Summary
Cognate J-etki proteinleri hsp70 şaperon ile protein katlama bozulması arasında değişen biyolojik süreçler sayısız yardımcı olmak için işbirliği. Burada, bakteriyel, maya ve insan hücrelerinde geçici olarak oluşan bu şaperon makinelerinin izlenmesine olanak sağlayan bir in situ yakınlık ligasyon tetkikini tanımlıyoruz.
Abstract
J-etki proteinleri (JDP' ler) ökaryotik hücrelerdeki en büyük ve en çeşitli eş-şaperon ailesini oluşturur. Son bulgular, JDP ailesinin belirli üyelerinin ökaryotlarda 70 kDa ısı şok proteini (Hsp70) şaperon bazlı protein disaggregazları için substrat seçiminde ince ayar yapmak için geçici heterokompleksler oluşturabileceğini göstermektedir. JDP kompleksleri akut/kronik strese bağlı toplu proteinleri hedef alır ve muhtemelen protein agregalarının yüzeyine birden fazla Hsp70'i işe alarak disagregaların biraraya getirilmesine yardımcı olur. Bu fiziksel olarak etkileşen JDP'ler tarafından oluşturulan protein kalite kontrol (PQC) ağının kapsamı in vivo olarak büyük ölçüde tanımlanmamış tır. Burada, ökaryotik hücrelerin farklı hücresel bölmelerinde bu geçici olarak oluşturulmuş şaperon komplekslerini sağlam bir şekilde yakalayabilen yakınlık ligasyon analizi (PLA) adlı yerinde protein etkileşimi testinde mikroskopi tabanlı bir tanım atıyoruz. Çalışmalarımız pla istihdamını insan hücrelerinden mayaya(Saccharomyces cerevisiae)ve bakterilere(Escherichia coli)genişletir ve böylece her ikisinde de geçici olarak oluşan protein derlemelerinin dinamiklerini izlemek için önemli bir araç oluşturur. prokaryotik ve ökaryotik hücreler.
Introduction
Hücresel etkileşimleri tam olarak anlamamız nedeniyle büyük miktarda genomik bilgi yorumlanabilir. Yaygın olarak kullanılmasına rağmen, kimyasal çapraz bağlantı ve protein ko-lokalizasyonu olmayan protein ko-immünopresidipitasyonu gibi geleneksel protein-protein etkileşim isaptama metodolojileri bir dizi dezavantaj teşkil eder. Bazı ana dezavantajları etkileşimleri kötü nicelleştirme ve olmayan yerli bağlayıcı olayların potansiyel giriş içerir. Buna karşılık, gelişmekte olan yakınlık tabanlı teknikler hücrelerde protein etkileşimleri yakalamak için bir alternatif ve güçlü bir yaklaşım sağlar. Yakınlık ligasyon test (PLA)1, şimdi özel bir kit olarak kullanılabilir, özellikle etkileşimalt birimlerinin yakınlığına dayalı protein kompleksleri hedef antikorlar kullanır.
PLA, hedeflenen protein kompleksinin yüzeyinde küçük DNA etiketleri (PLA probları) bulunan primer ve sekonder antikorlardan oluşan bir iskele nin oluşumu ile başlatılır (Şekil1, adım 1-3). Daha sonra, DNA etiketlerinin yakınlığı ile belirlenen dairesel bir DNA molekülü konektör oligonükleotidlerle melezleme yoluyla oluşturulur (Şekil1, adım 4). Dairesel DNA'nın oluşumu bir DNA ligasyon adımı ile tamamlanır. DNA'nın yeni oluşan dairesel parçası sonraki haddeleme daire amplifikasyon için bir şablon olarak hizmet vermektedir (RCA)tabanlı polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) konjuge oligonükleotid etiketleri biri tarafından astarlanmış. Bu, antikor iskelesi aracılığıyla protein kompleksine bağlı tek iplikli konkatemerik bir DNA molekülü oluşturur (Şekil1, adım 6). Concatemeric DNA molekülü, yükseltilmiş DNA'ya dağılmış birden fazla benzersiz diziyle melezleşen floresan etiketli oligonükleotidler kullanılarak görselleştirilmiştir (Şekil1, adım 7)2. Floresan nokta (Şekil1, adım 7) olarak görünen üretilen PLA sinyali, hedeflenen protein kompleksinin hücredeki konumuna karşılık gelir. Sonuç olarak, titretisi protein komplekslerini yüksek mekansal doğrulukla tespit edebilir. Teknik sadece protein etkileşimleri yakalama ile sınırlı değildir, ama aynı zamanda yüksek duyarlılık1,2ile proteinler üzerinde tek moleküller veya protein değişiklikleri tespit etmek için kullanılabilir .
Hsp70, bir dizi temizlik ve stresle ilişkili fonksiyonlara katılarak hücresel protein homeostazını korumak için temelde çok yönlü bir şaperon sistemi oluşturur. Hsp70 şaperon sisteminin temizlik faaliyetleri arasında de novo protein katlama, hücre zarları arasında protein translokasyonu, protein komplekslerinin biraraya toplanması ve disassemblyasyonu, protein aktivitesinin düzenlenmesi ve farklı protein katlamalarının bağlanması/ kalite kontrol makineleri3. Aynı şaperon sistemi aynı zamanda yanlış katlanmış/açılmamış proteinleri yeniden katar, protein agregasyonunu önler, protein ayrıştırmasını teşvik eder ve hücresel proteazlarla işbirliği ederek hücresel onarımı kolaylaştırmak için ölümcül olarak yanlış katlanmış/hasarlı proteinleri bozar. proteotoksik gerilmeler4,5. Bu işlevsel çeşitliliği elde etmek için, Hsp70 şaperon JDP ailesinin eş-şaperonları ve substrat bağlama veserbest3 Hsp70's ATP bağımlı allosteric kontrolü ince ayar nükleotid değişim faktörleri (NEFs) ortaklık dayanır 6 . Ayrıca, JDP eş-şaperonlar bu çok yönlü şaperon sistemi için substrat seçiminde hayati bir rol oynamaktadır. Bu ailenin üyeleri prototip JDP, E. coli DnaJ kendi yapısal homoloji dayalı üç sınıf (A, B ve C) ayrılır. A sınıfı JDO'lar, Hsp70 ile etkileşime giren Bir N-terminal J-etki alanı, glisin-fenilalanin açısından zengin bir bölge, Çinko parmak benzeri bir bölge (ZFLR) ve iki β-varil etki alanından oluşan bir substrat bağlama bölgesi ve bir C-terminal dimerizasyon etki alanı içerir. N-terminal J-etki alanı ve glisin-fenilalanin açısından zengin bir bölgeye sahip, ancak ZFLR'den yoksun JD'ler B sınıfına girerler. Genel olarak, bu iki sınıfın üyeleri refakat işlevlerinde yer almaktadır. Sadece J-etki alanı4paylaşmak JDPs içeren catchall sınıf C, altında düşen Üyeler, olmayan refakatsiz işlevleri çeşitli gerçekleştirmek için Hsp70s işe. JDP'lerin Hsp70 sisteminin değiştirilebilir substrat tanıma "adaptörleri" olarak önemli rolü, evrim sırasında aile üyelerinin genişlemesi ile yansıtılır. Örneğin, insanlar üzerinde 42 farklı JDP üyeleri4. Bu JDP'ler monomer, homodimer ve/veya homo/hetero oligomer4,5olarak işlev görür. Son zamanlarda, A sınıfı (örneğin, H. sapiens DNAJA2; S. cerevisiae Ydj1) ve B sınıfı (örneğin, H. sapiens DNAJB1; S. cerevisiae Sis1) ökaryotik JDPs in vitro agregaların verimli tanınmasını teşvik bildirilmiştir7,8. Bu karma sınıf JDP kompleksleri muhtemelen Hsp70 oluşumunu kolaylaştırmak için toplanan proteinlerin yüzeyinde biraraya- ve Hsp70 + Hsp100 tabanlı protein disaggregases7,8,9, 10. Ökaryotik hücrelerde geçici olarak oluşturulmuş bu karma sınıf JDP komplekslerinin varlığını destekleyen kritik kanıtlar PLA8ile sağlanmıştır.
