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Research Article
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Expusemos um sistema microfisiológico (MPS) com organoides intestinais e hepáticos ao acetaminofeno (APAP). Este artigo descreve os métodos de produção organoide e avaliações de propriedade farmacocinética e toxicológica apap no MPS. Também descreve as análises de funcionalidade tecidual necessárias para validar os resultados.
Espera-se que os sistemas microfisiológicos (MPS) recém-introduzidos que cultivam organoides humanos tenham um desempenho melhor do que os animais na fase de testes pré-clínicos do processo de desenvolvimento de medicamentos porque são geneticamente humanos e recapitulam a interação entre tecidos. Neste estudo, a barreira intestinal humana (emulada por uma co-cultura de células Caco-2 e HT-29) e o equivalente hepático (emulado por esferoides feitos de células hepaRG diferenciadas e células estelares hepáticas humanas) foram integrados em um dispositivo microfluido de dois órgãos (2-OC) para avaliar algumas propriedades farmacocinóficas (APAP) e toxicológicas. O MPS tinha três conjuntos: Intestino apenas 2-OC, Fígado apenas 2-OC, e Intestino/Fígado 2-OC com a mesma mídia perfusando ambos organoides. Para avaliações de PK, dosamos o APAP na mídia em momentos de predefinição após a administração sobre a barreira intestinal (emulando a rota oral) ou na mídia (emulando a rota intravenosa), a 12 μM e 2 μM, respectivamente. As amostras de mídia foram analisadas por cromatografia líquida de alta pressão de fase invertida (HPLC). Os organoides foram analisados para expressão genética, para valores de TEER, para expressão e atividade proteica, e depois coletados, fixos e submetidos a um conjunto de avaliações morfológicas. A técnica MTT teve um bom desempenho na avaliação da viabilidade organoide, mas as análises de alto teor (HCA) foram capazes de detectar eventos tóxicos muito precoces em resposta ao tratamento apap. Verificamos que o fluxo de mídia não afeta significativamente a absorção de APAP, enquanto melhora significativamente a funcionalidade equivalente hepática. A absorção intestinal humana apap e o metabolismo hepático poderiam ser emulados no MPS. A associação entre os dados do MPS e na modelagem de sílico tem grande potencial para melhorar a previsibilidade dos métodos in vitro e proporcionar melhor precisão do que os modelos animais em estudos farmacocinéticos e toxicológicos.
Devido a diferenças genômicas e proteômicas, os modelos animais têm valor preditivo limitado para vários desfechos humanos. Além disso, são demorados, caros e eticamente questionáveis1. O MPS é uma tecnologia relativamente nova que visa melhorar a potência preditiva e reduzir os custos e o tempo gasto com testes pré-clínicos. São dispositivos microfluidos que cultivam organoides (unidades funcionais de mimética artificial de órgãos) sob fluxo de mídia que promove a comunicação organóide-organóide. Organoides feitos de células humanas aumentam a relevância translacional2,3,4. Espera-se que o MPS se comtrate melhor do que os testes em animais porque eles são geneticamente humanos e recapitulam a interação entre tecidos. Quando totalmente funcional, o MPS fornecerá resultados mais significativos, em maior velocidade e menores custos e riscos4. Muitos grupos estão desenvolvendo MPS para vários propósitos, especialmente modelos de doenças para testar a eficácia da droga.
O nível de exposição é um dos parâmetros mais críticos para avaliar a eficácia e toxicidade da droga5,6,7,8,9,10,11,12. O MPS permite a integração organoide que emula exposição sistêmica e espera-se que seja melhor do que a cultura tradicional do tecido humano 2D. Esta tecnologia pode melhorar significativamente a previsão de absorção intestinal composta e metabolismo hepático4.
Um MPS integrando modelo equivalente humano de intestino e fígado é um bom ponto de partida, considerando o papel central desses dois órgãos na biodisponibilidade de medicamentos e exposição sistêmica13,14,15. APAP é uma droga atraente para estudar um MPS sem um equivalente renal porque sua metabolização é feita principalmente pelo fígado16,17.
O 2-OC é um dispositivo microfluido de duas câmaras adequado para a cultura de dois diferentes tecidos/organoides equivalentes humanos interligados por microcanais16. A fim de emular uma administração oral/intravenosa humana in vitro de uma droga e avaliar os efeitos da conversa cruzada entre o intestino e os equivalentes hepáticos na farmacocinética APAP, além da funcionalidade e viabilidade dos organoides, foram realizados três diferentes conjuntos de MPS: (1) um "Intestino 2-OC MPS" composto por um equivalente intestinal baseado em uma inserção cultural contendo uma cocultura de células Caco-2 + HT-29, integrada ao dispositivo 2-OC; (2) um "Liver 2-OC MPS" composto por esferoides hepáticos feitos de HepaRG + HHSteC (Células Estelares Hepáticas Humanas) integrados no dispositivo 2-OC; e (3) um "Intestino/Fígado 2-OC MPS" composto pelo equivalente do intestino em um compartimento de dispositivo comunicando-se com o equivalente hepático no outro pelo fluxo de mídia através dos canais microfluidos.
Todos os ensaios foram realizados sob condições estáticas (sem fluxo) e dinâmicas (com fluxo) devido ao impacto dos estímulos mecânicos (compressão, alongamento e cisalhamento) na viabilidade e funcionalidades da célula18,19,20. O presente artigo descreve o protocolo para emulação de administração oral/intravenosa da APAP e as respectivas análises de absorção/metabolismo e toxicológicas no MPS 2-OC contendo modelos equivalentes de intestino humano e fígado.
