Monitoração in situ de montagens moleculars formadas Transientemente do chaperone nas bactérias, no fermento, e nas pilhas humanas

As proteínas do domínio J de cognato cooperam com a Chaperona HSP70 para auxiliar em uma infinidade de processos biológicos que vão desde a dobradura de proteínas até a degradação. Aqui, nós descrevemos um ensaio in situ da ligadura da proximidade, que permita a monitoração destas machineries transientemente formadas do acompanhante em bactérias, em fermento e em pilhas humanas.

Este método captura interações proteicas transitórias em organismos como bactérias e leveduras e em diferentes tipos de células. Aqui monitoramos transitoriamente complexos de acompanhantes específicos que estão envolvidos na proteostase celular. A principal vantagem dessa técnica é a capacidade de gerar informações sobre dinâmica e localização subcelular de conjuntos proteicos em células procarióticas e eucarióticas.

Adaptações dessa técnica em organismos unicelulares, como bactérias e leveduras, permitem aos pesquisadores usá-la como uma poderosa ferramenta para investigar doenças relacionadas a infecções microbianas. Essa técnica poderia potencialmente ser empregada para analisar interações proteicas em quase todos os organismos, simplesmente alterando as condições na fase de preparação da amostra do protocolo. É importante selecionar anticorpos de boa qualidade que sejam específicos e testados em imunohistoquímica, imunofluorescência, ELISA ou imunoprecipitações.

Comece por pré-tratamento de slides diagnósticos de 10 poços com poli-L-Lysine. Adicione 100 microliters de estéril e filtrado 0,0001% poli-L-Lysine a cada poço, e incubar os slides por 30 minutos em uma capa de fluxo laminar estéril. Em seguida, lave cada poço com 50 microliters de água estéril para remover o excesso de poli-L-Lysine.

Adicione aproximadamente 15.000 células por poço, dependendo do tipo celular, e cresça as células em uma incubadora úmida estéril a 37 graus Celsius com dióxido de carbono de 5% a uma confluência de 60 a 80%. Após 24 horas, remova o meio de crescimento colocando um papel de tecido na borda de cada poço, e lave as células três vezes com 50 microliters de PBS. Em seguida, fixar as células adicionando 50 microliters de 4% de paraformaldeído recém-preparado em PBS a cada poço e incubando o slide em temperatura ambiente por 10 minutos.

Após a fixação, lave o slide três vezes submergindo o slide em um frasco de coloração de slides com PBS. Para permeabilizar as membranas das células anexadas, submergir o slide em 100 mililitros de 0,5% Triton-X100 em PBS, e incubar as células por 10 minutos à temperatura ambiente. Em seguida, lave os slides três vezes em TBS-T.

Após a última lavagem, remova o excesso de tampão com um papel de tecido. Cresça e dilua as células S.cerevisiae de acordo com as instruções do manuscrito, em seguida, transfira-as para um tubo de centrífuga de 50 mililitros e pelotas por centrifugação a 665 vezes g por três minutos. Remova o supernatante e resuspenda as células em cinco mililitros de meio fresco.

Em seguida, adicione 550 microliters de 37% de formaldeído para uma concentração final de 4% e incubar a cultura à temperatura ambiente por 15 minutos para corrigir as células. Após a incubação, pelota as células, remova o supernasce e resuspenque a pelota em um mililitro de paraformaldeído recém-preparado em tampão de lavagem. Incubar as células em temperatura ambiente por 45 minutos.

Enquanto isso, prepare os slides diagnósticos adicionando 100 microlitadores de 0,0001% de solução poli-L-Lysine a cada poço e incubando os slides por 30 minutos à temperatura ambiente. Em seguida, lave o excesso de poli-L-Lysine com água ultrapura e deixe os slides secarem. Após a etapa de incubação, lave as células duas vezes com um mililitro de tampão de lavagem por centrifugação.

Remova o supernatante e resuspenja as células no tampão de lavagem. Pelotar as células após a última lavagem, e remover o supernascimento e resuspend as células em um mililitro de tampão de lavagem contendo 1,2 molar sorbitol. Para digerir a parede celular, pelotar as células novamente e resuspensar as células em 250 microliters de solução lyticase recém-preparada.