PLA giderek metazoa protein etkileşimlerini değerlendirmek için istihdam edilmektedir, öncelikle memeli hücrelerinde. Burada, tomurcuklanan maya S. cerevisiae ve bakteri E. coli gibi ökaryotik ve prokaryotik tek hücreli organizmalarda geçici olarak oluşan şaperon komplekslerini izlemek için bu tekniğin başarılı bir şekilde genişlemesini rapor ediyoruz. Daha da önemlisi, bu genişleme pla'nın insan ve hayvan hücrelerini enfekte eden mikropların saptanması nda ve analizinde potansiyel kullanımını vurgulamaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Hela Hücre Hazırlama
- Aşağıdaki malzemeleri hazırlayın: PBS (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4), pH 7.4; DMEM, %10 FCS ve %1 Pen-Strep ile desteklenmiştir; PBS'de %4 paraformaldehit; PBS'de %0.5 Triton-X100; TBS-T (150 mM NaCl, 20 mM Tris, %0.05 Tween), pH 7.4; %0.0001 steril poli-L-L-Lizin çözeltisi; 10-iyi tanı slaytlar; nemli bir oda; kağıt mendil; ve Coplin slayt boyama kavanozları.
NOT: Optimum fiksasyon verimliliğini sağlamak için paraformaldehit çözümleri her deneyden önce taze olarak hazırlanmalıdır. - Islä±k dokularla kapalı bir kutunun altını kaplayarak nemli bir hazne hazirlayın. Enzimatik reaksiyonları kuluçkaya yatırırken oda sıcaklığının 37 °C'de olduğundan emin olmak için, deneye başlamadan önce nemli hazneyi 37 °C'ye yerleştirin.
- T25 şişelerinde Kültür HeLa hücreleri, 5 mL DMEM (Yüksek Glikoz, Glutamat ve Sodyum Piruvat takviyeli) %10 FCS ve %1 Pen-Strep ile desteklenir, %5 CO2içeren 37 °C CO2 kuluçka makinesinde . % 0.05 Trypsin-EDTA kullanarak yapışık hücreleri ayrıştırın. Ayrıştırılmış hücrelere taze DMEM ilave edildikten sonra, hücre sayma odası nı kullanarak hücreleri sayın ve nemli bir odanın içindeki tanısal slaytlarda büyür.
- 30 dakika boyunca steril bir hücre kültürü başlık UV-ışınlama ile tanı slaytlar sterilize.
- Deney için gerekli olan her kuyuya %0,0001 poli-L-l-lizin filtrelenmiş 100 μL steril ekleyin. 30 dk. Fazla poli-L-lizini her kuyu3x 50 μL ultrasaf su ile yıkayarak yıkayın.
- HeLa hücrelerini deneyin ve her kuyuya yaklaşık 15.000 hücre ekleyin. Gerekirse hücreleri kuyu başına en az 30-50 μL DMEM'e seyreltin.
- Hücreleri 37 °C 5% CO2 kuluçka makinesi içinde nemli bir odada büyümek yaklaşık 24 saat. Hücreler PLA başlamadan önce% 60-80 konfluent olmalıdır.
NOT: Çok yüksek bir birleşimi reaktiflerin emilimini azaltarak protokol sonunda elde edilen sinyali azaltır. - Kuyunun kenarına bir mendil kağıt koyarak orta çıkarın. Kuyuları 50 μL PBS ile 3x yıkayın.
NOT: Hücreler sıvılar sert bir şekilde eklendiğinde ayrıştırılabilir. Bu, yeni sıvı eklemeden önce kuyuların tamamen kurumasına izin vermemek ve yeni sıvıyı kuyunun kenarına hafifçe ekleyerek önlenebilir. - Her kuyuya PBS'de 50 μL taze hazırlanmış %4 paraformaldehit ekleyerek hücreleri düzeltin. Oda sıcaklığında 10 dakika kuluçka.
- Slaytları PBS'de 3 x yıkayın. 100 mL PBS içeren Coplin slayt boyama kavanozunda yıkıntıları gerçekleştirin. Her yıkama için, sallayarak olmadan oda sıcaklığında 5 dakika kuluçka.
- Bir Coplin slayt boyama kavanozunda PBS'de %0,5 Triton-X100'ün 100 mL'lik kısmını batırarak hücre zarını permeabilize edin. Sallayarak olmadan oda sıcaklığında 10 dakika kuluçka.
- TBS-T'de slaytları 3kat yıkayın. 100 mL TBS-T içeren Coplin slayt boyama kavanozunda yıkıntıları gerçekleştirin. Her yıkama için, sallayarak olmadan oda sıcaklığında 5 dakika kuluçka.
- Son yıkamadan sonra, bir kağıt mendil ile fazla tampon kaldırın. Bu noktada hücreler bölüm 4'te tartışılacak Yakınlık Ligasyon Test protokolü için hazırdır.
2. S. cerevisiae Hücre Hazırlama
- Aşağıdaki malzemeleri hazırlayın: 100 mM KPO4, pH 6.5, Yıkama Tamponolarak anılacaktır; %37 formaldehit; 100 mM KPO 4%4paraformaldehit , pH 6.5; 100 mM KPO 4, pH6.5'te 1.2 M sorbitol; lyticase çözeltisi (500 μg/mL lyticase, 20 mM β-mercaptoetanol, 100 mM KPO4, pH 6.5); %0.0001 poli-L-L-Lizin çözeltisi; 100 mM KPO4%Triton-X100% 1, pH 6.5; 10-iyi tanı slaytlar; nemli bir oda (adım 1.2'deki gibi hazırlanır); kağıt mendil; ve Coplin slayt boyama kavanozları.