1. Produção de equivalentes teciduais para cultivo no 2-OC
2. Integração de equivalentes intestinais e hepáticos em um MPS de 2-OC
3. Preparação de acetaminofeno (APAP)
4. Administração de substâncias de teste e amostragem de mídia
5. Instrumentação e condições cromatográficas
6. Equivalentes teciduais viabilidade/funcionalidade
Para realizar os testes PK APAP no MPS de 2-OC, o primeiro passo é fabricar o intestino humano e equivalentes hepáticos (organoides). Eles são integrados ao dispositivo microfluido 2-OC(Figura 1A) 24 h antes do início do ensaio PK APAP. No dia seguinte, o meio é alterado, e o modelo é exposto ao APAP. A Figura 1 ilustra os equivalentes do intestino e fígado colocados dentro do dispositivo 2-OC(Figura 1B) e do curso de tempo de experimento APAP PK(Figura 1C). Realizamos um ensaio MTT, medições de TEER, HCA, PCR em tempo real, mancha ocidental, histologia e microscopia de fluorescência confocal na cultura 2D e organoides 3D para verificar a viabilidade do tecido e detectar possíveis efeitos tóxicos APAP. Nas imagens de microscopia de fluorescência confocal, as amostras equivalentes do intestino manchadas com DAPI e Phalloidin (para núcleos e actina, respectivamente) foram apresentadas como barreira contígua para as não tratadas (Figura 2A) e as 12 amostras tratadas APAP(Figura 2B). Como visto na Figura 2C,o ensaio MTT mostrou níveis relativos de viabilidade celular acima de 70%, indicando a ausência de efeitos citotóxicos relevantes em resposta à exposição apap na concentração de 12 μM33,34,35,36,37. O controle positivo (100 mM) induziu morte celular significativa (sobrevida abaixo de 5%). A viabilidade caco-2/HT-29 e a diferenciação adequada, bem como a integridade da barreira equivalente do intestino foram verificadas pela evolução do TEER durante o período de diferenciação(Figura 2D). A APAP não causou qualquer alteração nos valores teer, como mostrado na Figura 2E. Foram analisadas a expressão dos transportadores ativos de glicose acoplado ao sódio SLC5A1, o transportador de resistência multidroga MDR1 e o ATPase de potássio de sódio, para verificar o impacto do tratamento APAP sobre a formação de barreiras celulares e a funcionalidade basal. Como demonstrado na Figura 2F-H,tanto os equivalentes intestinais tratados não tratados quanto apap mostraram expressão semelhante de SLC5A1 e NaKATPase. A administração oral de 12 μM APAP induzida marcou um aumento nos níveis de MDR1 mRNA em equivalentes intestinais após 24 h(Figura 2H). Também realizamos alterações fenotípicas de células por uma mistura de corante fluorforeiro para o conteúdo de massa nuclei e mitocondrial. Os controles positivos foram de 100 mM APAP e 1% naOH.
Além disso, analisamos se 12 μM APAP poderia induzir a citotoxicidade à co-cultura 2D Caco-2/HT-29. As imagens das células intestinais adquiridas com microscopia de fluorescência mostrada na Figura 2I corroboram os dados do MTT, que demonstraram que 12 μM APAP não causaram citotoxicidade significativa nos equivalentes intestinais Caco-2/HT-29.
A avaliação da viabilidade basal dos esferoides hepáticos e a citotoxicidade em resposta a 2 μM APAP foram feitas por ensaios MTT e análises morfológicas por microscopia de fluorescência confocal, histologia de H&E e HCA. Como mostrado na Figura 3A,o ensaio MTT não foi capaz de identificar qualquer citotoxicidade relevante em resposta ao tratamento de APA de 2 μm em amostras colhidas do conjunto Fígado 2-OC em condições estáticas e dinâmicas. A viabilidade celular diminuiu, mas permaneceu acima de 80% tanto para 12 h quanto 24h de pontos33,34,35,36,37. Os tratamentos de controle positivo (100 mM APAP e 1% NaOH) induziram danos teciduais significativos (viabilidade abaixo de 10%). Imagens confocal microscópicas indicam a ausência de um centro necrosado nos esferoides hepáticos em condições de tratamento basal ou APAP, e nenhuma evidência de taxas de mortalidade significativas(Figura 3B-C). No entanto, quando analisamos múltiplas alterações fenotípicas celulares após o veículo ou administração APAP de 2 μM na cocultura 2D HepaRG/HHSteC através do ensaio HCA, utilizando 100 mM APAP (C+) como controle positivo, contraditoriamente aos resultados do ensaio MTT, as células hepáticas demonstraram respostas citotóxicas precoces a 2 μMAP tratamento AP (Figura 3D). Após 24 h, houve diminuição no número de células, na área nuclear e aumento da massa mitocondrial. Além disso, um coquetel de corante fluoróforo contendo Hoechst 33342 e MitoTracker Deep Red foi usado para manchar os esferoides hepáticos 3D(Figura 3J). O software Fiji foi utilizado para avaliar a homogeneidade da arquitetura esférica 3D entre vários esferoides(Figura 3E-I). O gráfico mostrado na Figura 3E mostra a semelhança entre a área total dos spheróides hepáticos. A proporção (Figura 3F) em torno de 1 significa ausência de viés durante o processo de confecção dos esferoides. A avaliação também indicou que a maioria dos esferoides foram aproximadamente arredondados(Figura 3G). A avaliação do perímetro de morfologia e da distribuição celular foi feita por circularidade (Figura 3I) e pelo cálculo de solidez(Figura 3H), respectivamente. Concluiu-se que a metodologia de confecção dos esferoides hepáticos gerou organoides com perímetro liso, compatível com crescimento esférico, sem vieses ou necrose durante o processo.