Incubar as células a 30 graus Celsius por 15 minutos com agitação suave. Após a etapa de digestão, lave as células três vezes em tampão de lavagem e resuspenja as células em 250 microliters de tampão de lavagem contendo 1,2 molar sorbitol. Adicione 20 microlitadores de células re-suspensas a cada poço revestido de poli-L-Lysine, e permita que as células fixas e permeabilizadas se conectem por 30 minutos.

Lave os poços três vezes com 50 microliters de tampão de lavagem para remover células não aderentes e proceda com o ensaio de ligadura de proximidade. Inicie o ensaio de ligadura de proximidade, ou protocolo PLA, adicionando uma gota do buffer de bloqueio a cada poço e incubar o slide em uma câmara úmida por 30 minutos a 37 graus Celsius. Remova o tampão de bloqueio colocando um papel de tecido na borda de cada poço, e lave as células duas vezes em 100 mililitros de tampão de lavagem A.Em seguida, adicione 40 microliters da solução de anticorpos primários a cada poço e incubar o slide por 60 minutos a 37 graus Celsius em uma câmara úmida.

Remova a solução de anticorpos primários e lave as lâminas duas vezes no tampão de lavagem A.Após a lavagem, adicione 40 microliters da solução de anticorpos secundários a cada poço e incubar o slide por 60 minutos a 37 graus Celsius em uma câmara úmida. Em seguida, remova a solução e lave as lâminas duas vezes no tampão de lavagem A.Em seguida, adicione 40 microliters da mistura de ligadura de DNA que contém o conector oligonucleotídeos e ligaduras de DNA, para cada poço, e incubar o slide na câmara úmida a 37 graus Celsius por 30 minutos. Após a incubação, remova a mistura de ligadura e lave as lâminas duas vezes com tampão de lavagem A.Adicione 40 microliters da mistura de amplificação de DNA que contém a polimerase de DNA e os oligonucleotídeos fluorescentes rotulados em cada poço, e incubar por 100 minutos na câmara úmida a 37 graus Celsius.

Remova a mistura de amplificação e lave os slides em 100 mililitros de tampão de lavagem B por 10 minutos por lavagem. Em seguida, lave os slides em 100 mililitros de tampão de lavagem B diluídos de um a 100 em água ultrauso. Adicione 20 microliters de meio de montagem contendo DAPI por poço.

Cubra os poços do slide com um deslizamento de tampa e lacre com esmalte. Este protocolo foi usado com sucesso para monitorar conjuntos de acompanhantes transitórios formados entre proteínas distintas de domínio J e proteínas de domínio Hsp70 e domínio J em células HeLa, S.cerevisiae e E.coli. As proteínas de domínio classe A e B classe B foram alvo de anticorpos primários altamente específicos.

Cada um dos puncti fluorescentes vermelhos representa um complexo proteico formado entre duas proteínas distintas de domínio J em células HeLa. Complexos proteicos similares de domínio J de classe mista também são observados no eucariote unicelular S.cerevisiae, ou na levedura do padeiro. Alguns dos puncti fluorescentes gerados a partir de PLA foram mais difíceis de resolver como focos individuais, devido ao tamanho de pequenas células.

A formação complexa entre as proteínas de domínio classe A e B J não foi observada nas células E.coli, o que é consistente com estudos bioquímicos realizados com proteínas purificadas. Mas outros conjuntos de acompanhantes envolvendo proteínas de domínio J e a acompanhante Hsp70 foram capturados usando o protocolo PLA. Os controles técnicos sem um anticorpo primário contra uma das proteínas de domínio J ou acompanhantes interagindo nas reações pla completas mostraram pouca ou nenhuma formação de puncti de fluorescência nas células, indicando falta de amplificação de sinal falso positivo.

Para obter resultados confiáveis utilizando o ensaio de ligadura de proximidade, verifique previamente que os anticorpos utilizados são de qualidade suficiente. Além disso, tome precauções para evitar a digestão excessiva de células contendo uma parede celular.