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Artigo de método

Monitoração in situ de montagens moleculars formadas Transientemente do chaperone nas bactérias, no fermento, e nas pilhas humanas

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DOI:

10.3791/60172

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2 de setembro de 2019

 ,  , 
1Department of Biomedical Sciences of Cells & Systems, University of Groningen, 2Department of Anatomy, Faculty of Medicine, University of Colombo, 3Australian Regenerative Medicine Institute (ARMI), Monash University

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

As proteínas do domínio J de cognato cooperam com a Chaperona HSP70 para auxiliar em uma infinidade de processos biológicos que vão desde a dobradura de proteínas até a degradação. Aqui, nós descrevemos um ensaio in situ da ligadura da proximidade, que permita a monitoração destas machineries transientemente formadas do acompanhante em bactérias, em fermento e em pilhas humanas.

Resumo

As proteínas do J-domínio (jdps) formam a família a maior e a mais diversa do co-Chaperone em pilhas eucarióticas. Os resultados recentes mostram que os membros específicos da família de JDP poderiam dar forma a heterocomplexos transientes nos eucariotas para ajustar a seleção da carcaça para a proteína de choque do calor de 70 kDa (HSP70)-base Chaperone-baseada disaggregases. Os complexos de JDP visam o estresse agudo/crônico induzido por proteínas agregadas e, presumivelmente, ajudam a montar os disaggregases recrutando múltiplos Hsp70s para a superfície de agregados proteicos. A extensão da rede de controle de qualidade proteica (PQC) formada por esses JDPs fisicamente interagindo permanece em grande parte não caracterizada in vivo. Aqui, nós descrevemos um ensaio in situ microscopia-baseado da interação da proteína nomeado o ensaio da ligadura da proximidade (PLA), que é capaz de capturar robustamente estes complexos transientemente formados do acompanhante em compartimentos celulares distintos de pilhas eucarióticas. Nosso trabalho amplia o emprego de PLA de células humanas a leveduras (Saccharomyces cerevisiae) e bactérias (Escherichia coli), tornando assim uma importante ferramenta para monitorar a dinâmica de conjuntos proteicos transientemente formados em ambos os células procarióticas e eucarióticas.

Introdução

Uma quantidade vasta de informação genomic permanece indefinidos devido a nossa compreensão incompleta de interactomes celulares. As metodologias convencionais de detecção de interação proteína-proteína, como a co-imunoprecipitação protéica com/sem ligação cruzada química e colocalização protéica, embora amplamente utilizadas, apresentam uma série de desvantagens. Algumas das principais desvantagens incluem a má quantificação das interações e a potencial introdução de eventos vinculativos não nativos. Em comparação, as técnicas emergentes de proximidade fornecem uma alternativa e uma abordagem poderosa para capturar interações protéicas nas células. O ensaio de ligadura de proximidade (PLA)1, agora disponível como um kit proprietário, emprega anticorpos especificamente destinados a complexos proteicos com base na proximidade das subunidades interagindo.

O PLA é iniciado pela formação de um andaime constituído por anticorpos primários e secundários com pequenas Tags de DNA (sondas PLA) na superfície do complexo proteico alvo (Figura 1, etapas 1-3). Em seguida, determinada pela proximidade das tags de DNA, uma molécula de DNA circular é gerada através da hibridação com oligonucleotídeos do conector (Figura 1, etapa 4). A formação do ADN circular é terminada por uma etapa da ligadura do ADN. A parte circular recentemente formada de ADN sere como um molde para a amplificação subseqüente do círculo do rolamento (RCA)-baseou a reacção em cadeia do polymerase (PCR) aprontado por um dos Tag conjugado do oligonucleotide. Isto gera uma molécula de DNA concatemeric única-encalhado unida ao complexo da proteína através do andaime do anticorpo (Figura 1, etapa 6). A molécula concatemeric do ADN é visualizada usando os oligonucleotídeos cDNAs etiquetados que hibridizam às seqüências originais múltiplas dispersadas através do ADN amplificado (Figura 1, etapa 7)2. O sinal do PLA gerado, que aparece como um ponto fluorescente (Figura 1, etapa 7), corresponde à posição do complexo alvejado da proteína na pilha. Como resultado, o ensaio poderia detectar complexos proteicos com alta precisão espacial. A técnica não se limita a simplesmente captar interações proteicas, mas também pode ser utilizada para detectar moléculas únicas ou modificações protéicas em proteínas com alta sensibilidade1,2.

