Piezo-ICSI para oócitos humanos

Resumo

Aqui, descrevemos um protocolo para injeção intracitoplasmática de espermatozóides em oócitos humanos usando uma micropipeta acionada por piezo.

Resumo

Desde que foram relatadas as primeiras gestações bem-sucedidas alcançadas por injeção intracitoplasmática de espermatozóides (ICSI), a ICSI tornou-se uma técnica essencial na tecnologia de reprodução assistida (ART). A ICSI usa micropipetas com ponta pontiaguda para penetrar na zona pelúcida e na membrana. Em seguida, o citoplasma é geralmente aspirado para a micropipeta para quebra da membrana (ICSI convencional). As taxas de sobrevivência e fertilização de oócitos de camundongos após ICSI convencional foram tão baixas quanto 16% e 8%, respectivamente. Kimura e Yanagimachi aplicaram uma unidade de acionamento piezoelétrica, mercúrio e uma micropipeta com ponta plana para ICSI de camundongo. A quebra da membrana pode ser realizada de forma semiautomática combinando esses tipos de equipamentos sem aspiração citoplasmática na micropipeta (piezo-ICSI). Esses autores relataram taxas de sobrevivência e fertilização significativamente maiores (80% e 78%) em comparação com as ICSI convencionais (16% e 8%). Portanto, o piezo-ICSI pode ser eficaz não apenas para oócitos de camundongos, mas também para ICSI de oócitos humanos. No entanto, apenas cinco artigos estão disponíveis que avaliaram a eficácia do piezo-ICSI em comparação com o ICSI convencional para oócitos humanos. Todos esses cinco artigos relataram taxas de fertilização significativamente mais altas em comparação com as da ICSI convencional. O objetivo do protocolo piezo-ICSI descrito aqui é melhorar os resultados clínicos da ICSI em comparação com a ICSI convencional.

Introdução

Desde que o Dr. Palermo relatou as primeiras gestações bem-sucedidas alcançadas por injeção intracitoplasmática de espermatozóides (ICSI)¹, a ICSI tornou-se uma técnica essencial na tecnologia de reprodução assistida (ART). A ICSI usa micropipetas com ponta pontiaguda para penetrar na zona pelúcida e na membrana. Em seguida, o citoplasma é geralmente aspirado para a micropipeta para quebra da membrana (ICSI convencional). As taxas de sobrevivência e fertilização de oócitos de camundongos após ICSI convencional foram tão baixas quanto 16% e 8%, respectivamente². Kimura e Yanagimachi aplicaram uma unidade de acionamento piezoelétrica, mercúrio e uma micropipeta com ponta plana para ICSI² de camundongo. A quebra da membrana pode ser realizada de forma semiautomática combinando esses tipos de equipamentos (piezo-ICSI). Esses autores relataram taxas de sobrevivência e fertilização significativamente maiores (80% e 78%) de ICSI piezo-ICSI em comparação com as de ICSI convencional (16% e 8%)². Uma das razões para os melhores resultados obtidos no piezo-ICSI pode ser o processo de quebra da membrana. O piezo-ICSI pode romper a membrana de forma estável e semiautomática sem aspiração citoplasmática na micropipeta. Esses resultados sugeriram que a aspiração citoplasmática para a micropipeta durante a quebra da membrana é invasiva para oócitos de camundongos. Portanto, o piezo-ICSI pode ser eficaz não apenas para oócitos de camundongos, mas também para ICSI de oócitos humanos.

No entanto, apenas cinco artigos disponíveis avaliaram a eficácia da ICSI piezo-ICSI em comparação com a ICSI convencional para oócitos humanos. Todos os cinco artigos relataram taxas de fertilização significativamente mais altas com piezo-ICSI em comparação com as taxas de fertilização com ICSI convencional 3,4,5,6,7 (Tabela 1). Portanto, o ICSI-piezo-pode melhorar as taxas de sobrevivência e fertilização em comparação com o ICSI-convencional. O objetivo do protocolo piezo-ICSI descrito aqui é melhorar os resultados clínicos da ICSI em comparação com a ICSI convencional.

Protocolo

O protocolo de piezo-ICSI descrito abaixo segue as diretrizes do comitê de ética em pesquisa humana do Kameda Medical Center.

