Perfil de expressão gênica específica do tipo de célula no fígado do mouse

Amber  W. Wang; Adam  M. Zahm; Kirk  J. Wangensteen

doi:10.3791/60242

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Artigo de método

Perfil de expressão gênica específica do tipo de célula no fígado do mouse

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DOI:

10.3791/60242

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17 de setembro de 2019

Amber W. Wang¹ , Adam M. Zahm¹ , Kirk J. Wangensteen¹^,²

¹Department of Genetics, University of Pennsylvania, ²Department of Medicine, University of Pennsylvania

Neste artigo

Resumo

Traduzir a purificação da afinidade do Ribossoma (armadilha) permite a isolação rápida e eficiente do tipo de pilha-específico que traduz o mRNA. Aqui, Nós demonstramos um método que combine a injeção hidrodinâmico da cauda-veia em um modelo do rato do repovoamento do fígado e da armadilha para examinar o perfil da expressão de repovoamento hepatocytes.

Resumo

O repovoamento do fígado após ferimento é uma característica crucial dos mamíferos que impede a falha imediata do órgão e a morte após a exposição de toxinas ambientais. Uma compreensão mais profunda das mudanças na expressão gênica que ocorrem durante a repovoação poderia ajudar a identificar alvos terapêuticos para promover a restauração da função hepática no cenário de lesões. No entanto, os métodos para isolar especificamente os hepatócitos repovoadores são inibidos pela falta de marcadores celulares, números de células limitados e a fragilidade dessas células. O desenvolvimento de traduzir a tecnologia Ribossoma da purificação da afinidade (armadilha) conjuntamente com o modelo de Fah^-/- mouse para recapitular o repovoamento no ajuste de ferimento de fígado permite o perfilamento da expressão de gene do repovoamento Hepatócitos. Com TRAP, o tipo de célula-específico traduzindo mRNA é rapidamente e eficientemente isolado. Nós desenvolvemos um método que utilize a armadilha com isolação afinidade-baseada de traduzir o mRNA dos hepatócitos que expressam seletivamente a proteína fluorescente verde (GFP)-etiquetaram a proteína ribosomal (RP), GFP: RPL10A. A armadilha contorna o período de tempo longo exigido para a classificação fluorescência-ativada da pilha que poderia mudar o perfil da expressão de Gene. Além disso, desde que somente os hepatócitos repovoamento expressam a proteína de fusão de GFP: RPL10A, o mRNA isolado é desprovido da contaminação dos hepatócitos feridos circunvizinhos e dos outros tipos da pilha no fígado. O mRNA afinidade-purified é da alta qualidade e permite a jusante PCR-ou a análise sequenciando-baseada high-throughput da expressão de Gene.

Introdução

Como o principal órgão metabólico em vertebrados, o fígado é responsável pela homeostase da glicose, síntese de proteínas séricas, secreção de ácido biliar e metabolismo xenobiótico e desintoxicação. O fígado possui uma extraordinária capacidade de regenerar o parênquima lesionado após a exposição a toxinas para prevenir a insuficiência hepática imediata¹. Entretanto, a falha da regeneração pode ocorrer no ajuste do overconsumption do paracetamol ou do álcool, que pode conduzir à falha de fígado aguda². Além disso, a lesão hepática crônica causada por infecção por hepatite viral, doença hepática gordurosa e esteatohepati....