HSP70 forma um sistema de acompanhante altamente versátil fundamentalmente importante para manter a homeostase de proteínas celulares, participando de uma série de tarefas domésticas e funções associadas ao stress. As atividades de limpeza do sistema de acompanhante HSP70 incluem dobradura de proteína de novo, translocação de proteínas através de membranas celulares, montagem e desmontagem de complexos proteicos, regulação da atividade proteica e vinculação de diferentes proteínas dobráveis/ controle de qualidade machineries3. O mesmo sistema de acompanhante igualmente redobra proteínas desdobradas/unfolded, impede a agregação da proteína, promove a desagregação da proteína e coopera com proteases celulares para degradar as proteínas terminalmente misfolded/danificadas para facilitar o reparo celular após tensões proteotóxicas4,5. Para alcançar essa diversidade funcional, a Chaperona HSP70 confia em parcerias de cochaperonas da família JDP e fatores de troca de nucleotídeo (NEFs) que afinar o controle alostérico dependente de Hsp70's ATP de ligação de substrato e liberação3, a 6. Além disso, os cochaperones JDP desempenham um papel vital na seleção de substratos para este sistema de acompanhante versátil. Os membros desta família são subdivididos em três classes (A, B e C) com base em sua homologia estrutural para o protótipo JDP, o E. coli DnaJ. Os jdps da classe A contêm um N-terminal J-Domain, que interage com o HSP70, uma região rica da glicina-fenilalanina, uma região obrigatória da carcaça que consiste em um zinco dedo-como a região (zflr) e dois domínios do β-tambor, e um domínio do dimerização do C-terminal. JDPs com um N-terminal J-domínio e um glicina-fenilalanina rica região, mas faltando o ZFLR, cair na classe B. Em geral, os membros dessas duas classes estão envolvidos em funções de chaperoning. Membros que caem a classe C do catchall, que contem os JDPs que compartilham somente do J-domínio4, recruta Hsp70s para executar uma variedade de funções não-chaperoning. O importante papel dos JDPs como "adaptadores" de reconhecimento de substrato intercambiáveis do sistema HSP70 é refletido por uma expansão dos membros da família durante a evolução. Por exemplo, os seres humanos têm sobre 42 Membros distintos4de JDP. Estes jdps funcionam como monómeros, homodimers e/ou oligômeros homo/hetero4,5. Recentemente, uma cooperação funcional através da formação complexa transiente entre A classe A (por exemplo, H. sapiens DNAJA2; S. cerevisiae Ydj1) e classe B (p. ex., H. sapiens DNAJB1; S. cerevisiae Sis1) o jdps eucarióticas foi relatado para promover o reconhecimento eficiente de agregados amorfos da proteína in vitro7,8. Estes complexos da classe misturada JDP presumivelmente montam na superfície de proteínas agregadas para facilitar a formação de HSP70-e HSP70 + Hsp100-based disaggregases da proteína7,8,9, 10. a evidência crítica para apoiar a existência destes complexos de classe mista de JDP em células eucarióticas foi formada transientemente com o PLA8.

O PLA é empregado cada vez mais para avaliar interações da proteína no Metazoa, primeiramente em pilhas mamíferos. Aqui, nós relatamos a expansão bem sucedida desta técnica para monitorar os complexos transientemente formados do acompanhante em organismos unicelulares eucarióticas e procarióticas tais como o fermento de brotamento S. cerevisiae e a bactéria e . coli. Importante, esta expansão destaca o uso potencial do PLA em detectar e em analisar os micróbios que infectam pilhas humanas e animais.