Como demonstrado na Figura 4A-B,os spheróides hepáticos mostraram um alto nível basal relativo de albumina e expressão gst mRNA, respectivamente, indicando funcionalidade basal adequada. No entanto, o tratamento APAP de 2 μM para 24 h induziu uma diminuição nos níveis de expressão de albumina e gst mRNA, sugerindo comprometimento de esferoides hepáticos funcionalmente em 24 horas ponto de tempo do tratamento APAP.
A detecção dos níveis de expressão CYP3A4 e UGT1A1 mRNA demonstra a capacidade metabólica dos equivalentes hepáticos. O nível basal CYP3A4 mRNA (Figura 4C) foi consistente com os relatórios anteriores6. O tratamento APAP induziu uma tendência de diminuição tanto na expressão CYP3A4 mRNA quanto ugt1A1 em resposta ao tratamento APAP (Figura 4C-D) corroborando mais uma vez a hipótese de comprometimento dos esferoides hepáticos funcionalmente no ponto de tempo de 24 horas do tratamento APAP.
Além disso, foram realizados experimentos de manchas ocidentais e atividade enzimática in vitro para analisar a expressão da proteína albumina, bem como, a atividade CYP 3A4 em equivalentes hepáticos em condições de tratamento basal e em APAP. Descobrimos que o tratamento APAP de 2 μM realizado no Liver 2-OC MPS, induziu uma redução na expressão total de albumina equivalente hepática em 12 h e 24 h pontos de tempo em condições estáticas(Figura 4E) e dinâmica(Figura 4F). Por outro lado, amostras de equivalentes hepáticos de condições dinâmicas demonstraram uma tendência de apresentar níveis mais elevados de expressão proteica da albumina quando comparadas às condições estáticas(Figura 4G). O ensaio in vitro CYP 3A4 realizado em equivalentes hepáticos do Fígado 2-OC MPS mostrou que o tratamento APAP de 2 μM por 12 h ou 24 h foi capaz de induzir um comprometimento robusto e significativo da atividade CYP 3A4 em condições estáticas e dinâmicas(Figura 4H-I). Mais interessante, a presença de fluxo de mídia (dinâmica) induziu uma melhora significativa dos níveis de atividade cyp 3A4 em comparação com as condições em que os equivalentes hepáticos foram mantidos na ausência de meio circulante (condições estáticas) (Figura 4J).
Para encontrar a condição analítica mais sensível em relação à análise do HPLC, foram investigados diversos parâmetros, incluindo a composição da fase móvel, do tipo e concentração de aditivos. Descobriu-se que o acetonitrilo deu melhor resolução de cromatógrama e tempo de retenção adequado do que o metanol. A separação rápida e reprodutível do APAP foi obtida utilizando-se uma coluna de fase inversa C18. O valor do tempo de retenção apap (Rt) foi de 9,27 ± 0,19 minutos. A seletividade para APAP é indicada pela forma e resolução simétrica do pico, bem como pela falta de picos interferentes dos meios de cultura celular DMEM e Williams.
Concentrações padrão APAP em mídia de cultura celular DMEM S e Williams E S diluídas com tampão de acetato de amônio (1:1, v/v) variando de 0,25 a 100,00 μM foram usadas para construir as curvas de calibração. A linearidade do método foi determinada em nove níveis de concentração. Os dados são mostrados na Tabela 2 e Tabela 3. A relação entre a concentração de APAP e as áreas de pico foi descrita pelas equações de regressão linear: y = 16106 * x + 3579,8 (R2=1, em média DMEM) e y = 16397 * x + 2475,1 (R2=1, em média Williams), em que "x" é concentração nominal APAP em μM e "y" é a área de pico de cromatógrama de APAP em UA. No limite superior de quantificação (ou seja, 100,00 μM), o desvio percentual e os valores de variabilidade entre execuções foram inferiores a 2,50%. A precisão e a precisão para nove níveis de concentração, excluindo os 0,50 μM (LLOQ), estavam dentro de uma faixa aceitável com valores DEV e C.V. inferiores a 7,00%(Tabela 2 e Tabela 3).
O método analítico de precisão e precisão intra-executada, em quatro concentrações testadas, caiu dentro dos critérios geralmente aceitos para ensaios bioanalíticos. A reprodutibilidade do método foi avaliada pela análise de réplicas de amostras de controle de qualidade APAP de 0,50 (LLOQ), 4,50, 45,00 e 90,00 μM. Os resultados médios intra-run e inter-run são relatados na Tabela 4. A precisão e precisão do ensaio são demonstradas pelos valores DEV ≤ 15,00% e pelos valores C.V. ≤ 7,00%, respectivamente.