1. Equipamento e preparação

1. Use um sistema piezo-ICSI composto por uma unidade de acionamento, uma caixa de operação, um pedal e um controlador. Use qualquer tipo de microscópio invertido ou micromanipulador de três eixos. Conecte a unidade de acionamento piezoelétrico ao suporte da micropipeta e coloque o pedal no chão. Defina o nível de INTENSIDADE para 2 e o nível de VELOCIDADE para 1 na caixa de operação.
2. Use uma micropipeta piezo-ICSI disponível comercialmente com uma ponta plana. Encha uma micropipeta com o líquido de operação (fluido à base de fluorocarbono) até um comprimento de 20 mm. Evite misturar bolhas de ar no líquido de operação. Aspire quaisquer bolhas de ar ou excesso de líquido de operação para a parte de trás da pipeta com o dispositivo de enchimento de líquido.
3. Instale a micropipeta no suporte da micropipeta de injeção. Se o suporte da micropipeta de injeção tiver um tubo de silicone, insira a cabeça da pipeta cerca de 5 mm no tubo de silicone. Aperte a tampa do suporte e fixe firmemente a micropipeta.
4. Conecte a unidade de acionamento ao manipulador e fixe firmemente para evitar qualquer rotação causada por seu peso.
5. Posicione a micropipeta no campo do microscópio. Opere o injetor e empurre o líquido de operação para a cabeça da micropipeta de modo que qualquer ar dentro da cabeça da pipeta seja pressionado para fora. Confirme se não há ar dentro da cabeça da pipeta a olho nu e não com um microscópio.
6. Prepare o prato ICSI no prato com fundo de vidro conforme mostrado na Figura 1. Prepare duas microgotículas de solução de polivinilpirrolidona (PVP) a 7%: a microgota menor é para a preparação de micropipeta (5 μL) e a outra é para seleção de espermatozóides (10 μL). Prepare outra gota feita no centro do prato com fundo de vidro a partir do meio tamponado; esta microgotícula é para o oócito e é usada para injeção de espermatozóides (8 μL).
7. Insira a cabeça da micropipeta em uma gota de PVP a 7% e cubra a parede interna da micropipeta. Opere o injetor vigorosamente, movendo-o ao longo do limite interfacial entre o líquido de operação e o PVP. Enxágue o interior da micropipeta com PVP a cerca de 800 μm da cabeça da pipeta.
   1. Repita este procedimento (~ 3 ou 4 vezes) até que o limite interfacial deslize suavemente.

2. Imobilização de espermatozoides

1. Defina o nível de INTENSIDADE para 2 e o nível de VELOCIDADE para 1 na caixa de operação. Aplique o pulso piezo da unidade de acionamento conectada ao suporte da micropipeta quando o pedal estiver ligado. Ao aplicar o pulso piezo durante o procedimento, o ícone "Pulso piezo" aparece no canto superior direito do vídeo.
2. Colete o esperma móvel usando um gradiente de densidade e segure o esperma móvel coletado no meio tamponado. Aspire o meio tamponado contendo o esperma móvel coletado por cerca de 2-3 μL usando uma pipeta. Em seguida, injete este meio na parte inferior da microgota de PVP a 7%. Selecione o esperma com ampliação de 400x.
   1. Conecte a ponta da micropipeta à cauda do esperma selecionado e, em seguida, conduza a unidade de acionamento piezoelétrica. Normalmente, repita a condução 3 vezes para uma imobilização de espermatozóides. Após a imobilização do esperma, aspire o esperma para a cauda da micropipeta primeiro.

3. Operação piezo-ICSI (um oócito com membrana de alta capacidade de alongamento)

1. Mantenha a cabeça do espermatozóide em uma posição a cerca de um espermatozóide de comprimento total da cabeça da micropipeta. Enquanto aciona a unidade de acionamento piezoelétrico (cerca de 5 vezes por oócito), avance a micropipeta para realizar a punção sem deformação da zona pelúcida. Quando a ponta da micropipeta atinge a camada interna da zona pelúcida e, em seguida, a peça oca da zona pelúcida é completamente aspirada para dentro da micropipeta, a punção da zona pelúcida é concluída.
2. Remova o pedaço oco da zona pelúcida dentro da micropipeta e, ao mesmo tempo, mova o esperma para a cabeça da micropipeta. Empurre a micropipeta e estique a membrana citoplasmática até cerca de 90% do diâmetro do oócito.
3. Quando estiver suficientemente esticado, inicie o acionamento piezoelétrico uma vez para romper a membrana. A quebra da membrana é concluída quando é confirmado que a membrana se recuperou.
4. Após a quebra da membrana, injete a cabeça do espermatozóide no oócito. Depois que a cabeça do espermatozoide for certamente injetada no citoplasma, preste atenção para não adicionar líquido desnecessário.

4. Operação piezo-ICSI (um oócito com membrana de baixa capacidade de alongamento)

NOTA: Explicamos como lidar com um oócito com uma membrana de baixa capacidade de alongamento que pode se romper espontaneamente durante o alongamento.

1. Execute a mesma ação que o oócito com membrana de alta capacidade de alongamento até o ponto de esticar a membrana citoplasmática.
2. Se a membrana for rompida espontaneamente durante a ação, injete a cabeça do espermatozoide a partir da posição da micropipeta sem empurrá-la mais para frente para evitar a degeneração dos oócitos após a injeção do esperma.
3. Depois que a cabeça do espermatozoide for certamente injetada no citoplasma, preste atenção para não adicionar líquido desnecessário.