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Protocolo

1. HeLa preparação celular

  1. Prepare os seguintes materiais: PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM na2HPO4, 1,8 mm KH2po4), pH 7,4; DMEM, suplementado com 10% FCS e 1% Pen-Strep; paraformaldeído a 4% em PBS; 0,5% Triton-X100 em PBS; TBS-T (150 mM NaCl, 20 mM Tris, 0, 5% Tween), pH 7,4; 0, 1% solução estéril de poli-L-lisina; lâminas diagnósticas de 10 poços; uma câmara húmida; papel tissue; e frascos de coloração da corrediça de Coplin.
    Nota: Para assegurar a eficiência óptima da fixação, as soluções do paraformaldeído devem ser preparadas frescas antes de cada experimento.
  2. Prepare uma câmara húmida cobrindo a parte inferior de uma caixa fechada com tecidos molhados. Coloque a câmara húmida a 37 ° c antes de iniciar o experimento, para garantir que a temperatura da câmara esteja a 37 ° c, enquanto incubando as reações enzimáticas.
  3. Células HeLa de cultura em frascos T25, em 5 mL de DMEM (alta glicose, glutamato e piruvato de sódio suplementados) suplementados com 10% FCS e 1% Pen-strep, em uma incubadora de 37 ° c CO2 contendo 5% de co2. Dissociar as células aderentes usando 0, 5% tripsina-EDTA. Depois que a adição de DMEM fresco às pilhas dissociada, contem pilhas usando uma câmara de contagem da pilha e cresce em corrediças diagnósticas dentro de uma câmara húmida.
  4. Esterilizar as lâminas diagnósticas por irradiação UV em uma capa de cultura celular estéril por 30 min.
  5. Adicionar 100 μL de estéril filtrado 0, 1% poli-L-lisina a cada poço necessário para o experimento. Incubar por 30 min. Lave o excesso de poli-L-lisina, lavando cada poço 3x com 50 μL de água ultrapura.
  6. Trypsinize as pilhas de HeLa e adicione aproximadamente 15.000 pilhas a cada poço. Se necessário, diluir as células para, pelo menos, 30-50 μL de DMEM por poço.
  7. Cresça pilhas em uma câmara húmida dentro de uma incubadora de 37 ° c 5% CO2 para aproximadamente 24 h. as pilhas devem ser 60%-80% confluentes antes de começar o PLA.
    Nota: Uma confluência muito alta diminui a absorção dos reagentes, diminuindo o sinal obtido no final do protocolo.
  8. Remova o meio colocando um papel de tecido na borda do poço. Lave os poços 3x com 50 μL de PBS.
    Nota: As células estão sujeitas a desanexação quando líquidos são adicionados duramente. Isto pode ser impedido não deixando os poços secar completamente antes de adicionar o líquido novo e adicionando o líquido novo delicadamente à borda do poço.
  9. Fixe pilhas adicionando 50 μL de paraformaldeído recentemente preparado de 4% em PBS a cada poço. Incubar por 10 min à temperatura ambiente.
  10. Lave as lâminas 3x em PBS. Realize lavas em um frasco de coloração de slide Coplin contendo 100 mL de PBS. Para cada lavagem, incubar durante 5 min à temperatura ambiente sem agitação.
  11. Permeabilize a membrana celular submergindo as lâminas em 100 mL de 0,5% Triton-X100 em PBS em um frasco de coloração de slide Coplin. Incubar durante 10 min à temperatura ambiente sem agitação.
  12. Lave os slides 3x em TBS-T. Realize lavas em um frasco de coloração de slides Coplin contendo 100 mL de TBS-T. Para cada lavagem, incubar durante 5 min à temperatura ambiente sem agitação.
  13. Após a última lavagem, remova o excesso de tampão com um papel tissue. Neste ponto, as células estão prontas para o protocolo de ensaio de ligadura de proximidade que será discutido na seção 4.

