega das cápsulas aos olhos do rato. O manuscrito resume os passos para microencapsulamento celular, controle de qualidade e entrega ocular.

Introdução

As terapias baseadas em células representam técnicas biológicas revolucionárias que têm sido amplamente aplicadas na medicina. Recentemente, eles têm sido aplicados com sucesso no tratamento de doenças neurodegenerativas, doenças oculares e câncer. As terapias celulares abrangem uma ampla gama de campos, desde a substituição celular até a entrega de medicamentos, e este protocolo se concentra neste último. Microcápsulas de alginato biodegradável (MC) têm mostrado eficácia como um sistema de parto, e estão se tornando amplamente utilizadas no campo biomédico. O alginato tem sido utilizado na microencapsulação devido ao seu processo simples de gelagem, biodegradabilidade, excelente biocompatibilidade e estabilidade em condições in vivo^1,2,3,4.

O método de eletrospray, como técnica de microencapsulamento, tem sido utilizado com sucesso para encapsular peptídeos e proteínas usando alginato (polímero base) e poli-l-ornithine (polímero de revestimento secundário). Ambos os polímeros são naturalmente encontrados e utilizados para sua biocompatibilidade^5,6,7. No entanto, o principal desafio nas terapias de base celular é a supressão do sistema imunológico hospedeiro para evitar efeitos colaterais causados por drogas imunossupressoras. A permeabilidade das microcápsulas de alginato é considerada uma propriedade adequada para o encapsulamento celular, que permite a difusão de nutrientes, resíduos e fatores terapêuticos dentro e fora das células enquanto as mascara da resposta imune hospedeira^8,,9,10.

No olho, as células encapsuladas têm sido utilizadas em ensaios clínicos para a entrega constante de biológicos (ou seja, fatores de crescimento^11,12 e antagonistas do fator de crescimento¹³) para o tratamento da retinite pigmentosa ou degeneração macular relacionada à idade. Outros alvos, como inibidores complementares^14, também estão sendo explorados em ambientes pré-clínicos.

Protocolo

Todos os experimentos foram realizados de acordo com a Declaração ARVO para o Uso de Animais em Pesquisa Oftalmológica e de Visão e foram aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais da Universidade Médica da Carolina do Sul sob o protocolo ID 00399.

1. Cultura Celular

1. Gerar células epiteliais de pigmento da retina humana (ARPE-19) expressando o gene de escolha de acordo com os protocolos publicados^14,15.
2. Manter células no Meio Águia Modificada (DMEM) de Dulbecco suplementada com 10% de soro bovino fetal (FBS).
3. Incubar as células a 37 °C e 5% de CO₂.
4. Substitua o meio a cada 2-3 dias.
5. Passe as células depois de atingir 70%-80% de confluência usando procedimentos padrão de cultura tecidual.

2. Encapsulamento celular

1. Misture alginato de sódio com água deionizada (DI) para uma concentração final de 2% w/v e purifique por filtração com um filtro de seringa estéril de 0,2 μm.
2. Prepare as células para serem misturadas com a solução de alginato, tripsinizando, centrifugando e lavando-as com solução salina tamponada hepes de 10 mM (pH = 7,4). Usando um hemocitômetro, conte as células e ajuste a concentração celular final para 1 x 10⁶ em solução alginato.
   NOTA: O processo de encapsulamento deve ser executado dentro de uma coifa esterilizada.
3. Carregue ~300 μL de alíquotas de alginato e mistura de células em uma seringa de 3 mL e conecte-a a uma bomba de seringa. A solução será bombeada através de uma agulha de ponta cega de 30 G para um banho de gelagem estéril colocado em um béquer estéril de 50 mL abaixo da ponta da seringa a 7 mm para uma agulha para banho de distância de pulverização.
4. O banho de gelagem contém um volume de 40 mL de 10 mM HEPES soro retalhado contendo 100 mM de cloreto de cálcio (CaCl₂) e 0,5% w/v poli-L-ornithine (PLO). A OLP é um revestimento de polímero secundário que pode ser omitido ou alterado de acordo com as necessidades do investigador.
5. Ajuste a tensão e a vazão e mantenha-as constantes durante o processo de encapsulamento a 60 mm/h de vazão e 6,0 kV de tensão inicial para produzir microcápsulas do tamanho de ~150 μm.
6. Conecte o clipe do fio de ânodo (vermelho) de uma ponta de agulha geradora de alta tensão à agulha e conecte o clipe de terra (preto) ao fio de cobre que está meio submerso no banho de gelagem. Um lote da mistura alginato + célula (1 mL) leva aproximadamente 30 min para preparar as células encapsuladas (aproximadamente 25.000 microcápsulas).
7. Lave as microcápsulas formadas contendo células com solução de lavagem (10 mM HEPES soro lógico tampão contendo 1,5 mM CaCl₂, pH = 7,4) duas vezes. Não use PBS para lavar.
8. Incubar as células encapsuladas com 10% de FBS suplementada mídia DMEM em uma incubadora umidificada a 37 °C e 5% CO₂.
   NOTA: Os instrumentos do processo de encapsulamento são retratados na Figura 1.