NOT: Optimum fiksasyon verimliliğini sağlamak için paraformaldehit çözümleri her deneyden önce taze olarak hazırlanmalıdır. - Sallayarak 30 °C'de seçici olmayan Maya Özü, Peptone ve Dekstroz (YPD) ortamlarında bir gecede kültür yetiştirin.
NOT: Deneysel gereksinimlere bağlı olarak S. cerevisiae hücreleri Sentetik Komple (SC) orta veya seçici Sentetik Minimal (SM) orta yerine yetiştirilebilir. - Sabit kültürü 20 mL ortadaki 0,1'lik OD600'e seyreltin. OD600 0,5 ulaşınceye kadar sallayarak 30 °C'de hücreleri büyütün.
- 20 mL kültürünü 50 mL'lik santrifüj tüpe aktarın. 3 dk. için 665 x g santrifüj ile hücreleri pelet. 5 mL taze ortamda hücreleri yeniden askıya alın.
- Kültüre %37 formaldehit in 550 μL'lik kısmını ekleyerek hücreleri düzeltin. 15 dakika oda sıcaklığında kuluçka.
- 3 dk. için 665 x g santrifüj ile hücreleri pelet. Wash Tampon'da taze hazırlanmış %4 paraformaldehitin 1 mL'lik kısmını yeniden askıya alın. Oda sıcaklığında 45 dakika kuluçka.
- Kuluçka sırasında, her kuyuya %0,01 poli-L-lizin çözeltisi ekleyerek tanı slaytlarını hazırlayın. Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca slaytlar kuluçka.
- 30 dk sonra fazla poli-L-lizini ultra saf suyla yıkayın ve kaydıraklar kurumasını bekleyin. Kuru slaytlar kullanıma hazırdır.
- 1 mL Yıkama Tamponu ile hücreleri iki kez yıkayın. 3 dk. için 665 x g'deki hücrelerin santrifüjünde yıkıntıları gerçekleştirin.
- 3 dk. için 665 x g santrifüj ile hücreleri pelet. Yıkama Tamponu'nda 1 mL 1,2 M sorbitol'deki hücreleri yeniden askıya alın.
- 3 dk. için 665 x g santrifüj ile hücreleri pelet. Hücre duvarını sindirmek için 250 μL taze hazırlanmış Lyticase çözeltisi içinde pelet resuspend. Sallayarak 30 °C'de 15 dakika lyticase çözeltisindeki hücreleri kuluçkaya yatırın.
- Sindirimden sonra hücreleri 3 dk için 665 x g santrifüj ile 3x yıkayın ve supernatant çıkarın. Wash Tampon'da 1,2 M sorbitol'ün 250 μL'lik hücrelerini yeniden askıya alın.
NOT: Hücreler hücre duvarı sindiriminden sonra kırılgan olduğundan, hücrelere zarar vermemek için onları çok dikkatli bir şekilde yeniden askıya alın. - Poli-L-l-lizin kaplı slaytlara 20 μL'lik resuspended hücreleri ekleyin. 30 dk. Kuyuları 50 μL Yıkama Tamponu ile 3x yıkayarak yapışmayan hücreleri yıkayın.
- Yıkama Tamponunda %1 Triton-X'in %50'si Triton-X ile 3x yıkayarak hücre zarını permeabilize edin.
NOT: Bu noktada hücreler bölüm 4'te tartışılacak yakınlık ligasyon test protokolü için hazırdır.
3. E. coli Hücre Hazırlama
- Aşağıdaki malzemeleri hazırlayın: PBS-T (140 mM NaCl, 2 mM KCl, 8 mM K2HPO4, 1,5 mM KH2PO4, %0.05 Tween-20), pH 7.4; lysozyme solüsyonu (2 mg/mL lysozyme, 25 mM Tris-HCl pH 8.0, 50 mM Glikoz, 10 mM EDTA); %0.0001 poli-L-L-Lizin çözeltisi; %99 buz gibi metanol; %99 oda sıcaklığında metanol; %99 aseton; 10-iyi tanı slaytlar; nemli bir oda (adım 1.1.1 olarak hazırlanır); kağıt mendil; ve Coplin slayt boyama kavanozları.
- Sallayarak 30 °C'de Luria-Bertani (LB) orta bir gecede kültür büyümek.
- Taze LB orta 0,02 bir OD600 sabit kültür seyreltin. OD600 günlük faz hücreleri için 0.4 ulaşana kadar sallayarak 30 °C'de hücreleri büyütün.
- Hücreler 0,4'ün OD600'üne ulaşmadan yaklaşık 15 dakika önce, her kuyuya %0,0001 poli-L-l-l-lizin ekleyerek poli-L-lizin kaplı slaytlar hazırlayın. Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca slaytlar kuluçka.
- 30 dk sonra aşırı poli-L-lizin ultrasaf su ile yıkayın ve slaytlar hava kuru izin. Kuru slaytlar kullanıma hazırdır.
- Hücreler 0,4'ün OD600'üne ulaştığında, kültürün 1 mL'sini steril mikrosantrifüj tüpüne ve 2 dk için 2.650 x g'lık pelet hücrelerine aktarın.
- LB orta 50 μL hücreleri resuspend.
- 1 mL buz gibi %99 metanol ekleyerek hücreleri düzeltin. Elle çok nazikçe karıştırın. -20 °C'de 30 dk kuluçka yada hücreler.
- Fiksasyondan sonra poli-L-lizin kaplı slaytlara hücrelerin 20 μL'sini ekleyin. Slaytlar 30 dakika kuru masını bekleyin.
- Hücre duvarını sindirmek için her kuyuya 50 μL taze hazırlanmış lysozyme çözeltisi ekleyin. 25 °C'de 30 dk nemli bir odada kuluçkaya yatırın.
- Kuyunun kenarına bir mendil kağıt ekleyerek kuyulardan lysozyme çözeltisini çıkarın. PBS-T'nin 100 mL'sinde 3x kaydırakyı yıkayın. Her yıkamayı 30 s boyunca coplin slayt boyama kavanozunda, titremeden gerçekleştirin.
- Slaytlara bir kağıt mendil indeksi dokunarak slaytlardan yıkama arabelleği kaldırın.
- Her kuyuya %99 metanol 50°L ekleyerek hücre zarlarını permeabilize edin. Oda sıcaklığında 1 dakika kuluçka.
- Kuyunun kenarına bir mendil kağıt yerleştirerek metanol çıkarın.
- Her kuyuya %99 aseton 50 μL ekleyin. 1 dk kuluçka.
- Kuyunun kenarına bir mendil kağıt yerleştirerek aşırı asetonu çıkarın. Slaytların kurumasını bekleyin. Bu noktada hücreler bölüm 4'te tartışılacak yakınlık ligasyon test protokolü için hazırdır.