Preparação da pilha 2. S. cerevisiae

  1. Prepare os seguintes materiais: 100 mM KPO4, pH 6,5, referido como tampão de lavagem; 37% formaldeído; 4% paraformaldeído em 100 mM KPO4, pH 6,5; 1,2 M sorbitol em 100 mM KPO4, pH 6,5; solução de liticase (500 μg/mL de liticase, 20 mM β-Mercaptoetanol, 100 mM KPO4, pH 6,5); 0, 1% solução de poli-L-lisina; 1% Triton-X100 em 100 mM KPO4, pH 6,5; lâminas diagnósticas de 10 poços; uma câmara húmida (preparada como no passo 1,2); papel tissue; e frascos de coloração da corrediça de Coplin.
    Nota: Para assegurar a eficiência óptima da fixação, as soluções do paraformaldeído devem ser preparadas frescas antes de cada experimento.
  2. Cresça uma cultura overnight no meio de extrato de levedura não seletivo, peptona e dextrose (YPD) a 30 ° c durante a agitação.
    Nota: Dependendo das exigências experimentais as células S. cerevisiae podem ser cultivadas em meio sintético (SC) médio ou seletivo sintético mínimo (SM) em vez disso.
  3. Diluir a cultura estacionária para um OD600 de 0,1 em 20 ml médio. Cresça as pilhas em 30 ° c ao agitar até que o OD600 alcangue 0,5.
  4. Transfira a cultura de 20 mL para um tubo de centrifugação de 50 mL. Pellet as células por centrifugação em 665 x g por 3 min. Retire o sobrenadante. Ressuscitem as células em 5 mL de meio fresco.
  5. Fixe as células adicionando 550 μL de 37% de formaldeído à cultura. Incubar à temperatura ambiente durante 15 min.
  6. Pellet as células por centrifugação em 665 x g por 3 min. Retire o sobrenadante. Resuspend o pellet em 1 mL de recém preparado 4% paraformaldeído em tampão de lavagem. Incubar por 45 min à temperatura ambiente.
  7. Durante a incubação, prepare as lâminas diagnósticas adicionando 100 μL de 0, 1% de solução de poli-L-lisina a cada poço. Incubar as lâminas durante 30 min à temperatura ambiente.
  8. Após 30 min, lave o excesso de poli-L-lisina com água ultrapura e deixe o ar das lâminas secar. As lâminas secas estão prontas para uso.
  9. Lave as células duas vezes com 1 mL de tampão de lavagem. Realize lavagens por centrifugação das células a 665 x g durante 3 min. Retire o sobrenadante e ressuscitem as células no tampão de lavagem.
  10. Pellet as células por centrifugação em 665 x g por 3 min. Retire o sobrenadante. Ressuscitou as células em 1 mL de 1,2 M de sorbitol em tampão de lavagem.
  11. Pellet as células por centrifugação em 665 x g por 3 min. Retire o sobrenadante. Ressuscitem o pellet em 250 μL de solução de Liticase preparada na hora para digerir a parede celular. Incubar as células na solução de Liticase durante 15 min a 30 ° c durante a agitação.
  12. Após a digestão, lave as células 3x por centrifugação a 665 x g durante 3 min e retire o sobrenadante. Ressuscitou as células em 250 μL de 1,2 M de sorbitol em tampão de lavagem.
    Nota: Porque as células são frágeis após a digestão da parede celular, ressuscitem-los com muito cuidado para não danificar as células.
  13. Adicionar 20 μL de células ressopadas às lâminas revestidas de poli-L-lisina. Permita que eles se anexem aos slides por 30 min. Lave as células não aderentes lavando os poços 3x com 50 μL de tampão de lavagem.
  14. Permeabilize a membrana celular por lavagem 3x com 50 μL de 1% Triton-X em tampão de lavagem.
    Nota: Neste ponto as pilhas estão prontas para o protocolo do ensaio da ligadura da proximidade que será discutido na seção 4.