3. Confirmação de que o encapsulamento não afeta a viabilidade celular

1. Depois de incubar as células encapsuladas por 24 h em mídia, prepare uma pequena amostra de 500 μL (~30 microcápsulas) para coloração.
2. Lave as microcápsulas 2x usando a solução de lavagem (10 mM HEPES soro aspirado contendo 1,5 mM CaCl₂) e manche-as para viabilidade viva-morta usando um kit de ensaio vivo/morto.
3. Prepare uma mistura de coloração de calceina AM (acetoxymethyl) e etídio homodimer-1 em concentrações finais de 2 μM e 4 μM, respectivamente.
4. Adicione 2 mL da mistura de coloração às células encapsuladas e incubar por 30-45 min no escuro à temperatura ambiente (RT).
5. Com aspiração cuidadosa, apiratee a solução de coloração e lave as microcápsulas 2x com a solução de lavagem. Use um sistema de microscópio fluorescente para observar e visualizar as células encapsuladas.
   NOTA: A documentação do encapsulamento é retratada na Figura 2.

4. Confirmação de que as cápsulas são o tamanho apropriado para entrega e entrega da Biológica

1. Injeções intravitreais em um olho de rato são tipicamente realizadas com uma agulha de ponta cega de 27 G (diâmetro interno de 210 μm) anexada a uma seringa Hamilton de 2,5 μL.
2. Gerar cápsulas que variam de 100 a 200 μm, diluí-las em meios livres de soro e puxá-las cuidadosamente para dentro da seringa Hamilton. O PBS não é um veículo adequado, pois as cápsulas de alginato se dissolverão na PBS.
3. Ejete lentamente gotas de 1 μL contendo cápsulas em um slide de microscópio e determine sua integridade usando um microscópio de campo brilhante vertical.
4. Ajuste o tamanho da cápsula (ver passo 2.3) ajustando a tensão e a taxa de fluxo de acordo. Microcápsulas menores são produzidas de forma não linear, aumentando a tensão e diminuindo ligeiramente a taxa de fluxo⁸. Em nossas mãos, cápsulas de 150 μm de diâmetro mostraram-se mais adequadas. O ajuste do tamanho da cápsula também depende de manter a concentração de alginato constante enquanto altera os outros parâmetros.
5. Mantenha um conjunto separado de células em cápsulas do tamanho apropriado em meio livre de soro para determinar a quantidade de secreção do biológico desejado. Use ELISAs sensíveis ou manchas ocidentais para determinar a concentração dos biológicos no sobrenadante.
6. Determine a quantidade necessária de cápsulas que precisam ser injetadas com base no PK/PD conhecido (farmacocinética/farmacodinâmica) do terapêutico. Em nossas mãos, 10 cápsulas por olho de rato provaram ser mais eficazes.