4. Yakınlık Ligasyon Tonu
- Aşağıdaki malzemeleri hazırlayın: Engelleme Tamponu; Antikor Seyreltme Tampon; Yıkama Tampon 'A' - (10 mM Tris, 150 mM NaCl, 0.05% Tween-20) pH 7.4; Yıkama Tamponu 'B' – (200 mM Tris, 100 mM NaCl) pH 7.4; Anti-Tavşan Sekonder Antikor PLUS; Anti-Fare Sekonder Antikor EKSI; 5x Ligasyon Tampon; ligase; 5x Amplifikasyon Tampon (Turuncu: λex 554 nm; λem 576 nm); polimeraz; ultra saf su; ve DAPI içeren montaj ortamı.
NOT: PLA algılama reaktifleri Yeşil (λex 495 nm; λem 527 nm), Kırmızı (λex 594 nm; λem 624 nm), FarRed (λex 644 nm; λem 669 nm) veya Brightfield (horseradish peroxidaz (HRP) türevlerinde de mevcuttur. konjuge). - Her kuyuya engelleme Arabelleği bir damla ekleyerek hücreleri engelleyin. Nemli bir odada 37 °C'de 30 dk kuluçka.
- Antikor Seyreltme Tampon stok antikorları seyrelterek antikor çözeltileri hazırlamak. Her kuyu için 40 μL antikor çözeltisi gereklidir.
- Kuyunun kenarına bir mendil kağıdı yerleştirerek engelleme tamponu kaldırın. Her kuyuya Antikor Seyreltme Tamponu'nda seyreltilmiş 40 μL antikor ekleyin. 37 °C'de nemli bir odada 60 dakika veya gece boyunca 4 °C'de kuluçka.
- Kuyunun kenarına bir mendil kağıt yerleştirerek kuyulardan antikor solüsyonu çıkarın. Slaytları 100 mL'lik Yıkama Tamponu 'A'yı Coplin slayt boyama kavanozunda 5 dakika boyunca, titremeden yıkayın.
- Yıkama adımları sırasında, seyreltmek 5x ikincil antikor probları, anti-tavşan PLUS & anti-fare MINUS (probların türlerinin özgüllüğü kullanılan birincil antikorlara bağlıdır), Antikor Seyreltme Tampon. Kuyu başına 40 μL antikor çözeltisi hazırlayın.
- Her kuyuya 40 μL ikincil antikor çözeltisi ekleyin. Nemli bir odada 37 °C'de 60 dk kuluçka.
- Kuyunun kenarına bir mendil kağıdı yerleştirerek kuyulardan ikincil antikor solüsyonu çıkarın. Slaytları 100 mL'lik Yıkama Tamponu 'A'yı Coplin slayt boyama kavanozunda 5 dakika boyunca, titremeden yıkayın.
- Yıkarlar sırasında kuyu başına 40°L ligasyon karışımı hazırlayın, 8 μL 5x Ligation Tampon, 31°L ultrasaf su ve 1 μL ligase karıştırılarak.
- Her kuyuya 40 μL ligasyon karışımı ekleyin. Nemli bir odada 37 °C'de 30 dk kuluçka.
- Kuyunun kenarına bir mendil kağıt yerleştirerek kuyulardan ligasyon karışımı çıkarın. Kaydırma 2x yıkayın 100 mL Yıkama Tampon 'A' bir Coplin slayt boyama kavanozunda 2 dakika, sallayarak olmadan.
- Yıkarlar sırasında kuyu başına 40 μL amplifikasyon karışımı hazırlayın, 8 μL 5x amplifikasyon çözeltisi, 31,5 μL ultrasaf su ve 0,5 μL polimeraz karıştırılarak.
NOT: 5x amplifikasyon floresan problar içerir. Bu karışımı ışıktan koruyun. Ayrıca, aşağıdaki adımların her biri sırasında slaytları ışıktan koruyun. Yarı saydam Coplin slayt boyama kavanozları ve nemli odaları kullanıyorsanız, alüminyum folyo sarın. - Kuyu başına 40 μL amplifikasyon karışımı ekleyin. Nemli bir odada 37 °C'de 100 dk kuluçka.
- Kuyulardan amplifikasyon karışımını çıkarın. Kaydırma 2x 100 mL Yıkama Tampon 'B' bir Coplin slayt boyama kavanozunda 10 dakika sallayarak olmadan.
- 100 mL'lik Yıkama Tamponu 'B' 1:100'ü Coplin slayt boyama kavanozundaki ultra saf suda 30 s'lik bir suda yıkayın.
- Slaytlara kuyu başına montaj ortamı içeren 20 μL DAPI ekleyin. Bir coverslip ile slaytlar kapatın ve oje ile mühür slaytlar.
- Görüntüleme durumunda, ışıktan korunurken, 10-15 dk montaj ortamı içeren DAPI'yi hemen kuluçkaya yatırın. Değilse, slaytları ışıktan korunan -20 °C'de 1 haftaya kadar saklayın.
5. Algılama
- Sırasıyla 20x/0.8 NA, 63x/1.4 NA ve 100x/1.4 NA Plan Apochromat hedefleri ile HeLa, S. cerevisiae ve E. coli hücrelerinin görüntülerini elde etmek için konfokal mikroskopi kullanın. 405 nm darbeli diyot lazer ile DNA lekeli DAPI heyecanlandırmak. PLA sinyali için (bu çalışma için) 561 nm katı hal lazer ile heyecan.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Saflaştırılmış proteinler iã§in daha önceki in vitro çalıŠmalarımız, insan sınıfı A ve B sınıf JDP' lerinin bir alt kümesinin, agregaedilen proteinlerin geniÅ bir seçeneÄ ini verimli bir Å efi hedeflemek ve muhtemelen Hsp70 bazlı birleÅ tirmeyi kolaylaÅ tırmak için geçici karma sınıf JDP kompleksleri oluşturduÄ protein disaggregases7. Karışık sınıf (A+B) JDP komplekslerinin insan servikal kanser hücrelerinde (HeLa) oluşup oluşmadığını belirlemek için PLA'yı çalıştırdık. İnsan JDPs DNAJA2 (sınıf A) ve DNAJB1 (sınıf B) yüksek spesifik primer antikorlar ve sekonder PLA probları ile hedeflendi (Şekil2A-C). Kırmızı floresan punctae görünümü hela hücrelerinde karışık sınıf DNAJA2 ve DNAJB1 komplekslerinin varlığını gösterdi (Şekil 2C) bizim önceki biyokimyasal bulgular doğrulayan7. Her punktum HeLa hücre sitosol / çekirdek bireysel bir protein etkileşimi olay temsil eder.
