Quantificação da auto-renovação em Culturas Murine Mammosphere

O isolamento e a cultura in vitro das células-tronco e progenitoras epiteliais mamárias tornaram-se essenciais para a compreensão de suas propriedades na biologia celular mamária. O rastreamento de linhagem elegante e os ensaios de transplante em série permitiram o estudo de células-tronco (SCs) e outros subconjuntos de tecidos no contexto de seu nicho in vivo. No entanto, essa abordagem é demorada e requer a geração de modelos de mouse repórter^1,2,3,4,5. Portanto, a cultura in vitro e a propagação de células-tronco mamárias (MaSCs), poupando características fundamentais de caule, ou seja, capacidade de auto-renovação e diferenciação, é um dos maiores desafios no campo. Nos últimos anos, o ensaio mammosphere tem sido amplamente utilizado para modelar tanto o tecido mamato normal e o crescimento do câncer de mama, para quantificar SCs normais ou câncer (CSCs) e avaliar a sua capacidade de auto-renovação como um repórter substituto de sua atividade em seu respectivo contexto in vivo^{6,7,8,9,10,11}.

O ensaio mammosphere é uma abordagem eficiente e rentável, na qual as células epiteliais mamárias recém-isoladas (MECs) são cultivadas em condições não aderentes, com a premissa de que apenas os MaSCs sobreviverão e formarão esferas em suspensão, enquanto todos os outros tipos de células morrerão por anoikis. Além disso, a capacidade de formar várias gerações de mamoesferas em passagens não aderentes em série está relacionada à capacidade de auto-renovação dos MaSCs^6,9,11. Aqui, descrevemos um protocolo detalhado de um ensaio quantitativo mammosphere, que foi inicialmente desenvolvido por Dontu e colegas⁷ como uma modificação do ensaio pioneiro neurosfera¹², permitindo o crescimento de SCs putativos em condições não-aderentes, livre de soro com a adição de fatores de crescimento adequados^7,12.

Os procedimentos in vivo foram realizados de acordo com a diretiva da UE 2010/63 e após a aprovação do nosso comité de ética institucional (Organismo para o Bem-Estar Animal --OPBA) e do Ministério da Saúde italiano (IACUC Numbers 762/2015 e 537/2017).

1. Murine Mammary Gland Collection e Digestão

1. Para um experimento típico, sacrifique 8-10 semanas de idade ratos fêmeas virgens por inalação de CO_2. Dependendo dos objetivos do experimento, use 5-30 camundongos. Coloque os ratos em placas de dissecação um capô. Use agulhas para esticar os membros dianteiros e lavar a pele do animal com etanol.
2. Levante a pele com fórceps e realize uma incisão vertical a partir do nível da área pélvica e movendo-se até o colo do útero, deixando o peritônio intacto. Para evitar romper a pele ou o peritônio, use uma tesoura de borda redonda.
3. Cuidadosamente separar a pele do corpo com movimentos suaves da tesoura através do eixo lateral do corpo.
4. Uma vez que a pele é totalmente separada da área torácica e abdominal, realizar quatro incisões em todos os quatro membros do animal e fixar a pele com agulhas. Use a tesoura e fórceps para separar totalmente o corpo do animal da pele estendida.
5. Use os fórceps para levantar suavemente as almofadas de gordura mamárias que agora estão totalmente expostas e cuidadosamente desafiá-los da pele com a ajuda da tesoura. Colete as glândulas mamárias torácicas e abdominais inferiores de cada rato e mergulhe-as na sostena tamponada de fosfato de Dulbecco (DPBS), em um tubo cônico de 50 mL. Recolher até 20 glândulas por tubo. Mantenha os tecidos no gelo.
   Nota: Se necessário, as glândulas podem permanecer no gelo durante a noite. Este é um ponto de parada seguro. As seguintes etapas devem ser executadas circunstâncias estéreis.
6. Prepare e filtre o meio de digestão: o meio modificado da Águia (DMEM) de Dulbecco complementado com glutamina de 2 mM, 100 penicilina U/mL, 100 μg/mL estreptomicina, 200 u/ml colagem e 100 μg/mL hyaluronidase (ver Tabela de Materiais).
7. Transfira até 20 glândulas para uma placa de Petri de 100 mm e pique o tecido usando um bisturi ou tesoura curva. Evite transferir grandes volumes de DPBS para o prato.
8. Adicione 10 mL de digestão média para cada placa de Petri e transferir o tecido picado para um tubo cônico de 50 mL, usando uma pipeta sorológica de 25 mL.
9. Selar os tubos com parafilme e colocá-los em um rotador. Defina o rotador a uma velocidade baixa (0,03 x g)e incubar por 2,5 h a 37 °C em uma atmosfera úmida contendo 5% de CO₂.
10. Inspecione visualmente a suspensão antes de prosseguir para os próximos passos. Se grandes pedaços de tecido permanecerem não digeridos, prolongue a incubação a 37 °C por mais 30 min.
    Nota: Como alternativa, a digestão pode ser realizada durante a noite a 37 °C, 5% CO₂, usando uma mistura de enzimas colanase/hialuronidase suave^13.