O LOD foi determinado como a amostra cuja relação sinal-ruído (S/N) era pouco maior que 3 e correspondia a um APAP de 0,25 μM. Por outro lado, o LLOQ, estimado com amostras apap de 0,50 μM, apresentou razão S/N igual a 10. Além disso, encontramos valores de precisão (DEV%) variando dentro ≤ 19,00% dos valores de concentração nominal. As variabilidades intra e inter-run foram demonstradas por C.V. ≤ 18,77%, conforme mostrado na Tabela 2, Tabela 3 e Tabela 4)29,30.
As análises apap PK foram realizadas em três diferentes conjuntos de 2-OC MPS: 1) Intestino 2-OC, contendo apenas o equivalente do intestino; 2) Fígado 2-OC, contendo apenas os esferoides hepáticos e 3) Intestino/Fígado 2-OC com barreira intestinal e esferoides hepáticos.
Para estudos de absorção, a rota oral foi imitada pela administração de 12 μM APAP no lado apical equivalente do intestino. As concentrações de APAP foram medidas pelo HPLC/UV, nas amostras médias, coletadas a partir de equivalentes intestinais apical e basolateral, tanto em condições estáticas quanto dinâmicas. A cinética APAP no meio coletada dos lados apical e basolateral demonstrou que o modelo intestinal foi capaz de absorver o APAP. Houve uma diminuição progressiva da concentração de APAP no lado apical (Figura 5A) concomitantemente ao aumento da concentração de APAP no lado basolateral intestinal(Figura 5B). As concentrações máximas (Cmax) no médio foram de cerca de 2 μM para condições estáticas e dinâmicas, após 12h da administração (Tmax).
Para estudos de metabolismo, a administração intravenosa foi imitada pela aplicação de 2 μM APAP no meio do compartimento hepático. A cinética de concentração DE APAP na mídia sob condições estáticas e dinâmicas indicou que apenas nas condições dinâmicas as reduções na concentração de APAP poderiam ser detectadas, atingindo 0,87 μM APAP 12 h após a administração apap de 2 μM (T1/2 = 12 h). Os equivalentes hepáticos apresentaram eficiência metabólica mínima em condições estáticas(Figura 5C). A concentração de APAP atingiu 1,7 μM 12 h após a administração da APAP. A avaliação integrada e sistêmica como a absorção de APAP e o metabolismo foi realizada no modelo Intestino/Fígado 2-OC. O APAP foi administrado sobre o lado apical do equivalente do intestino, emulando a rota oral. Foram coletadas amostras médias tanto dos lados intestinais quanto do compartimento hepático. A Figura 5D mostra a progressiva decadência da concentração de APAP no lado apical em condições estáticas e dinâmicas.
A Figura 5E mostra fases distintas de absorção e metabolismo. O fluxo também impactou na absorção intestinal. O APAP Cmax no meio mudou de 2 μM no conjunto "Intestino 2-OC"(Figura 5B) para 1,7 μM para o dinâmico "Intestino/Fígado 2-OC"(Figura 5E). A Figura 5F mostra uma comparação direta entre o perfil de concentração-tempo da APAP em nosso dinâmico sistema microfisiológico "Intestino/Fígado 2-OC" (curva vermelha e eixo y) e um perfil representativo obtido em humanos após uma única dose oral de 1000 mgs (curva preta e eixo y).
Figura 1: Compilação de etapas esquemáticas para estudos de PK no MPS 2-OC. A) Desenho esquemático do MPS 2-OC, mostrando os equivalentes de tecido humano intestinal e hepático na visão inferior para cima. B) Fotografia de 2-OC MPS com os equivalentes intestinal e hepático integrados ao dispositivo na visão inferior para cima, com imagens de microscopia óptica representativa. C) Linha do tempo de preparação de equivalentes teciduais, tratamento APAP e fases de coletas médias de cultura para fabricação organoide, e avaliações farmacocinéticas e toxicológicas. Este número foi modificado de Marin et al. Absorção de acetaminofeno e metabolismo em um sistema microfisiológico intestinal/hepático. Chem Biol Interact. 299, 59-76 (2019). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Viabilidade e avaliação toxicológica dos equivalentes do intestino. A) Imagens representativas de microscopia de fluorescência confocal de células caco-2/HT-29 não tratadas manchadas com núcleos celulares e filamentos de actina (DAPI e Phalloidin, respectivamente); 63x Ampliação, zoom 2.6. B) Imagens representativas de microscopia de fluorescência confocal de células caco-2/HT-29 tratadas com APAP de 12 μM por 24 h, manchadas com núcleos e filamentos de actina corante fluorescente (DAPI e Phalloidin, respectivamente); 63x Ampliação, zoom 2.6. C) A avaliação de viabilidade do intestino por ensaio MTT em condições estáticas e dinâmicas. Os valores representados pelas barras no gráfico são calculados por cento em relação ao controle do veículo (ponto