5. Entrega de cápsulas em Mouse Vitreous

1. Realize injeções intravitreais usando um microscópio dissecando. Consulte a Figura 3 para a configuração cirúrgica e os materiais utilizados durante o procedimento. Um protocolo detalhado para injeções intravitreous pode ser encontrado em outro lugar¹⁶.
2. Anestesia camundongos por injeção intraperitoneal de xilazina e cetamina (20 mg/kg e 80 mg/kg) ou outros anestésicos preferidos aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso animal da instituição específica. Certifique-se de profundidade adequada da anestesia usando uma pitada de dedo do dedo¹⁷.
3. Dilado as pupilas do camundongo com HCL de fenilefrina (2,5%) e sulfato de atropina (1%) para permitir uma boa visibilidade da câmara vítrea e aplicar um gel de olho lubrificante aos olhos para mantê-los hidratados durante o procedimento.
4. Perfure o esclera no membro com uma agulha de 26 G como orifício guia, certificando-se de que 1) a agulha está em um ângulo de 45° com o olho e tabela e 2) a ponta chanfrada é apontada para cima para evitar perfurar a lente.
5. Injete cuidadosamente as cápsulas usando uma agulha de ponta cega de 27 G presa a uma seringa Hamilton em um ângulo de 45° inspeção visual, certificando-se de evitar tocar a lente com a agulha. A lesão da lente levará à formação de catarata. As cápsulas devem ser visíveis no vítreo usando o microscópio dissecando(Figura 4A).
6. Após a retração da agulha, trate o local da injeção com pomadas antibióticas neomicina e sulfato de polimicina B, além de pomada antiptológica oftalmológica de xamametasona.
7. Aplicar solução oftálmica demulcentes goniotaire hypromellose (2,5%) para ambos os olhos para evitar que as córneas sequem durante o período de recuperação.
8. Coloque o mouse em uma almofada de aquecimento mantida a 37°C e monitore até acordar completamente.
9. Uma injeção bem sucedida de células ARPE-19 encapsuladas deve revelar a presença de cápsulas intactas na câmara vítrea do camundongo com apenas pequenas quantidades de detritos ao fazer a imagem do olho por tomografia de coerência óptica ou outros métodos(Figura 4B).
10. O olho do rato injetado, após alguns dias de recuperação devido à cirurgia, agora está pronto para o paradigma experimental em mãos.
    NOTA: A configuração cirúrgica e a documentação das cápsulas no olho são retratadas na Figura 3 e Figura 4,respectivamente.

Resultados

As células ARPE-19 são uma linha celular rpe humana espontaneamente imortalizada que tem se mostrado passível de encapsulamento e sobrevivência a longo prazo após a implantação de cápsulas no olho. As ferramentas para encapsulamento de alginato são mostradas na Figura 1. Neste estudo, foi demonstrado que após o encapsulamento em alginato, as células em cápsulas de alginato foram confirmadas por imagem de campo brilhante(Figura 2A). Ensaios de mortos vivos foram ...

Discussão

Esta técnica de encapsulamento celular é relativamente rápida e fácil de executar; no entanto, alguns pontos devem ser mantidos em mente para obter resultados precisos a jusante. As células devem ser mantidas na cultura em uma placa de Petri antes do encapsulamento e mantidas em confluência adequada. O encapsulamento deve ser realizado em uma capa de ventilação adequada com fluxo de ar regulado, se possível. Uma corrente de ar muito forte pode afetar a formação de cápsulas, especialmente em experimentos de longo prazo. U...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Seringa de 3 mL	BD	309656
30 G 1" Agulha romba	SAI Tecnologia de infusão	B30-100
Sal de sódio de ácido algínico, de algas marrons	Sigma	A0682
Sulfato de atropina Solução oftalmólica (1%)	Akorn	NDC 17478-215-15	para dilatação da pupila
BD 1 mL Seringa 26 G x 3/8 (0,45 mm x 10 mm)	Becton, Dickinson e Empresa	DG518105 500029609 REF 309625	para gerar o orifício guia
Cloreto de cálcio, anidro, granular	Sigma	C1016
GenTeal Tears	Alcon	NDC 0078-0429-47	para lubrificar os olhos durante a anestesia
Goniotaire: Hipromelose (2,5%) Solução Oftalmólica Demoliente (Estéril)	Altaire Pharmaceuticals Inc.	NDC 59390-182-13	para lubrificar os olhos durante a anestesia
Hamilton Ponta da agulha/seringa: 27 G, Small Hub RN NDL, comprimento do cliente (12 mm), estilo de ponta 3, 6/PK	Hamilton	7803-01	para administração intravítrea de cápsulas
Seringa Hamilton: 2,5 µ L, Modelo 62 RN SYR, NDL Vendido separadamente	Hamilton	7632-01	para entrega intravítrea de cápsulas
Tampão HEPES, 1 M	Bioreagentes Fisher	BP299100
Gerador de alta tensão	ESD EMC Technology	ES813-D20
LIVE/DEAD Kit de Viabilidade/Citotoxicidade	Thermofisher Scientific	L3224
Cloridrato de L-Ornitina, 99%	Alfa Aesar	A12111
Neomicina e Polimixina B Sulfatos e Dexametasona Pomada Oftalmólica	SANDOZ	NDC 61314-631-36	antibiótico para prevenir a infecção após injeção intravítrea
Solução Oftalmólica de Cloridrato de Fenolfrina (2,5%)	Akorn	NDC 17478-201-15	para dilatação da pupila
Cloreto de Sódio	Sigma	S-5886
Seringa estéril filtros, 0,2 μ m	VWR	28143-312
Bomba de seringa	GRASEBY	MS16A