Bir proteine bağlı heyecanlı donör florofordan uygun bir kabul edici florofora aktarılan enerji miktarının bir okuması olarak protein etkileşimlerini algılayan Förster rezonans enerji transferinden (FRET) elde edilen önceki biyokimyasal sonuçlar ikinci proteine bağlı olarak, benzer karışık sınıf kompleksleri de maya JDPs arasında oluşabilir belirtti, in vitro8. Biyokimyasal bulgularımızı doğrulayarak, tek hücreli ökaryot S. cerevisiae (fırıncı mayası) pla hücreleri (Şekil2F)ile Ydj1 (sınıf A) ve Sis1 (sınıf B) arasında karma sınıf komplekslerinin oluşumunu gözlemledik. Mayada, küçük hücre büyüklüğü ve birden fazla punctae birleşerek nedeniyle, PLA tarafından üretilen bireysel floresan nokta genellikle daha az ayırt edilebilir olabilir. Floresan punctae oluşumunda önemli bir azalma nakavt veya insan ve maya hücrelerinde etkileşime JDPs nakavt sonra gözlendi8, farklı bu co-refakat kompleksleri yakalama pla yüksek özgüllüğünü gösterir hücre tipleri. Ökaryotik muadillerinin aksine, prokaryotik(E. coli)JDP'ler karışık sınıf JDP kompleksleri oluşturma ve işlevsel olarak protein ayrışmasını artırmak için işbirliği yeteneğinden yoksundur, in vitro8. Biyokimyasal analizile uyumlu olarak, e. coli'deki tek JDP olan DnaJ-YFP (a sınıfı) ve CbpA-mCherry (B sınıfı) arasında karışık sınıf JDP kompleks oluşumu nu gözlemlemedik (Şekil 2I). Ancak, pla kurulum iki JDPs içeren diğer şaperon meclisleri yakalamak başardı. Örneğin, DnaJ-YFP ve DnaK (bakteriyel Hsp70) (Şekil2L)ve CbpA-mCherry ve DnaK8 (veriler gösterilmedi) arasında şaperon kompleksleri tespit ettik. Bu iki bakteriyel şaperon kompleksleri yoğun hem in vitro ve in vivo karakterizedir8,11,12 böylece pla sonuçları doğrulayan. Bu gözlemler birlikte PLA'nın tek hücreli/çok hücreli ökaryotik ve prokaryotik hücrelerde geçici olarak oluşturulmuş şaperon makinelerini sağlam bir şekilde yakalama yeteneğini göstermektedir. Etkileşen JDP'lerden/şaperonlardan birine karşı birincil antikor bulunmayan, ancak fare ve tavşantömiyetli ikincil PLA probları içeren teknik kontroller, arka plan floresan sinyaline çok az ve çok az şey gösterdi (Şekil 2A,B,D,E,G,H, J,K) deneysel kurulumumuzda yanlış pozitif sinyal amplifikasyonunun eksikliğini gösterir.
Şekil 1: Yakınlık Ligasyon Tsalimi'nin kronolojik adımlarının şematik gösterimi. (1) Protein A ve protein B. (2) Primer (1°) antikorların A ve B proteinlerine bağlanması (yeşil ve açık kahverengi) arasındaki kompleks. İki ana antikor farklı konak türlerinde (örn. fare, tavşan veya keçi) yetiştirilmelidir. (3) Primer antikorlar dna oligo etiketleri (PLA probları) ile kovalent olarak bağlı türlere özgü sekonder (2°) antikorlar tarafından tanınır. (4) A ve B proteinleri karmaşık olduğunda, bağlı PLA probları, konektör DNA iplikçikleriyle melezleşmek için DNA oligolarının hibridize olmasını kolaylaştırmak için yakındırlar ve bu da dairesel bir DNA molekülünün oluşumuna neden olur. Daha sonra, bir DNA ligaz bir fosfodiester bağ oluşumukatalize ederek birlikte DNA iplikçiklerinin birleştirilmesi kolaylaştırır. (5) Dairesel DNA molekülünün 37° C'de bir bakteri DNA polimeraz tarafından Yuvarlanma Çemberi Amplifikasyonunun (RCA) başlatılması antikor konjuge DNA oligo etiketlerinden biri tarafından astarlanır. (6) Sekonder antikorlardan birine bağlı tek iplikli concatemeric DNA molekülünün üretimi. (7) Floresan etiketli tamamlayıcı oligonükleotid probların konkatemerik DNA molekülündeki benzersiz tekrarlayan diziyle hibridizasyonu. Melezleştirme adımından sonra, concatemeric DNA molekülü sabit hücrelerde hedeflenen protein kompleksinin yerinde parlak bir floresan nokta olarak görselleştirilmiş olabilir. Alt pla tekniğinin geçerli olduğu prokaryotik ve ökaryotik hücre tiplerini gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2. Prokaryotik ve ökaryotik hücrelerde PLA tarafından yakalanan moleküler şaperon derlemeleri. (A-C) İnsan servikal kanser hücre hattı HeLa DNAJA2 (sınıf A) ve DNAJB1 (sınıf B) arasında oluşan karma sınıf JDP komplekslerinin saptanması. PLA ile yapılan (A) anti-DNAJA2 antikor tek başına (negatif teknik kontrol); (B) anti-DNAJB1 antikor tek başına (negatif teknik kontrol); (C) anti-DNAJB1 ve anti-DNAJA2 antikorları birlikte. C panelinde birden fazla floresan noktanın (pozitif sinyal) görünümü DNAJA2 ve DNAJB1 arasında oluşan protein komplekslerinin varlığını gösterir. Her kırmızı floresan nokta/noktalama tek bir etkileşimi temsil eder. Çekirdekler (DNA) DAPI (siyan) ile boyanmıştır. (D-F) S. cerevisiae hücrelerinde Ydj1 (A sınıfı) ve Sis1 (B sınıfı) arasında oluşan karma sınıf JDP komplekslerinin saptanması. (D) PLA tek başına anti-Ydj1 antikor ile yapılan (negatif teknik kontrol); (E) PLA tek başına anti-Sis1 antikor ile yapılan (negatif teknik kontrol); (F) PLA anti-Ydj1 ve anti-Sis1 antikorları birlikte yapılır. Pozitif floresan sinyali S. cerevisiaeYdj1 ve Sis1 komplekslerinin varlığını gösterir. Maya çekirdekleri DAPI (siyan) ile boyanmıştır. (G-L) E. coli hücrelerinde prokaryotik Hsp70 (DnaK) ve JDP (DnaJ ve CbpA) arasında oluşan şaperon komplekslerinin saptanması. Prokaryotik JDP'lere karşı spesifik primer antikorların olmaması nedeniyle, Sırasıyla E. coli DnaJ (a sınıfı) ve CbpA (sınıf B) YFP ve mCherry ile etiketlendi. (G, J) PLA sadece anti-YFP ile yapılır (negatif teknik kontrol); (H) PLA sadece anti-mCherry ile yapılır (negatif teknik kontrol). (I) PLA anti-YFP ve anti-mCherry antikor ile yapılır. Floresan nokta oluşumunun olmaması DnaJ ve CbpA arasında karmaşık bir oluşum olmadığını gösterir. (K) PLA tek başına anti-DnaK antikor (negatif teknik kontrol) ile yapılır. (L) PLA anti-YFP ve anti-DnaK antikorları ile birlikte yapılır. Pozitif floresan sinyal DnaK ve DnaJ arasında karmaşık oluşumu gösterir. Bakteriyel