de tempo nomeado como 0)*P<0,05 0 versus tratamento. D) Evolução do TEER durante os 21 dias de diferenciação. *P<0,05 dia 1 vs outros dias. E) Valores de TEER após a administração apap no Intestino 2-OC MPS em condições dinâmicas. Expressão genética em intestinos equivalentes. O potencial de absorção da barreira intestinal e possíveis efeitos de 12 μM APAP por 24 h em condição dinâmica foi verificado pela expressão SLC5A1(F),Na-K-ATPase (G) e MDR1(H). Os valores representam a média ± SEM de três experimentos independentes. O resultado é expresso como uma razão para a limpeza GAPDH. *P<0.05 veículo vs APAP. I) HCA baseada em imagem de Operetta realizada pelo Colombo® 2.4.0. Software. Imagens representativas da cocultura intestinal 2D em diferentes pontos de tempo após o tratamento APAP de 12 μM. Os controles negativos foram médios (0h) ou veículo (0,5% etanol). Controles positivos mostrados aqui é o APAP de 100 mM. Este número foi modificado de Marin et al. Absorção de acetaminofeno e metabolismo em um sistema microfisiológico intestinal/hepático. Chem Biol Interact. 299, 59-76 (2019). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Viabilidade e avaliação toxicológica dos equivalentes hepáticos. A) Avaliação de viabilidade de equivalentes hepáticos pelo ensaio MTT em condições estáticas e dinâmicas. Os valores representados pelas barras no gráfico são calculados por cento em relação ao controle do veículo (ponto de tempo nomeado como 0) *P<0,05 0 vs tratamento. B) Representantes de imagens confocal capturadas do veículo e 2 μM APAP 24 h tratadas de fígado de uma seção interna. C) Representantes Imagens de H&E (hematoxylin e eosina) capturadas do veículo e 2 μM APAP 24 h tratadas spheroids de fígado de uma seção interna. Barra de escala = 50 μm. D) Imagens representativas da cocultura hepática 2D em diferentes pontos de tempo após o tratamento APAP de 2 μM. Foram consideradas amostras tratadas com veículo e com APAP de 2 μM nestas análises. A mistura de corante fluorforeiro inclui Hoechst para coloração nuclear e Mitotracker Deep Red para coloração em massa mitocôndrias. Os controles negativos foram médios (0h) ou veículo (0,5% etanol). Os controles positivos foram de 100 mM APAP. Medições de imagens de esferoides inteiras capturadas foram realizadas usando o software Fiji. E) Distribuições de frequência da área F) proporção, G) arredondamento, H) solidez, I) circularidade. N = 85. *p < 0,05. J) Imagens representativas de esferoides hepáticos 3D adquiridos pela Operetta utilizando o objetivo LWD 10x. Este número foi modificado de Marin et al. Absorção de acetaminofeno e metabolismo em um sistema microfisiológico intestinal/hepático. Chem Biol Interact. 299, 59-76 (2019). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Viabilidade/funcionalidade hepática e possíveis efeitos de 2 μM APAP em condições estáticas e dinâmicas sobre ele foram verificados pela expressão genética e proteica e pela atividade enzimática. A) expressão genética albumina. B) Expressão genética GSTA2. A capacidade hepática para realizar o metabolismo da fase I e da fase II e possíveis efeitos de 2 μM APAP por 24 h em condição dinâmica sobre ele foram verificados pela expressão genética de CYP3A4 (C) e por UGT1A1 (D),respectivamente. E) Expressão total da proteína albumina sob condição estática. F) Expressão total da proteína albumina em condições dinâmicas. Condição. G) Gráfico comparativo ilustrando a diferença na expressão total da albumina em equivalentes hepáticos cultivados e tratados sob condições estáticas ou dinâmicas. H) CYP 3A4 atividade enzimática in vitro em condições estáticas. I) CYP 3A4 atividade enzimática in vitro em condições dinâmicas. J) Gráfico comparativo ilustrando a diferença na atividade CYP 3A4 em equivalentes hepáticos cultivados e tratados sob condições estáticas ou dinâmicas. Os valores representam a média ± SEM de três experimentos independentes. Os dados da expressão genética são expressos como uma razão para a limpeza GAPDH. Os dados de expressão proteica são expressos como uma razão para a proteína vinculina. *Tratamento P<0.05 veículo vs APAP. Este número foi modificado de Marin et al. Absorção de acetaminofeno e metabolismo em um sistema microfisiológico intestinal/hepático. Chem Biol Interact. 299, 59-76 (2019). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Análises da farmacocinética APAP em 2-OC MPS. Perfil de absorção APAP após administração APAP de 12 μM no lado apical da preparação do MpS do Intestino 2-OC. A barreira intestinal foi feita de uma cocultura das linhas celulares Caco-2/HT-29(A)Concentrações estáticas e dinâmicas de APAP no meio do lado apical (representando o lado do lúmen intestinal humano). (B) Concentrações estáticas e dinâmicas de APAP no meio do lado basolateral (representando o lado da corrente sanguínea intestinal humana). *P<0,05 condições estáticas versus dinâmicas. C) Perfil do metabolismo APAP no Fígado 2-OC MPS por spheróides hepaRG/HHSTeC. Comparação de condições estáticas e dinâmicas após uma administração APAP de 2 μM no meio. *P<0,05 0h vs 6 h, 12 h e tratamento APAP 24h. Absorção de APAP e perfil de metabolismo após administração de 12 μM no lado apical da barreira intestinal da preparação do Intestino/Fígado 2-OC MPS. Isso emula a rota oral. A barreira intestinal foi feita de linhas celulares Caco-2/HT-29 e o equivalente hepático feito de esferoides de linhas celulares HepaRG/HHSTeC. (D) Concentrações de APAP intestinal/fígado 2-OC no lado apical da barreira intestinal em condições estáticas e dinâmicas. (E) Concentrações de APAP intestinal/hepática 2-OC no meio em condições estáticas e dinâmicas. *P<0,05 condições estáticas versus dinâmicas. (F) Comparação entre o perfil de concentração-tempo da APAP em nosso sistema microfisiológico (curva vermelha e eixo y) e um perfil representativo obtido em humanos após uma única dose oral de 1000 mgs (curva preta e eixo y). Os dados foram extraídos de parcelas usando o WebPlotDigitizer 4.2 (https://automeris.io/WebPlotDigitizer). Este número foi modificado de Marin et al. Absorção de acetaminofeno e metabolismo em um sistema microfisiológico intestinal/hepático. Chem Biol Interact. 299, 59-76 (2019). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Sistema HPLC | Waters Alliance 2695 (Milford, MA, EUA), equipado com bomba quaternária, gerente de amostras e degasser | ||
| Detector | Waters 2996 Uv-Vis definido em 210-400 nm de alcance | ||
| Controle do sistema, aquisição de dados e processamento | Waters Empower 2002 software de cromatografia | ||
| Coluna | Fase invertida Luna C18 | ||
| (150 x 4,6 mm I.D.; tamanho de partícula de 5mm) | |||
| Phenomenex | |||
| Coluna de Guarda | Fase invertida Luna C18 (4 x 3 mm) | ||
| Phenomenex | |||
| Fase móvel | Solvente A-Acetonitrila | ||
| Solvente B- 0,10 M acetato de amônio, pH 6.8 | |||
| Condições isocráticas | Hora | A (%) | B (%) |
| (min.) | |||
| 15 | 5 | 95 | |
| Fluxo | 1,0 mL/min | ||
| Volume de injeção | 25 μL | ||
| Temperatura | 25 °C | ||
| Detecção de APAP | UV @ 243 e 254 nm | ||
| Tempo de execução | 15 minutos |
Tabela 1: Condições e parâmetros a serem utilizados para análises HPLC-UV da APAP em matrizes médias de cultura.
| Concentração nominal | Concentração de APAP calculado (μM) | Média (μM) | S.D. | C.v. | Dev | |||||
| (μM) | (Triplicado de cada concentração) | (μM) | (%)c | (%)d | ||||||
| Número de ensaio | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | ||||
| 0.25 (LOD) | 0.02 | 0.08 | 0.21 | 0.14 | 0.08 | 0.27 | 0.13 | 0.11 | 84.96 | + 46,05 |
| 0,50 (LLOQ) | 0.31 | 0.36 | 0.29 | 0.47 | 0.42 | 0.65 | 0.41 | 0.05 | 12.72 | + 17.08 |
| 1.00 | 0.87 | 0.87 | 0.80 | 1.04 | 1.02 | 1.01 | 0.93 | 0.04 | 3.76 | + 6,65 |
| 2.50 | 2.44 | 2.61 | 2.52 | 2.42 | 2.56 | 2.54 | 2.52 | 0.04 | 1.54 | -0.62 |
| 5.00 | 5.02 | 4.99 | 5.06 | 5.01 | 5.01 | 5.05 | 5.02 | 0.09 | 1.88 | -0.45 |
| 10.00 | 10.21 | 10.13 | 9.96 | 10.25 | 10.08 | 10.21 | 10.14 | 0.10 | 0.97 | -1.41 |
| 25.00 | 25.33 | 25.28 | 25.20 | 25.13 | 25.14 | 24.92 | 25.17 | 0.36 | 1.45 | -0.67 |
| 50.00 | 50.30 | 50.04 | 50.51 | 49.70 | 49.98 | 49.19 | 49.95 | 0.86 | 1.71 | +0.09 |
| 100.00 | 99.75 | 99.90 | 99.70 | 100.09 | 99.97 | 100.40 | 99.97 | 0.69 | 0.69 | +0.03 |
| R2 | 1.00 | 1.00 | 0.9999 | 1.00 | 1.00 | 0.9999 |
Tabela 2: Variação de execução inter- precisão, precisão e linearidade das amostras de curva padrão preparadas em uma mistura de meio DMEM com tampão de acetato de amônio de 0,10 M (1:1, v/v) de seis ensaios separados. um
um Uma curva linear foi encaixada aos dados para uma resposta (APAP) versus concentração teórica, conforme descrito em Experimental. A concentração calculada foi derivada da leitura da resposta para cada amostra padrão contra a curva de calibração. Cada entrada (ensaio 1-6) corresponde ao valor médio da análise triplicada.
b SD= Desvio padrão.
c C.V. (coeficiente de variação. precisão).
d Precisão (DEV %) = o desvio da concentração calculada do valor nominal.
Este número foi modificado de Marin et al. Absorção de acetaminofeno e metabolismo em um sistema microfisiológico intestinal/hepático. Chem Biol Interact. 299, 59-76 (2019).