Preparação da pilha 3. E. coli

  1. Prepare os seguintes materiais: PBS-T (140 mM NaCl, 2 mM KCl, 8 mM K2HPO4, 1,5 mm KH2po4, 0, 5% Tween-20), pH 7,4; solução de lisozima (2 mg/mL de lisozima, 25 mM de Tris-HCl pH 8,0, 50 mM de glicose, 10 mM de EDTA); 0, 1% solução de poli-L-lisina; 99% metanol gelo-frio; 99% temperatura ambiente metanol; 99% acetona; lâminas diagnósticas de 10 poços; uma câmara húmida (preparada como no passo 1.1.1); papel tissue; e frascos de coloração da corrediça de Coplin.
  2. Cresça uma cultura durante a noite no meio de Luria-Bertani (libra) em 30 ° c ao agitar.
  3. Diluir a cultura estacionária a um OD600 de 0, 2 no meio fresco da libra. Cresça as pilhas em 30 ° c ao agitar até que o OD600 alcangue 0,4 para pilhas da fase do registro.
  4. Aproximadamente 15 minutos antes que as pilhas alcancem um OD600 de 0,4, prepare as corrediças revestidas poli-l-lysine adicionando 100 μL de 0, 1% poli-l-lisina a cada poço. Incubar as lâminas durante 30 min à temperatura ambiente.
  5. Após 30 min lave o excesso de poli-L-lisina com água ultrapura e deixe deslizar o ar seco. As lâminas secas estão prontas para uso.
  6. Quando as pilhas alcangam um OD600 de 0,4, transfira 1 ml da cultura a um tubo estéril do microcentrifugador e às pilhas da pelota em 2.650 x g por 2 minutos.
  7. Reressuscitem as células em 50 μL de meio LB.
  8. Fixar as células adicionando 1 mL de gelo-frio 99% metanol. Misture muito suavemente com a mão. Incubar células por 30 min a-20 ° c.
  9. Após a fixação, adicione 20 μL das células às lâminas revestidas com poli-L-lisina. Deixe as lâminas secar ao ar por 30 min.
  10. Adicionar 50 μL de solução de lisozima preparada na hora para cada poço para digerir a parede celular. Incubar em câmara húmida durante 30 min a 25 ° c.
  11. Remova a solução da lisozima dos poços adicionando um papel de tecido à borda do poço. Lave as lâminas 3x em 100 mL de PBS-T. Realize cada lavagem em um frasco de coloração de slides Coplin por 30 s, sem tremer.
  12. Retire o tampão de lavagem das lâminas tocando nos slides em um papel tissue.
  13. Permeabilize as membranas celulares adicionando 50 μL de metanol de 99% a cada poço. Incubar durante 1 min à temperatura ambiente.
  14. Remova o metanol colocando um papel de tecido na borda do poço.
  15. Adicionar 50 μL de 99% de acetona a cada poço. Incubar por 1 min.
  16. Retire o excesso de acetona, colocando um papel de tecido para a borda do poço. Permitir que os slides para secar ao ar. Neste ponto as pilhas estão prontas para o protocolo do ensaio da ligadura da proximidade que será discutido na seção 4.

