Artigo de método

Visualizando morfologia Astrocitante usando Lúcifer iontoforese amarela

DOI:

10.3791/60225

⸱

14 de setembro de 2019

 ,  ,  , 
1Department of Physiology, David Geffen School of Medicine, University of California Los Angeles, 2Department of Neurobiology, David Geffen School of Medicine, University of California Los Angeles

Neste artigo

Resumo

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Os astrócitos são células morfologicamente complexas, exemplificadas por seus múltiplos processos e territórios Bushy. Para analisar sua morfologia elaborada, apresentamos um protocolo confiável para a realização de iontoforese intracelular de Lúcifer amarelo em tecido levemente fixo.

Resumo

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Os astrócitos são componentes essenciais dos circuitos neurais. Eles telha todo o sistema nervoso central (CNS) e estão envolvidos em uma variedade de funções, que incluem o afastamento do neurotransmissor, regulação de íons, modulação sináptica, suporte metabólico para neurônios, e regulação do fluxo sanguíneo. Os astrócitos são células complexas que têm um soma, vários ramos principais, e inúmeros processos finos que contatam diversos elementos celulares dentro do neuropil. A fim de avaliar a morfologia dos astrócitos, é necessário ter um método confiável e reprodutível para visualizar sua estrutura. Nós relatamos um protocolo de confiança para executar o iontoforese intracelular dos astrócitos usando a tintura fluorescente do amarelo de Lúcifer (ly) no tecido levemente fixo do cérebro dos ratos adultos. Este método tem diversas características que são úteis caracterizar a morfologia do astrocyte. Permite a reconstrução tridimensional de astrócitos individuais, o que é útil para realizar análises morfológicas em diferentes aspectos de sua estrutura. Immunohistochemistry junto com o iontoforese de ly pode igualmente ser utilizado para compreender a interação dos astrócitos com componentes diferentes do sistema nervoso e para avaliar a expressão das proteínas dentro dos astrócitos etiquetados. Este protocolo pode ser executado em uma variedade de modelos do rato de desordens do CNS para examinar rigorosa a morfologia do astrocyte com microscopia de luz. A iontoforese de LY fornece uma aproximação experimental para avaliar a estrutura do astrocyte, especial no contexto da lesão ou da doença onde estas pilhas são propor para submeter-se a mudanças morfológicas significativas.

Introdução

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Os astrócitos são as células gliais mais abundantes no sistema nervoso central (SNC). Jogam papéis na homeostase do íon, na regulação do fluxo sanguíneo, na formação do sinapse assim como na eliminação, e na captação1do neurotransmissor. A vasta gama de funções do astrocyte é refletida em sua estrutura morfológica complexa2,3. Os astrócitos contêm vários ramos primários e secundários que se dividem em milhares de branchlets e folhetos mais finos que interagem diretamente com sinapses, dendritos, axônios, vasos sanguíneos e outras células gliais. A morfologia do astrocyte varia em difere....

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Protocolo

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Os experimentos com animais neste estudo foram realizados de acordo com o guia do Instituto Nacional de saúde para o cuidado e uso de animais de laboratório e foram aprovados pelo Comitê de pesquisa animal do Chanceler da Universidade da Califórnia, Los Angeles. Camundongos adultos (6 − 8 semanas de idade) de gênero misto foram utilizados em todos os experimentos.

1. preparação da solução

  1. Solução de fluido cefalorraquidiano artificial (ACSF)
    1. Prepare uma solução ACSF fresca (135 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl2, 14,7 mm NaHCO3, 11 mm D-glucose, 1,25 mm na2HPO4e 2 ....

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Resultados

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Os dados relatados neste estudo são de 7 − 12 células de 4 camundongos em cada experimento. Os dados médios são relatados nos painéis de figura, quando apropriado.

Para avaliar a morfologia do astrocite, realizou-se iontoforese intracelular com corante LY para preenchimento de astrócitos no estrato de CA1 radiatum, que está resumido na Figura 1. A Figura 2 retrata um astrocite representativo e sua elaborada estrutura morfológica. A célula foi imag.......

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Discussão

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O método esboçado neste papel descreve uma maneira de visualizar a morfologia do astrocyte usando o iontoforese intracelular do corante de ly em fatias levemente fixas do cérebro. Existem vários fatores críticos destacados neste protocolo que contribuem para a bem sucedida iontoforese e reconstrução morfológica das células. Um fator é a qualidade e reprodutibilidade das imagens, que é determinada em grande parte pela idade do rato e o resultado da perfusão. Neste estudo, foram utilizados camundongos C57/BL6N de 6 a 8 sem.......

