Aqui nós descrevemos um método vivo-imagem latente in vitro para visualizar o transporte intracelular das organelas e o tráfico de proteínas da membrana de plasma em astrocytes murino. Este protocolo também apresenta uma metodologia de análise de imagem para determinar itinerários de transporte de carga e cinética.
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Artigo de método
Visualizando e analisando o transporte intracelular de organelas e outras cargas em astrócitos
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
Os astrocytes estão entre os tipos os mais abundantes da pilha no cérebro adulto, onde jogam papéis chaves em um multiplicidade das funções. Como um jogador central na homeostase cerebral, os astrócitos fornecem neurônios com metabólitos vitais e água tampão extracelular, íons e glutamato. Um componente integrante da sinapse "Tri-partite", os astrócitos também são críticos na formação, poda, manutenção e modulação das sinácias. Para habilitar essas funções altamente interativas, os astrócitos se comunicam entre si e com outras células gliais, neurônios, vasculatura cerebral e o ambiente extracelular através de uma infinidade de proteínas de membrana especializadas que incluem células moléculas de adesão, aquaporinas, canais iônicos, transportadores de neurotransmissores e moléculas de junção de Gap. Para apoiar este fluxo dinâmico, astrocytes, como neurônios, dependem de transporte intracelular firmemente coordenado e eficiente. Ao contrário dos neurônios, onde o tráfico intracelular tem sido extensivamente delineado, o transporte baseado em microtúcitos em astrócitos tem sido menos estudado. No entanto, o tráfico EXO-e endocítico de proteínas da membrana celular e o transporte intracelular de organela orquestram a biologia normal dos astrócitos, e esses processos são freqüentemente afetados na doença ou em resposta a lesões. Aqui nós apresentamos um protocolo direto aos astrocytes murino da alta qualidade da cultura, às proteínas astrocytic da etiqueta cDNAs e aos organelas do interesse, e para gravar sua dinâmica intracelular do transporte usando a microscopia confocal do tempo-lapso. Também demonstramos como extrair e quantificar os parâmetros de transporte relevantes dos filmes adquiridos usando o software de análise de imagem disponível (ou seja, ImageJ/FIJI) plugins.
Introdução
Os astrocytes são as pilhas as mais abundantes no sistema nervoso central adulto, onde executam funções desenvolventes e homeostático originais1. Os astrócitos modulam o desenvolvimento sináptico através do contato direto com terminais pré e pós-sinápticos como parte da sinapse Tri-partite, que contém receptores de neurotransmissores, transportadores e moléculas de adesão celular que facilitam a formação de sinapse e comunicação do Neuron-astrocyte2. Além disso, os astrócitos controlam ativamente a transmissão sináptica e impedem a excitotoxicidade neuronal removendo rapidamente neurotransmissores excitatórios da fenda s....
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Protocolo
Todos os procedimentos animais foram realizados com a aprovação da Universidade da Carolina do Norte em Chapel Hill, cuidado animal e Comitê de uso (IACUC).
1. dissecção cerebral e cultura de astrócitos primários de camundongo
Nota: o seguinte protocolo foi adaptado a partir de métodos publicados, que segue o procedimento original desenvolvido por McCarthy e devellis13,14,15. Culturas de células mistas de astrócitos de McCarthy/devellis (MD) são preparadas a partir do dia pós-Natal 2 − 4 (P2 − P4) córtices de camundongo, t....
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Resultados
O protocolo para o estabelecimento de astrócitos primários de MD do mouse descritos acima deve produzir culturas reprodutíveis e de alta qualidade. Embora as culturas contenham inicialmente uma mistura de astrócitos, fibroblastos e outras células gliais, incluindo microglia e oligodendrócitos (Figura 1bi, Biv; pontas de seta vermelhas), a adição de arac à cultura mista entre DIV5-DIV7 minimiza proliferação dessas células contaminantes. O tratamento combinado com AraC e a est.......