| Concentração nominal | Concentração de APAP calculado (μM) | Média | S.D. | C.v. | Dev | ||||
| (μM) | (Triplicado de cada concentração) | (μM) | (μM) | (%)c | (%)d | ||||
| Número de ensaio | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | ||||
| 0.25 (LOD) | 0.34 | 0.12 | 0.30 | 0.16 | 0.00 | 0.18 | 0.08 | 45.46 | +26.03 |
| 0,50 (LLOQ) | 0.36 | 0.44 | 0.49 | 0.43 | 0.40 | 0.43 | 0.02 | 5.84 | +14,97 |
| 1.00 | 0.87 | 0.98 | 1.04 | 0.94 | 0.83 | 0.93 | 0.04 | 4.67 | +6,85 |
| 2.50 | 2.41 | 2.46 | 2.49 | 2.52 | 2.43 | 2.46 | 0.06 | 2.39 | +1,56 |
| 5.00 | 5.00 | 4.99 | 5.12 | 5.10 | 5.14 | 5.07 | 0.15 | 3.00 | -1.38 |
| 10.00 | 10.08 | 10.01 | 9.93 | 10.10 | 10.29 | 10.08 | 0.18 | 1.80 | -0.81 |
| 25.00 | 25.14 | 25.18 | 24.96 | 25.32 | 25.35 | 25.19 | 0.45 | 1.78 | -0.76 |
| 50.00 | 50.19 | 50.23 | 49.83 | 49.56 | 50.17 | 49.99 | 0.87 | 1.75 | +0.01 |
| 100.00 | 99.87 | 99.84 | 100.10 | 100.13 | 99.80 | 99.95 | 2.12 | 2.12 | +0,05 |
| R2 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 |
Tabela 3: Variação inter-executada – precisão, precisão e linearidade das amostras de curva padrão preparadas em uma mistura de meio Williams com tampão de acetato de amônio de 0,10 M (1:1, v/v) de seis ensaios separados. um
um Uma curva linear foi encaixada aos dados para uma resposta (APAP) versus concentração teórica, conforme descrito em Experimental. A concentração calculada foi derivada da leitura da resposta para cada amostra padrão contra uma curva de calibração. Cada entrada (ensaio 1-5) corresponde ao valor médio da análise triplicada.
b SD= Desvio padrão.
c C.V. (coeficiente de variação. precisão).
d Precisão (DEV %) = o desvio da concentração calculada do valor nominal.
Este número foi modificado de Marin et al. Absorção de acetaminofeno e metabolismo em um sistema microfisiológico intestinal/hepático. Chem Biol Interact. 299, 59-76 (2019).
| Meio Williams | Concentração nominal | Concentração medida | S.d. | C.v. | Dev |
| (μM) | (μM) | (μM) | (%) | (%) | |
| Intra-run (n=3) | 0,50 (LLOQ) | 0.49 | 0.08 | 15.55 | +1,77 |
| 4.50 | 4.59 | 0.23 | 5.10 | -2.06 | |
| 45.00 | 41.23 | 0.76 | 1.85 | +8.37 | |
| 90.00 | 82.29 | 1.75 | 2.13 | +8,57 | |
| Inter-run (n=15) | 0,50 (LLOQ) | 0.43 | 0.05 | 10.99 | +14,97 |
| 4.50 | 4.37 | 0.19 | 4.42 | +2,99 | |
| 45.00 | 42.35 | 0.82 | 1.93 | +5,88 | |
| 90.00 | 85.22 | 2.25 | 2.65 | +5.31 | |
| Meio DMEM | Concentração nominal | Concentração medida | S.d. | C.v. | Dev |
| (μM) | (μM) | (μM) | (%) | (%) | |
| Intra-run (n=3) | 0,50 (LLOQ) | 0.47 | 0.09 | 18.77 | +6.35 |
| 4.50 | 4.45 | 0.30 | 6.63 | +1.04 | |
| 45.00 | 44.24 | 1.59 | 3.58 | +1,69 | |
| 90.00 | 86.40 | 4.09 | 4.73 | +4.00 | |
| Inter-run (n=12) | 0,50 (LLOQ) | 0.46 | 0.08 | 17.81 | +7,75 |
| 4.50 | 5.16 | 0.27 | 5.31 | -14.68 | |
| 45.00 | 48.99 | 2.10 | 4.29 | -8.86 | |
| 90.00 | 96.18 | 4.47 | 4.65 | -6.86 |
Tabela 4: Precisão e precisão intra e inter-executado para APAP em amostras de controle de qualidade. um
um Os dados são mostrados como médias. SD (desvio padrão). C.V. (coeficiente de variação. precisão) e precisão (desvio percentual. DEV%).
Este número foi modificado de Marin et al. Absorção de acetaminofeno e metabolismo em um sistema microfisiológico intestinal/hepático. Chem Biol Interact. 299, 59-76 (2019).
| Primer (5' → 3') | |||
| Tecido | Gene | Frente | Reverter |
| Intestino | SGLT1/SLC5A1 | gAgCCCAgCAACTgTCCCAC | CAggCTCCAACACAgAgACggt |
| NA-K-ATPase | ACCgCCCAgAAATCAAAAACACACAAC | CAgCggTCATCCCAgTCC | |
| MDR1 | TggATgTTTCCggTTTggAg | TgTgggCTgCTgATATTTTgg | |
| Fígado | Albumina | TgCAAggCTgATAAggAg | TTTAgAGAGGGTTTTGGCTTTACAC |
| GSTA2 | CTgAggAACAAgATgCCAAgC | AgCAgAgggaaggCtggaaAATAAg | |
| CPY3A4 | ggAAggTggACCCAgAAACTgC | TTACggTgCCATCCCTTgAC | |
| UGT1A1 | ATgCAAAgCgCATggAgAC | ggTCCTTgTgAAggCTggAg |
Tabela 5: Primers qPCR em tempo real para avaliar a transcrição genética no nível mRNA nas culturas 2-OC para tecidos intestinais e hepáticos
Os autores não têm nada a revelar.
Expusemos um sistema microfisiológico (MPS) com organoides intestinais e hepáticos ao acetaminofeno (APAP). Este artigo descreve os métodos de produção organoide e avaliações de propriedade farmacocinética e toxicológica apap no MPS. Também descreve as análises de funcionalidade tecidual necessárias para validar os resultados.