DNA DAPI (siyanen) ile boyanmıştır. Tek bir primer antikor içeren ek olarak, tüm negatif teknik kontroller ilgili ikincil PLA probları varlığında yapıldı. Ölçek çubukları = 10 μm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ko-immünoprepitasyon ve ko-lokalizasyon aparatlarına dayalı yaklaşımlar, protein birliğini karakterize etmek için uzun süreli yöntemler olarak kullanılmıştır. Geçici olarak oluşturulmuş özel şaperon komplekslerinin saptanması bu tür geleneksel yöntemlerle büyük bir sorundur ve sonuç olarak, önceki bulgular büyük ölçüde nitel yorumlamalarla sınırlıdır. Hücre lisis tabanlı koimmünopremteknikleri genellikle protein-protein etkileşimlerini stabilize etmek için çapraz bağlantı gerektirir. Hücre lisisgeçici olarak oluşturulan şaperon kompleksleri bozma riskini artırır, çapraz bağlama yerli olmayan etkileşimler tanıtmak olabilir ise, özellikle en şaperon doğal "yapışkanlık" tarafından tahrik. Co-immünoprepit kullanarak Hsp70 şaperon sistemi analiz ederken, potansiyel eserler ortaya çıkabilir (a) şaperon yüksek ekspresyon düzeyleri ve (b) membran veya protein agrega bağlı şaperon makineleri ile ilgili çözünürlük sorunları. Ayrıca, co-immünopresid bazlı teknikler yakalanan protein derlemelerinin hücresel lokalizasyonu hakkında hiçbir bilgi sağlamaz, bu da ilişkili fonksiyonların delineating için önemli olabilir. Ko-immünopreplasyon teknikleri kullanmanın sakıncaları protein lokalizasyon bilgilerini koruyan ko-lokalizasyon temelli yaklaşımlarda biraz azaltılmıştur. Ancak, iki veya daha fazla proteinin birlikte lokalizasyonu ya doğrudan protein-protein ilişkisi ya da proteinlerin hücrelerde aynı mikroetki alanına bölünmesini gösterebilir. Bu nedenle, co-lokalizasyon analizi, en iyi, protein etkileşimleri tahmin spekülatif ve herhangi bir yakınlık değeri yoksundur. Hedeflenen proteinlerin toplu ve gelişigüzel saptanması nedeniyle, bu teknik hücrelerdeki spesifik protein derlemelerinin incelenmesinde son derece sınırlıdır. Bu özellikle hedeflenen protein(ler) hsp70 şaperon sisteminde olduğu gibi farklı protein derlemeleri geniş bir yelpazede oluşturabilir sorunludur. Bu konvansiyonel metodolojilerle karşılaştırıldığında PLA, korunmuş protein lokalizasyon bilgilerine sahip hücrelerdeki yerli protein çağrışımlarını sağlam bir şekilde tespit etmek ve ölçmek için geliştirilen yerinde daha rafine bir tekniktir. Hedeflenen proteinler arasındaki yakınlık (yaklaşık 10-30 nm) dayalı bu test ile bir protein etkileşimi ortaya. PLA yakınlık mesafesi aralığı (a) PLA probları bağlı oligonükleotid etiketleri uzunluğunu azaltarak ve / veya (b) doğrudan birincil antikorlar etiketleri konjuge tarafından daha sıkı bir okuma elde etmek için azaltılabilir "mümkün" dir. Olumlu pla sinyali yorumlanırken dikkatli olunmalıdır. İdeal olarak, bir protein etkileşimi iki veya daha fazla bağımsız metodolojiile doğrulanmalıdır. PLA'daki floresan sinyalin yoğunluğu, FRET'te olduğu gibi protein kümesi büyüklüğü veya etkileşim proteinler arasındaki ayırma mesafesi ile deterministik olarak ilişkili değildir. Ancak, PLA özgüllük ve duyarlılık yüksek derecede vardır, ve hatta büyüme faktörleri veya sitokinler ve nadir hücre tipleri veya klinik örneklerde etkileşimleri gibi çok düşük bol proteinlerin analizi için kullanılabilir13.
Hsp70 şaperon, hücresel ömrü boyunca14 farklı biyolojik işlevleri kullanmak için birden fazla eş-refakatçiyle (örneğin, JDP'ler ve NEF'ler) ortak olur. Olası Hsp70-JDP-NEF makine yapılandırmalarının sayısı ve hücrelerdeki dinamik davranışları, bu şaperon makinelerinin belirli rollerinin ayrıntılı bir şekilde anlaşılmasını büyük ölçüde engellemiştir. Bu nedenle, farklı Hsp70 montajlarının seçici olarak izlenmesine olanak tanıyan biyolojik araçlar, hücrelerdeki bu şaperon ağının genel kablolarını incelemek için gereklidir. Geçici olarak oluşan JDP-JDP ve JDP-Hsp70 şaperon kompleksleri7 PLA'lı hücrelerde etkili bir şekilde yakalanmış, bu teknik yüksek ayrışma sabitleri ile moleküler etkileşimleri incelemek için uygundur (örn. >3 μM Kd ). Ancak, mevcut çalışmada, teşp öncelikle şaperon etkileşimi için "evet" veya "hayır" tipi ikili gösterge olarak kullanılır, kullanıcılar floresan dijital sayma tarafından etkileşim derecesi yarı nicel okumalar elde etmek için bu tekniği kullanabilir sinyal yoğunlukları15. Ancak PLA sinyalinin doğrusal olmayan amplifikasyonu nedeniyle PLA verilerini nicel bir şekilde yorumlarken dikkatli olunmalıdır16. Yukarıda belirtilen avantajlara rağmen, bu yöntemin bazı sınırlamaları vardır. PLA'nın en büyük dezavantajlarından biri, tayın hücre fiksasyonu gerektirmesi ve böylece canlı hücrelerde protein kompleksinin zamansal dinamiklerini çözme yeteneğini büyük ölçüde sınırlamasidır. Buna karşılık, in vivo FRET17 veya Bioluminesans Rezonans Enerji Transferi (BRET)18 nispeten daha küçük yakınlık değerleri (<10 nm) ile canlı hücrelerde benzer protein etkileşimlerinin spatio-temporal bir şekilde izlenmesine olanak sağlar. PLA'nın aksine, FRET sinyali protein ekspresyonu düzeyleri16 ile sıkı bir doğrusal korelasyon sergiler ve BU DA FRET'i protein etkileşimlerinin kantitatif analizinde altın standart haline getirir. Ancak, FRET'in esrarengiz oryantasyonfaktörüκ 2'ye olan bağımlılığından farklı olarak PLA, pla problarının yönünü etkilemez ve bu da protein kompleksini yakalama olasılığını arttırır19. Kullanıcı dostu açısından, FRET ve BRET böylece genellikle daha geniş araştırma topluluğu için bu metodolojilerin erişilebilirliğini sınırlayan benzersiz uzmanlık gerektirir. Ayrıca, bu tekniklerin her ikisi de potansiyel protein fonksiyonu ve karmaşık oluşumu ile müdahale edebilir hantal parlaklık / floresan protein etiketleri takarak etkileşim proteinlerin modifikasyonu gerektirir.