Resultados

A ICSI convencional e a piezo-ICSI descritas acima foram realizadas em 10.488 oócitos maduros (1.744 ciclos) por 4 embriologistas. Destes, 3.522 oócitos (587 ciclos) foram inseminados por ICSI convencional entre janeiro de 2013 e setembro de 2016 e 6.966 oócitos (1.157 ciclos) foram inseminados por piezo-ICSI entre outubro de 2016 e dezembro de 2020 no Kameda Medical Center. A Tabela 1 mostra a idade média das mulheres, as taxas de fertilização, as taxas de sobrevivência, as taxas de degeneração, as taxas de blastocisto no dia 5 e o número médio de blastocistos criopreservados por ciclos de ICSI convencional e piezo-ICSI. Embora a idade média das mulheres da ICSI piezo-tenha sido maior em comparação com a da ICSI convencional, as taxas de fertilização, sobrevivência e blastocisto e o número médio de blastocistos criopreservados por ciclos de ICSI piezo-foram significativamente maiores em comparação com os da ICSI convencional (Tabela 2).

Figura 1: Prato ICSI usado para piezo-ICSI. O layout das microgotículas é descrito aqui. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Estudar	convencional-ICSI	piezo-ICSI
Yanagida et al. (1999)	66%a	79%b
Takeuchi et al. (2001)	83%a	90%b
Hiraoka et al. (2015)	68%a	89%b
Furuhashi et al. (2019)	64%a	75%b
Fujii et al. (2020)	71%a	84%b
ab<0.05 na mesma linha

Tabela 1: Comparação das taxas de fertilização entre ICSI convencional e piezo-ICSI. Em todos os relatos, taxas de fertilização significativamente maiores foram observadas na ICSI piezo-em comparação com as da ICSI convencional.

	convencional-ICSI	piezo-ICSI	P
Idade média das mulheres	38,6 ± 0,2	39,2 ± 0,2	<0,05
Não. de ciclos	587	1,157	-
Não. de oócitos	3,522	6,966	-
Não. de adubação (%)	2,352 (66.8)	5,411 (77.7)	<0,01
Não. de sobrevida (%)	3,303 (93.8)	6,767 (97.1)	<0,01
Não. de degeneração (%)	219 (6.2)	199 (2.9)	<0,01
Não. de blastocisto (%)	915 (38.9)	2,787 (51.5)	<0,01
Média não. de blastocistos criopreservados por ciclos	3,8 ± 0,2	5,1 ± 0,2	<0,01

Tabela 2: Resultados clínicos do Kameda Medical Center comparando a eficácia da ICSI convencional e da piezo-ICSI. Em todos os itens de comparação, foram observados resultados significativamente melhores no ICSI piezo-em comparação com os do ICSI-convencional.

Discussão

Os resultados demonstraram que as taxas de fertilização, as taxas de sobrevivência, as taxas de blastocisto no dia 5 e o número médio de blastocistos criopreservados da ICSI piezo-foram significativamente maiores em comparação com as da ICSI convencional.

Existem 2 etapas críticas no protocolo piezo-ICSI. O primeiro passo é torcer firmemente a tampa do suporte da pipeta. O segundo passo é manter o volume de PVP aspirado na micropipeta inferior a 300 micrômetros. Torcer frouxamente a tampa do suporte da micropipeta e aspirar PVP na micropipeta mais de 300 micrômetros (um comprimento total de espermatozóide é de cerca de 60 micrômetros) causa dificuldades na imobilização do esperma, abertura da zona e quebra da membrana devido à diminuição do poder piezoelétrico. Em particular, sempre temos que prestar atenção ao volume de PVP aspirado na micropipeta durante o procedimento. Esta é a limitação do piezo-ICSI.

É essencial colocar uma pequena quantidade de líquido pesado como líquido de operação dentro da micropipeta para criar a energia piezoelétrica. Nos relatos anteriores, o mercúrio foi utilizado como líquido de operação ^2,3,4. No entanto, um fluido à base de fluorocarbono pode ser usado em vez de mercúrio para uso seguro 5,6,7,8,9,11. O líquido à base de fluorocarbono tem uma gravidade específica de 1,8 e é incolor, transparente e não solúvel em água. O líquido de operação tem contato direto com o PVP que contém o esperma. A exposição do PVP ao líquido de operação pode ter alguns efeitos negativos no esperma ou oócito. No entanto, as taxas de fertilização, sobrevivência e blastocisto do dia 5 da ICSI piezo-foram significativamente maiores em comparação com as da ICSI convencional no presente estudo. Acreditamos que o risco do contato direto entre o líquido da operação e o PVP é bastante baixo.