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Discussão
Aqui, descrevemos uma abordagem experimental para expressar, Visualizar e rastrear organelas fluorescentamente marcadas e proteínas de membrana de interesse usando a microscopia de vídeo de lapso de tempo em astrocytes de MD cortical do mouse primário de alta pureza. Também Delineamos uma metodologia para medir a dinâmica das partículas. A visualização direta da dinâmica protéica e organela nos astrócitos primários fornece uma poderosa ferramenta para estudar a regulação do transporte intracelular nessas células in vitro.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
DNL foi apoiado pela Universidade da Carolina do Norte na Chapel Hill (UNC) escola de medicina como um estudioso Simmons. O TWR foi apoiado pelo UNC PREP Grant R25 GM089569. Trabalho usando o centro de neurociência UNC microscopia núcleo Facility foi apoiado, em parte, pelo financiamento do NIH-NINDS Neuroscience Center support Grant p30 NS045892 e o NIH-NICHD intelectual e desenvolvimento apoio centro de pesquisa subsídio U54 HD079124.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 2,5% Tripsina (10x) | Gibco | 15090-046 | |
| Centrífuga de Bancada | Thermo Scientific | 75-203-637 | Sorvall ST8 Centrífuga |
| Grau de Cultura de Células Water | Gen Clone | 25-511 | |
| Microscópio de Cultura de Células | Zeiss | WSN-AXIOVERT A1 | Vert.A1 escopo invertido, microscópio de cultura de tecidos invertido com recursos |
| fluorescentesCitosina Arabinoside | Sigma | C1768-100MG | (AraC) Dissolva o pó liofilizado em água estéril de grau de cultura de células para fazer um estoque de 10mM, alíquota e congele para armazenamento a longo prazo |
| DAPI | Sigma | D9542-5MG | Dissolva o pó liofilizado em água deionizada a uma concentração máxima de 20 mg / ml, aqueça ou sonice conforme necessário. Use a 300 nM para contracoloração. |
| Microscópio de dissecação | Zeiss | Stemi 305 | |
| Tesoura de dissecação | F.S.T | 14558-09 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gen Clone | 25-500 | |
| Fetal Bovine Serum | Gemini | 100-106 | FIJI inativado por calor |
| (Fiji é apenas a imagem J) | NIH | Versão 1.52i | |
| Pinças de ponta fina | F.S.T | 11254-20 | Estilo #5 |
| Fonte de luz de fluorescência | Excelitas | 012-63000 | X-Cite 120Q |
| GFAP anticorpo | Sinalização celular | 3670S | GFAP (GA5) anticorpo monoclonal de camundongo |
| Pratos com fundo de vidro | Mattek corporation | P35G-1.5-14-C | Prato de 35 mm | Nº 1.5 Lamínula | Diâmetro do vidro de 14 mm | |
| Pinça Graefe | F.S.T | 11054-10 | Pinça Graefe Iris com pontas curvas |
| Corante verde fluorescente que mancha compartimentos ácidos (endossomos tardios e lisossomos) | Life Technologies | L7526 | LysoTracker Verde DND 26. Pré-dissolvido em DMSOS para uma solução estoque de 1mM. Diluir até à concentração de trabalho final no meio de cultura ou tampão da sua escolha. |
| Solução de Sal Balanceada Hank's (10x) | Gibco | 14065-056 | Livre de Magnésio e Cálcio |
| Life Technologies | A14291DJ | Solução de Imagem de Células | |
| Vivas Microscópio Confocal Invertido | Zeiss | LSM 780 | |
| KymoToolBox | https://github.com/fabricecordelieres/IJ_KymoToolBox | ||
| Reagente Potenciador de Lipofecção | Life Technologies | 11514015 | Plus Reagente |
| Lipofecção Reagente | Life Technologies | 15338100 | Lipofectamine LTX reagente |
| Incubadora de agitação orbital | New Brunswick Scientific | 8261-30-1008 | Innova 4230 , incubadora de agitação orbital com controle de temperatura e velocidade |
| Solução de penicilina/estrepomicina (100x) | Gen Clone | 25-512 | |
| Solução salina tamponada com fosfato (10x) | Gen Clone | 25-507x | |
| Bromidrato de poli-D-lisina | Sigma | P7405 | Dissolver em tampão Tris, pH 8,5, a 1mg / mL. Congele para armazenamento a longo prazo. Evite ciclos de congelamento e descongelamento |
| Meio de soro reduzido | Gibco | 31985-062 | OPTI-MEM |
| Frascos de cultura de tecidos | Olympus Plastics | 25-209 | 75 cm^2. 100% de acesso ao pescoço angulado, tampa de filtro ventilada hidrofóbica de 0,22um |
| Incubadora de cultura de tecidos | Thermo Scientific | 51030285 | HERAcell VIOS 160i, incubadora de cultura de tecidos com controle de |
| temperatura, umidade e CO2Tris-Base | Sigma | T1503 | 8,402 g dissolvido a um litro em água com 4,829 g Tris HCl para fazer 0,1 M Tampão Tris, pH 8,5 |
| Tris-HCl | Sigma | T3253 | 4,829 g dissolvido em um litro em água com 8,402 g Tris Base para fazer 0,1 M Tampão Tris, pH 8,5 |
| Tripsina-EDTA (0,25%), fenol vermelho | Gibco | 25200072 | |
| Sistemas de Filtro a Vácuo | Olympus Plastics | 25-227 | 500 ml, membrana PES, 0,22 µ m |
| Tesoura Vannas reta | Roboz | RS-5620 |
Referências
- Barres, B. A. The mystery and magic of glia: a perspective on their roles in health and disease. Neuron. 60 (3), 430-440 (2008).
- Araque, A., Parpura, V., Sanzgiri, R. P., Haydon, P. G. Tripartite synapses: Glia, the unacknowledged partner. Trends in Neurosciences<....
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Reimpressões e permissões