Aşağıdaki adımlar (1-4) hücrelerde PLA başarılı uygulanması için dikkatli dikkate gerektirir. (1) Antikor seçimi: Ticari olarak kullanılabilen PLA kiti, sadece fare, tavşan ve keçiye karşı yükseltilmiş birincil antikorlarla uyumludur. PLA, hedeflere bağlanmayan son derece spesifik primer antikorlar gerektirir. Ayrıca, antikorların tanıyabilmesini sağlamak için immünohistokimya (IHC), enzime bağlı immünosorbent tsay (ELISA) ve/veya immünopreksiyon (IP) gibi uygulamalarla uyumlu primer antikorların seçilmesi önemlidir. katlanmış proteinlerin yüzeyinde maruz antijenik amino asit dizileri. Kullanmadan önce, tüm primer antikorların özgüllükleri açısından test edilmesi şiddetle tavsiye edilir. Bu tüm hücre lysates batı leke analizi ile yapılabilir. Hedeflenen proteinlerin boyut ve dizi benzerliği (örneğin, Hsp70 ve JDP paralogları) küçük varyasyonları olan homologlara sahip olduğu durumlarda, antikorların özgüllüğü gen nakavt/nakavt yaklaşımları ile veya saflaştırılmış lara karşı probing ile test edilebilir. herhangi bir potansiyel çapraz tanıma ekarte etmek için homologs. Uygun antikorlar mevcut değilse, hedeflenen proteinler kabul edilebilir kalitede antikorlara sahip epitopyalarla etiketlenebilir (Şekil 2F). (2) Hücrelerin fiksasyonu ve permeabilizasyonu: Hücreleri düzeltmek ve permeabilize etmek için sırasıyla %4 paraformaldehit ve %0.1-0.5 Triton-X100 tedavisi kullanılabilir. %4 paraformaldehit kullanımı protein-protein etkileşimlerini ve hücresel ultrayapıyı korumak için %99 metanol kullanan fiksatif koşullara kıyasla daha iyi bir tedavi yöntemidir.20,21,22. %99 metanol içeren hücrelerin sabitlenmesi daha az sitoplazmik arka plan boyama sağlar ve belki de sitoiskelet ilişkili protein derlemelerinin tespiti gibi belirli durumlar için daha uygundur.21,22. Antikor erişilebilirliğini artırmak için hem plazma zarının hem de organel membranların etkin permeabilizasyonu non-iyonik yüzeyaktif triton-X100 ile sağlanabilir. Triton-X100, ancak, özellikle plazma membranından proteinleri kaldırabilir23,24. Bu nedenle, hücre zarları ile ilişkili protein derlemelerinin analizi için, membranları permeabilize etmek için sterolleri hedefleyen saponin veya digitonin gibi alternatif deterjanlar uygulanabilir21,22,25. (3) Hücre duvarının bozulması: Membran permeabilizasyonundan önce, hücre duvarları olan hücre tiplerinde (örneğin mantarlar, bitki ve bakteri hücreleri) antikorların penetrabiyetini artırmak için spesifik litik enzimleri içeren ek bir adım gereklidir. Örneğin, β-glucan'ı bozan liticaseS. cerevisiae26. Benzer şekilde,E. colihücre duvarı, peptidoglikanları hedef alan bir enzim olan lysozyme kullanılarak bozuldu.27,28. Hücre duvarı bileşimi ve litik enzim duyarlılığı farklı büyüme koşullarına göre değişir26ve kültür birleşimi29,30. Bu nedenle, litik enzimlerin konsantrasyonu ve sindirim süreleri değişebilir ve hücrelerin aşırı veya az hazımsız önlemek için bakım alınmalıdır. Hücre duvarı sindirim sonra, hücreler nispeten kırılgan ve yıkama adımları sırasında bozulmadan kalmak için sorbitol gibi kalabalık ajanlar gerektirir. (4) DNA amplifikasyonu: DNA ligasyonu ve haddeleme çemberi PCR reaksiyon adımları sıcaklık ve nem dalgalanmalarına duyarlıdır. Sağlam DNA amplifikasyonu ve tetkikin tekrarlanabilirliğini sağlamak için, bu reaksiyonların bir nem odasında 37 °C'de yapılması gerekmektedir. Daha da önemlisi, procceseed hücrelerin arka plan sinyalinde artışa yol açabilecek spesifik olmayan antikor bağlanması nı ve DNA amplifikasyon olaylarını önlemek için testi yaparken kuruması engellenmelidir.
Her şey göz önüne, bu testin uygulanması benzersiz uzmanlık ve sofistike enstrümantasyon gerektirmez. JDP-JDP ve JDP-Hsp70 şaperon komplekslerinin başarılı bir şekilde izlenmesi, bu tekniğin tüm hücre tiplerinde geçici olarak oluşan protein derlemelerini izleme potansiyelini göstermektedir. Tekniğin maya ve bakterilerde uygulanması, PLA'nın çok çeşitli organizmalarda farklı protein derlemeleri aracılığı ile çeşitli biyolojik süreçleri incelemenin uygulanabilirliğini önemli ölçüde artırmaktadır. Ayrıca, çalışmamız pla'yı türler arasında moleküler düzeyde meydana gelen evrimsel değişimleri incelemek için umut verici yeni bir protein etkileşim aracı olarak vurgulamaktadır8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
NBN Victoria Devlet Hükümeti ve Avustralya Hükümeti finansmanı ile Monash Üniversitesi Tıp Hemşireliği ve Sağlık Bilimleri Fakültesi özel bir İşe Hibe tarafından desteklenir. Bernd Bukau (ZMBH, Heidelberg Üniversitesi, Almanya) ve Harm H. Kampinga'ya (Hücre ve Sistemler Biyomedikal Bilimler Bölümü, Groningen Üniversitesi, Hollanda) değerli destekleri ve reaktiflerin paylaşımı için teşekkür ederiz, Holger Lorenz (ZMBH) Görüntüleme Tesisi, Heidelberg Üniversitesi, Almanya) konfokal mikroskopi ve görüntü işleme ile destek için, ve Claire Hirst (ARMI, Monash Üniversitesi, Avustralya) el yazması eleştirel okuma için.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 37% Formaldehyde | Merck | 103999 | |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 32201 | |
| anti-DNAJA2 antibody | Abcam | ab157216 | |
| anti-DNAJB1 Antibody | Enzo Life Sciences | ADI-SPA-450 | |
| anti-DnaK antibody | In house | ||
| anti-mCherry antibody | Abcam | ab125096 | |
| anti-Sis1 Antibody | Cosmo Bio Corp | COP-080051 | |
| anti-Ydj1 antibody | StressMarq Biosciences | SMC-150, | |
| anti-YFP antibody | In house | ||
| Coplin slide-staining jar | Sigma-Aldrich | S5516 | |
| Diagnostic slides | Marienfeld | 1216530 | |
| DMEM | Thermo-Fischer | 31966021 | |
| DuoLink In Situ Detection Reagents Orange | Sigma-Aldrich | DUO92007 | |
| DuoLink In Situ Mounting Medium + DAPI | Sigma-Aldrich | DUO82040 | |
| DuoLink In Situ PLA Probe Anti-Mouse MINUS | Sigma-Aldrich | DUO92004 | |
| DuoLink In Situ PLA Probe Anti-Rabbit PLUS | Sigma-Aldrich | DUO92002 | |
| DuoLink In Situ Wash Buffers, Fluorescence | Sigma-Aldrich | DUO82049 | |
| Fetal Calf Serum | Thermo-Fischer | 10082147 | |
| Lysozyme | Sigma-Aldrich | 62971 | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 32213 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo-Fischer | 15070063 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma-Aldrich | P47-07 | |
| Sorbitol | Sigma-Aldrich | S7547 | |
| Triton-X100 | Merck | 108643 | |
| Trypsin | Thermo-Fischer | 25300096 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Zymolase 100T / / Lyticase | United States Biological | Z1004 |
References
- Soderberg, O., et al. Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation. Nature Methods. 3 (12), 995-1000 (2006).