4. ensaio de ligadura de proximidade

  1. Prepare os seguintes materiais: bloqueio de buffer; Tampão de diluição de anticorpos; Tampão de lavagem ' A ' – (10 mM Tris, 150 mM NaCl, 0, 5% Tween-20) pH 7,4; Tampão de lavagem ' B ' – (200 mM Tris, 100 mM NaCl) pH 7,4; Anticorpo secundário anti-coelho PLUS; Anti-mouse anticorpo secundário MINUS; 5x tampão de ligadura; Ligase 5x tampão de amplificação (laranja: λex 554 nm; λem 576 nm); polimerase água ultrapura; e meio de montagem contendo DAPI.
    Nota: os reagentes de detecção de PLA também estão disponíveis nas variantes verde (λ ex 495 nm;λ em 527 nm), vermelho (λex 594 nm; λem 624 nm), farred (λex 644 nm; λem 669 nm) ou brightfield (horseradish peroxidase (HRP) conjugados).
  2. Bloqueie as células adicionando uma gota de buffer de bloqueio a cada poço. Incubar durante 30 min a 37 ° c numa câmara húmida.
  3. Prepare soluções do anticorpo diluindo anticorpos do estoque no amortecedor da diluição do anticorpo. Para cada poço 40 μL de solução de anticorpos é necessária.
  4. Remova o tampão de obstrução coloc um papel de tecido na borda do poço. Adicionar 40 μL de anticorpo diluído em tampão de diluição de anticorpos a cada poço. Incubar por 60 min numa câmara húmida a 37 ° c ou durante a noite a 4 ° c.
  5. Remova a solução do anticorpo dos poços coloc um papel de tecido na borda do poço. Lave as lâminas 2x em 100 mL de tampão de lavagem ' A ' em um frasco de coloração de slides Coplin por 5 min, sem agitação.
  6. Durante as etapas da lavagem, diluir pontas de prova secundárias do anticorpo 5x, anti-coelho mais & anti-rato menos (a especificidade das espécies das pontas de prova depende dos anticorpos preliminares usados), no amortecedor da diluição do anticorpo. Prepare 40 μL de solução de anticorpos por poço.
  7. Adicionar 40 μL de solução de anticorpos secundários a cada poço. Incubar por 60 min a 37 ° c em câmara húmida.
  8. Remova a solução secundária do anticorpo dos poços coloc um papel de tecido na borda do poço. Lave as lâminas 2x em 100 mL de tampão de lavagem ' A ' em um frasco de coloração de slides Coplin por 5 min, sem agitação.
  9. Durante as lavagens Prepare 40 μL de mistura de ligadura por poço, misturando 8 μL de tampão de ligadura 5x, 31 μL de água ultrapura e 1 μL de ligase.
  10. Adicionar 40 μL de mistura de ligadura a cada poço. Incubar durante 30 min a 37 ° c numa câmara húmida.
  11. Remover a mistura de ligadura dos poços, colocando um papel de tecido na borda do poço. Lave as lâminas 2x em 100 mL de tampão de lavagem ' A ' em um frasco de coloração de slides Coplin por 2 min, sem agitação.
  12. Durante as lavagens Prepare 40 μL de mistura de amplificação por poço, misturando 8 μL de solução de amplificação de 5x, 31,5 μL de água ultrapura e 0,5 μL de polimerase.
    Nota: A amplificação de 5x contém sondas fluorescentes. Proteja esta mistura da luz. Além disso, proteja os slides da luz durante cada uma das etapas a seguir. Se usar frascos translúcidos da corrediça-mancha de Coplin e câmaras húmidas, envolva-os na folha de alumínio.
  13. Adicionar 40 μL de mistura de amplificação por poço. Incubar por 100 min a 37 ° c em câmara húmida.
  14. Remover a mistura de amplificação dos poços. Lave as lâminas 2x em 100 mL de tampão de lavagem ' B ' em um frasco de coloração de slides Coplin por 10 min sem tremer.
  15. Lave as lâminas em 100 mL de tampão de lavagem ' B ' diluído 1:100 em água ultrapura em um frasco de coloração de corrediça Coplin por 30 s.
  16. Adicione 20 μL de DAPI contendo meio de montagem por poço aos slides. Feche os slides com uma lamínula e lâminas de vedação com esmalte.
  17. Se a imagem latente, imediatamente Incubar o DAPI que contem o meio de montagem por 10 – 15 minutos, quando protegido da luz. Se não, armazene os slides a-20 ° c por até 1 semana, protegidos da luz.