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Divulgações

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Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

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Os autores agradecem a Sra. Soto, o Dr. Yu, e o Dr. Octeau por orientação, bem como comentários sobre o texto. Este trabalho é apoiado por NS060677.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Fosfato de formalina tamponada a 10%FisherSF 100-20Uma alternativa idêntica pode ser usada
Filtros de seringa Acrodisc com Supor MembranePall4692Uma alternativa idêntica pode ser usada
Pellet de solo Ag/AgClWPIEP2Uma alternativa semelhante pode ser usada
Alexa Fluor 546 cabra anti-frango IgG (H+L)Thermo ScientificA-11040Uma alternativa semelhante pode ser usada
Alexa Fluor 647 cabra anti-coelho IgG (H+L)Thermo ScientificA27040Uma alternativa semelhante pode ser usada
Anticorpo Anti Aquaporina-4Novus BiologicalsNBP1-87679Uma alternativa semelhante pode ser usada
Anticorpo Anti GFAPAbcamab4674Uma alternativa semelhante pode ser usada
Pipetas de vidro borossilicato com filamentoInstrumentos de precisão mundial1B150F-4
C57BL / 6NTac camundongosTaconic StockB6Uma alternativa semelhante pode ser usada
Cloreto de cálcioSigma21108Uma alternativa idêntica pode ser usada
Microscópio confocal de varredura a laserOlympusFV1000MPEUma alternativa semelhante pode ser usada
D-glicoseSigmaG7528Um idêntico alternativa pode ser usada
Fosfato DissódicoSigma255793Uma alternativa idêntica pode ser usada
Extrator de eletrodo - Modelo P-97SutterP-97Uma alternativa semelhante pode ser usada
Fluoromount-GSouthern Biotech0100-01Uma alternativa idêntica pode ser usada
Injeção de heparina sódica (1.000 USP por mL)Sagent Pharmaceuticals400-10Uma alternativa idêntica pode ser usada
Software Imaris (Versão 7.6.5)Bitplane Inc.Uma alternativa semelhante pode ser usada
IsofluoranoHenry Schein Saúde Animal29404Uma alternativa idêntica pode ser usada
Cloridrato de lidocaína injetável (2%)Clipper1050035Uma alternativa idêntica pode ser usada
Lúcifer Amarelo CH sal de dilítioSigmaL0259
Lúcifer Amarelo CH sal dipotássicoSigmaL0144
Cloreto de magnésioSigmaM8266Uma alternativa idêntica pode ser usada
Vidro de cobertura do microscópioThermo Scientific24X60-1Uma alternativa idêntica pode ser usada
Lâminas de microscópioFisher12-544-2Uma alternativa idêntica pode ser usada
Laboratório de vetor de soro de cabra normalS-1000Uma alternativa idêntica pode ser usada
Lente objetiva (40x)OlympusLUMPLFLN 40XWUma alternativa semelhante pode ser usada
Lente objetiva (60x)OlympusPlanAPO 60XUma alternativa semelhante pode ser usada
PBS comprimidos, 100 mLVWRVWRVE404Uma alternativa idêntica pode ser usada
Micromanipulador de pipeta - Modelo ROE-200SutterMP-285 / ROE-200 / MPC-200Uma alternativa semelhante pode ser usado
Cloreto de PotássioSigmaP3911Uma alternativa idêntica pode ser usada
Bicarbonato de SódioSigmaS5761Uma alternativa idêntica pode ser usada
Cloreto de SódioSigmaS5886Uma alternativa idêntica pode ser usada
Estimulador- Modelo Omnical 2010Instrumentos de precisão mundiaisOmnical 2010Uma alternativa semelhante pode ser usada
Triton X 100SigmaT8787Uma alternativa idêntica pode ser usada
Vibratome- Modelo #3000Pelco100-SUma alternativa semelhante pode ser usada

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Khakh, B. S., Sofroniew, M. V. Diversity of astrocyte functions and phenotypes in neural circuits. Nature Neuroscience. 18 (7), 942-952 (2015).
  2. Ben Haim, L., Rowitch, D. H. Functional diversity of astrocytes in neural circuit regulation. Nature Reviews Neuro....

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