Medimos previamente o tempo de preparo da micropipeta com um injetor de óleo e um injetor de ar. Os tempos médios de preparo da micropipeta do injetor de óleo e do injetor de ar foram de 233 e 106 segundos, respectivamente (P < 0,05)⁸. O tempo de preparação da micropipeta com o injetor de ar é menor porque é isento de óleo. A presença do óleo prolonga o tempo de preparação da micropipeta devido à sua viscosidade. Se bolhas de ar se misturarem na área de óleo dentro da micropipeta após inserir a micropipeta no porta-pipeta, a pipeta deve ser descartada porque o piezo-ICSI não funcionará. Também contamos o número de micropipetas desperdiçadas durante o preparo da micropipeta. O número médio de micropipetas desperdiçadas por paciente para o injetor de óleo e injetor de ar foi de 0,28 ± 0,56 e 0 ± 0 (P < 0,05), respectivamente⁸. No entanto, não houve diferença significativa entre os injetores de óleo e ar nas taxas de sobrevivência (99% e 99%), fertilização (89% e 90%) e embriões de dia 3 de boa qualidade (61% e 61%) após piezo-ICSI⁸. Desperdiçamos 3,2 horas extras e 25 micropipetas no grupo injetor de óleo (90 pacientes) em comparação com o grupo injetor de ar (90 pacientes) durante o estudo⁸. Os resultados indicam que o uso de um injetor de ar em vez de um injetor de óleo é uma boa modificação do piezo-ICSI.

O piezo-ICSI pode romper a membrana semi-automaticamente sem aspiração citoplasmática na micropipeta. Este procedimento de quebra de membrana é estável e fácil. A ICSI piezográfica poderia também contribuir para encurtar o período de formação em ICSI. Avaliamos previamente o efeito do piezo-ICSI nas taxas de sobrevivência, fertilização, blastocisto para um embriologista jovem. O jovem embriologista recebeu a prática piezo-ICSI 30 vezes antes de iniciar o tratamento clínico com ICSI. Comparamos as taxas de sobrevivência, fertilização e blastocisto de embriologistas jovens e seniores para seus primeiros 100 oócitos. As taxas de sobrevivência, fertilização e blastocisto dos embriologistas jovens e seniores foram de 100% e 97%, 87% e 91%, 47% e 57%, respectivamente⁹. Não houve diferença significativa entre os embriologistas jovens e seniores em todos os itens de comparação. Esses resultados indicaram que a ICSI piezo-tem importância no procedimento de quebra de membrana que pode contribuir para encurtar o período de treinamento da ICSI de um embriologista jovem.

Alguns investigadores relataram a eficiência clínica da injeção intracitoplasmática de espermatozóides morfologicamente selecionados (IMSI). Setti et al. compararam os desfechos clínicos entre ICSI e IMSI em um estudo de meta-análise¹⁰. Não houve diferença significativa nas taxas de fertilização entre os grupos ICSI e IMSI¹⁰. No entanto, a taxa de embriões de alta qualidade do grupo IMSI foi significativamente maior em comparação com a do grupo ICSI¹⁰. Até onde sabemos, nenhum estudo examinou o impacto do IMSI combinado com piezo-ICSI na fertilização e no desenvolvimento embrionário. Investigamos retrospectivamente os efeitos da ampliação da seleção de espermatozoides (400x vs. 1.200x) na fertilização e no desenvolvimento embrionário em piezo-ICSI. A taxa de fertilização do grupo 1.200x (92%) foi significativamente maior em comparação com a do grupo 400x (77%) (P = 0,0002)¹¹. A taxa de embriões de boa qualidade no dia 3 do grupo de 1.200x (64%) foi significativamente maior em comparação com a do grupo de 400x (46%) (P = 0,0021)¹¹. Tentamos selecionar o esperma sem vacúolos na cabeça do esperma com aumento de 1.200x. Este procedimento pode selecionar o esperma com um menor grau de fragmentação do DNA do esperma¹². Portanto, o IMSI pode ser uma nova aplicação do piezo-ICSI.

Aqui, descrevemos um protocolo para piezo-ICSI que pode melhorar os resultados da ICSI sem perder oócitos viáveis na TARV humana.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Injetor de ar	NARISHIGE CORPORATION	IM-12
Unidade de acionamento piezo	PRIME TECH Ltd.	PMM4GD
Micropipeta	PRIME TECH Ltd.	PINU06-20FT
Operação líquida	3M 3M	™ Noveck™
PVP 7% Solução pronta para uso	Cooper Surgical Inc.	ART-4005-A
Vitrolife	G-MOPS PLUS		médio tamponado
	NIPRO	87-453
Microscópio invertido	OLYMPUS CORPORATION	IX-73