Agradecemos ao Dr. Christie Guguen-Guillouzo, ao Dr. Philippe Gripon na Unidade 522 INSERM e ao Dr. Christian Trepo na Unidade 271 INSERM pelo uso do Material Biológico (células Hepa RG) e por disponibilizar para nós, a fim de realizar a pesquisa acadêmica.
| 1x DPBS | Thermo Fisher Scientific | 14190235 | Sem cálcio, sem magnésio |
| 2-OC | TissUse GmbH | Chip de dois órgãos | |
| Microplaca Esferóide de 384 poços | Corning | 3830 | Preto/Transparente, Fundo Redondo, Ultra-Baixo Fixação |
| 4% Paraformaldeído | Use para fixar células | ||
| Acetaminofeno | Sigma Aldrich | A7085 | Uso para ensaios MPS |
| Acetonitrila | Tedia | Usado para realizar HPLC | |
| Alexa Fluor 647 faloidina | Thermo Fisher | Experimento confocal | científico|
| Acetato de amônio | Sigma Aldrich | Usado para realizar | |
| HPLC Células Caco-2 | Sigma Aldrich | 86010202 | |
| Tampão | de cacodilato | ||
| Frascos | de cultura de célulasMicroscópio | de Fluorescência Confocal Sarstedt||
| Leica | DMI6000 | ||
| Cryostat | Leica | CM1950 | |
| DMEM alta glicose | Thermo Fisher Scientific | 12800017 | Adicione suplementos: 10% de soro fetal bovino, 100 unidades por mL de penicilina, 100 µ g/mL de estreptomicina e 1% de aminoácidos não essenciais |
| DMSO | Sigma Aldrich | D4540 | Adicionar 2% ao meio HepaRG |
| Etanol | Synth | ||
| Soro Fetal Bovino | Thermo Fisher Scientific | 12657029 | |
| Meio de congelamento OCT | Tissue-Tek | Tecido-Tek® O.C.T.™ O composto é uma formulação de glicóis e resinas solúveis em água, fornecendo uma matriz de amostra conveniente para seccionamento de criostato a temperaturas de -10° C e abaixo. | |
| Hematoxilina e Células Eosin | |||
| HepaRG | Biopredic International | HPR101 | Células indiferenciadas |
| HHSTeC | ScienCell Research Laboratories | 5300 | Células e todos os suplementos de cultura |
| Hoechst 33342 | HCA experimentos | ||
| HT-29 células | Sigma Aldrich | 85061109 | |
| Insulina Humana | Invitrogênico - Thermo Fisher Scientific | 12585014 | |
| Hidrocortisona | Sigma Aldrich | H0888 | |
| Isopropanol | Merck | 278475 | |
| Karnovsky' s fixador | |||
| L-glutamina | Thermo Fisher Scientific | A2916801 | |
| Luna C18 coluna de guarda SS | Phenomenex | Usado para realizar microscópio HPLC | |
| Leica | DMi4000 | ||
| Micrótomo | Leica | RM2245 | |
| Millicell 0.4 µ M inserções de tamanho de poro | Merck | PIHP01250 | |
| Millicell ERS-2 metro | Merck | MERS00002 | Usado para medição TEER |
| MitoTracker Deep Red | HCA experimentos | ||
| MTT | Thermo Fisher Scientific | M6494 | |
| Sistema MX3000P | Agilent Technologies | ||
| Câmara Neubauer | Sistema | ||
| de imagem de alto conteúdo de opereta | de contagem de células Perkin Elmer | Usado para realizar o ensaio HCA | |
| P450-Glo CYP3A4 com luciferina-IPA | Promega | Cat.# V9001 | |
| Penicilina/estreptomicina | Thermo Fisher Scientific | 15070063 | Cultura de células |
| Permount | Thermo Fisher Scientific | ||
| Histology Primers | Membrana de PVDF RT-qPCR | ||
| BioRad | |||
| PVDF Filtro | de seringa | 0,22 μ m tamanho dos poros | |
| Coluna Luna C18 de fase reversa | Phenomenex | Usado para realizar o agitador de HPLC | |
| (IKA VXR Basic Vibrax) | IKA Works GmbH & Co | 2819000 | Usado para esferóides para melhorar o ensaio MTT |
| Stellate Cell Media (STeC CM) | ScienCell | 5301 | Adicionar suplementos STeC CM |
| SuperScriptIITM Transcriptase reversa | Thermo Fisher Scientific | ||
| SYBR Green PCR Master Mix | Thermo Fisher Scientific | ||
| TRizol TM reagente | Thermo Fisher Scientific | Trizol é uma solução monofásica de isotiocianato de fenol e guanidina. | |
| Solução de tripsina/EDTA | Thermo Fisher Scientific | R001100 | |
| Placas de fixação ultrabaixa | Corning | CLS3471-24EA | 6 poços |
| Vectashield mais mídia | de montagem DAPI | ||
| Branco Opaco Microplaca de 96 poços | PerkinHelmer | ||
| Pontas | de furo largo | ||
| Williams E | Pan Biotech | P04-29510 | Adicionar suplementos: 10% de soro bovino fetal, 2 mM de L-glutamina, 100 unidades por ml de penicilina, 100 µ g/mL de estreptomicina e 5 µ g/ml de insulina humana |