- Weibrecht, I., et al. Proximity ligation assays: a recent addition to the proteomics toolbox. Expert Review of Proteomics. 7 (3), 401-409 (2010).
- Mayer, M. P., Gierasch, L. M. Recent advances in the structural and mechanistic aspects of Hsp70 molecular chaperones. Journal of Biological Chemistry. 294 (6), 2085-2097 (2019).
- Kampinga, H. H., Craig, E. A. The HSP70 chaperone machinery: J proteins as drivers of functional specificity. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11 (8), 579-592 (2010).
- Nillegoda, N. B., Bukau, B. Metazoan Hsp70-based protein disaggregases: emergence and mechanisms. Frontiers in Molecular Biosciences. 2, (2015).
- Bracher, A., Verghese, J. The nucleotide exchange factors of Hsp70 molecular chaperones. Frontiers in Molecular Biosciences. 2, (2015).
- Nillegoda, N. B., et al. Crucial HSP70 co-chaperone complex unlocks metazoan protein disaggregation. Nature. 524 (7564), 247-251 (2015).
- Nillegoda, N. B., et al. Evolution of an intricate J-protein network driving protein disaggregation in eukaryotes. Elife. 6, (2017).
- Kirstein, J., et al. In vivo properties of the disaggregase function of J-proteins and Hsc70 in Caenorhabditis elegans stress and aging. Aging Cell. 16 (6), 1414-1424 (2017).
- Nillegoda, N. B., Wentink, A. S., Bukau, B.
- Chae, C., Sharma, S., Hoskins, J. R., Wickner, S. CbpA, a DnaJ homolog, is a DnaK co-chaperone, and its activity is modulated by CbpM. Journal of Biological Chemistry. 279 (32), 33147-33153 (2004).
- Kityk, R., Kopp, J., Mayer, M. P. Molecular Mechanism of J-domain-Triggered ATP Hydrolysis by Hsp70 Chaperones. Molecular Cell. 69 (2), 227-237 (2018).
- Söderberg, O., et al. Characterizing proteins and their interactions in cells and tissues using the in situ proximity ligation assay. Methods. 45 (3), 227-232 (2008).
- Benschop, J. J., et al. A consensus of core protein complex compositions for Saccharomyces cerevisiae. Molecular Cell. 38 (6), 916-928 (2010).
- Jung, J., et al. Quantifying RNA-protein interactions in situ using modified-MTRIPs and proximity ligation. Nucleic Acids Research. 41 (1), (2013).
- Mocanu, M. M., Váradi, T., Szöllosi, J., Nagy, P. Comparative analysis of fluorescence resonance energy transfer (FRET) and proximity ligation assay (PLA). Proteomics. 11 (10), 2063-2070 (2011).
- Sekar, R. B., Periasamy, A. Fluorescence resonance energy transfer (FRET) microscopy imaging of live cell protein localizations. Journal of Cell Biology. 160 (5), 629-633 (2003).
- Deriziotis, P., Graham, S. A., Estruch, S. B., Fisher, S. E. Investigating protein-protein interactions in live cells using bioluminescence resonance energy transfer. Journal of Visualized Experiments. 87, (2014).
- Nagy, P., Szöllosi, J. Proximity or no proximity: that is the question – but the answer is more complex. Cytometry. 75 (10), 813-815 (2009).
- Hoetelmans, R. W., et al. Effects of acetone, methanol, or paraformaldehyde on cellular structure, visualized by reflection contrast microscopy and transmission and scanning electron microscopy. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology. 9 (4), 346-351 (2001).
- Schnell, U., Dijk, F., Sjollema, K. A., Giepmans, B. N. Immunolabeling artifacts and the need for live-cell imaging. Nature Methods. 9 (2), 152-158 (2012).
- Stadler, C., Skogs, M., Brismar, H., Uhlen, M., Lundberg, E. A single fixation protocol for proteome-wide immunofluorescence localization studies. Journal of Proteomics. 73 (6), 1067-1078 (2010).
- Goldenthal, K. L., Hedman, K., Chen, J. W., August, J. T., Willingham, M. C. Postfixation detergent treatment for immunofluorescence suppresses localization of some integral membrane proteins. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 33 (8), 813-820 (1985).
- Schrader, M., Almeida, M., Grille, S. Postfixation detergent treatment liberates the membrane modelling protein Pex11beta from peroxisomal membranes. Histochemistry & Cell Biology. 138 (3), 541-547 (2012).
- Willingham, M. C., Yamada, S. S., Pastan, I. Ultrastructural antibody localization of alpha2-macroglobulin in membrane-limited vesicles in cultured cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 75 (9), 4359-4363 (1978).
- Aguilar-Uscanga, B., Francois, J. M. A study of the yeast cell wall composition and structure in response to growth conditions and mode of cultivation. Letters in Applied Microbiology. 37 (3), 268-274 (2003).
- Romaniuk, J. A., Cegelski, L. Bacterial cell wall composition and the influence of antibiotics by cell-wall and whole-cell NMR. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 370, 1679 (2015).
- Salazar, O., Asenjo, J. A.
- Cunningham, A. F., Spreadbury, C. L. Mycobacterial stationary phase induced by low oxygen tension: cell wall thickening and localization of the 16-kilodalton alpha-crystallin homolog. Journal of Bacteriology. 180 (4), 801-808 (1998).
- Werner-Washburne, M., Braun, E., Johnston, G. C., Singer, R. A. Stationary phase in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Microbiological Reviews. 57 (2), 383-401 (1993).