5. detecção de

  1. Use a microscopia confocal para adquirir imagens de HeLa, S. cerevisiae e células de e. coli com 20x/0.8 na, 63x/1.4 na e objetivos do apochromat da planta de 100x/1.4 na, respectivamente. Excite DNA-manchado DAPI com um 405 nm pulsado laser de diodo. Para o sinal PLA (para este estudo) excitar com um laser de estado sólido de 561 nm.

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Resultados

Nossos estudos in vitro prévios usando proteínas purificadas revelaram que um subconjunto de classe humana A e de classe B JDPs formam complexos transientes de classe mista JDP para direcionar eficientemente uma ampla gama de proteínas agregadas e possivelmente facilitar a montagem de HSP70-based disaggregases proteicos7. Nós empregamos o PLA para determinar se os complexos da classe misturada (A + B) JDP ocorrem em pilhas de cancro cervicais humanas (HeLa). Os JDPs humanos DNAJA2 (classe A) e DNA...

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Discussão

As abordagens baseadas em coimunoprecipitação e colocalização têm sido utilizadas como métodos de longa data para caracterizar as montagens de proteínas. A detecção de complexos de Chaperona em forma transitória é um grande desafio com tais métodos convencionais e, como resultado, os achados anteriores são largamente restritos a interpretações qualitativas. As técnicas de coimunoprecipitação à base de lise celular geralmente exigem cross-linking para estabilizar interações proteína-proteína. A lise celular aumenta o risc...

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Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

NBN é apoiado por um subsídio especial de recrutamento da faculdade de medicina da Universidade de Monash de enfermagem e Ciências da saúde com financiamento do governo estadual de Victoria e do governo australiano. Agradecemos a Bernd Bukau (ZMBH, Universidade de Heidelberg, Alemanha) e a Harm H. Kampinga (departamento de Ciências Biomédicas de células & sistemas, Universidade de Groningen, Países Baixos) pelo seu inestimável apoio e partilha de reagentes, Holger Lorenz (ZMBH Imaging Facility, Heidelberg University, Alemanha) por seu apoio com microscopia confocal e processamento de imagens, e Claire Hirst (ARMI, Monash University, Austrália) para leitura crítica do manuscrito.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
37% FormaldeídoMerck103999
AcetonaSigma-Aldrich32201
anticorpo anti-DNAJA2Abcamab157216
anticorpo anti-DNAJB1Enzo Life SciencesADI-SPA-450
anticorpo anti-DnaKem casa
anticorpo anti-mCherryAbcamab125096
anticorpo anti-Sis1Cosmo Bio CorpCOP-080051
anticorpo anti-Ydj1EstresseMarq Biosciences  SMC-150,
anticorpo anti-YFPFrasco
interno de coloração de lâmina CoplinSigma-AldrichS5516
Lâminas de diagnósticoMarienfeld1216530
DMEMThermo-Fischer31966021
DuoLink Reagentes de detecção in situ OrangeSigma-AldrichDUO92007
DuoLink In Meio de montagem Situ + DAPISigma-AldrichDUO82040
Sonda PLA In Situ DuoLink Anti-Mouse MINUSSigma-AldrichDUO92004
Sonda PLA In Situ DuoLink Anti-Rabbit PLUSSigma-AldrichDUO92002
DuoLink Tampões de lavagem in situ, FluorescênciaSigma-AldrichDUO82049
Soro de bezerro fetalThermo-Fischer10082147
LisozimaSigma-Aldrich62971
MetanolSigma-Aldrich32213
ParaformaldeídoSigma-AldrichP6148
Penicilina / EstreptomicinaThermo-Fischer15070063
Poli-L-LisinaSigma-AldrichP47-07
SorbitolSigma-AldrichS7547
Triton-X100Merck108643
TripsinaThermo-Fischer25300096
Tween-20Sigma-AldrichP1379
Zymolase 100T / / LyticaseEstados Unidos BiológicoZ1004

Referências

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