2. Isolamento de MECs primários de murine

1. Pare o rotador e retire os tubos da incubadora. Ajuste uma ponta P1000 na abertura de uma pipeta serológica de 5 mL. Se a suspensão passar pela ponta P1000, prossiga para os próximos passos. Caso contrário, prolongue a incubação a 37 °C por mais 30 min.
2. Centrífuga a 100 x g,por 5 min a 4 °C. Decantar cuidadosamente o supernatant e resuspender a pelota de cada tubo em 3 mL de DPBS.
   Nota: A baixa velocidade de centrífuga permite a remoção de linfócitos e células de tecido adiposo. A manipulação suave é necessária para evitar desalojar a pelota nesta etapa.
3. Filtrar a suspensão celular em cada tubo separadamente, usando 100, 70 e 40 filtros de células μm. Em cada etapa de filtragem, lave os filtros com 2 mL de DPBS antes de coletar a passagem.
   Nota: A partir deste ponto, as suspensões celulares podem ser agrupadas e processadas juntas.
4. Centrífuga a 300 x g,por 5 min a 4 °C. Decantar cuidadosamente o supernatant e resuspender as células no volume restante de DPBS.
5. Vá para o glóbulo vermelho (RBC) lyse adicionando um volume igual de amônio-cloreto-potássio (ACK) lysis buffer (ver Tabela de Materiais). Misture por pipetting e incubar no gelo por até 5 min.
6. Adicione 10 mL de DPBS e centrífuga a 300 x g,por 5 min a 4 °C. Decantar cuidadosamente o supernatant e inspecionar visualmente a pelota. Se a pelota é branca, prossiga para o próximo passo. Caso contrário, repita o passo de lyse RBC (passo 2,5).
7. Resuspenda a pelota celular em 1-5 mL de mídia mamosphere: mamária células epitelia média basal (MEBM), complementada com glutamina 2 mM, 100 U/mL penicilina, 100 μg/mL streptomicina, 5 μg/mL insulina, 0,5 μg/mL hidrocortisona, 2% B27, 20 ng/mL epidérmica fator de crescimento (EGF), 20 ng/mL fator básico de crescimento do fibroblasto (bFGF) e 0,4 IU/mL heparin (ver tabela de materiais).

3. Serial Mammosphere Re-revestimento

1. Para o estabelecimento de culturas mamosphere, placa as células em cultura não-tecidotratados (adesão ultra-baixa) 6-bem placas em uma densidade de 200.000 células viáveis / mL em mamosphere médio. Incubar as células por 7-10 dias a 37 °C, 5% CO₂.
2. Prepare e filtre a solução poli-HEMA de 1% em 95% de etanol (ver Tabela de Materiais). Casaco ultra-baixa adesão de 6 pratos de poço para as seguintes passagens, adicionando 400 μL de 1% de solução poli-HEMA por poço e permitindo que o etanol seque completamente. Para melhores resultados, repita o revestimento duas vezes.
   Nota: O uso de placas não revestidas durante a primeira passagem permite a remoção seletiva de fibroblastos da cultura.
3. No final da cultura de 7 a 10 dias, recolher as mamoesferas primárias de todos os poços e centrífugas em 300 x g, por 5 min a 4 °C.
4. Decantar cuidadosamente o supernatant e proceder à dissociação mecânica das mamoesferas usando uma pipeta P200 com dicas filtradas. Pipeta por aproximadamente 100 vezes e inspecionar visualmente a suspensão para a presença de grandes esferóides.
   Nota: Uma incubação curta (2-5 min) da pelota da esfera em um volume baixo (0.2-0.5 mL) do trypsin ou do Accutase em 37 °C, 5% CO_2,pode ser usada para facilitar a dissociação mecânica. Prepare mammosphere médio fresco (passo 2.7) para o revestimento de cada passagem.
5. Resuspenda em 1-5 mL de mammosphere fresco médio e contar as células viáveis. Se aplicável, divida as células em grupos de tratamento ou condições de cultura.
6. Placa 20.000 células viáveis/mL em placas de adesão ultra-baixa revestidas de poli-HEMA de 6 poços e incubada a 37 °C, 5% CO₂.
   Nota: Mammospheres atingir seu tamanho máximo dentro de 5-7 dias após o revestimento celular. Quando possível, distribua as células de cada amostra ou condição para vários poços para obter réplicas técnicas. A densidade de revestimento deve ser mantida baixa para evitar a agregação celular. Um máximo de 20.000 células/mL é recomendado para placas de 6 poços e 5.000 células/mL para placas de 24 poços.
7. Após 5-7 dias, conte o número de esferas por poço. Isso pode ser feito manualmente, usando um microscópio equipado com uma lente de ampliação 10x ou usando análise de imagem digital (ver passo 4).
8. Recolher as mamoesferas de cada poço separadamente e centrífuga em 300 x g, por 5 min em 4 °C.
9. Decantar cuidadosamente o supernatant e proceder à dissociação mecânica das mamoesferas usando uma pipeta P200 com dicas filtradas. Pipeta por aproximadamente 100 vezes e inspecionar visualmente a suspensão para a presença de grandes esferóides.
10. Resuspenda em 1 mL de mammosphere fresco médio e conte as células viáveis. Piscina as células de cada amostra ou condição e repita etapas 3.6-3.10. Registre o número de células banhadas e o número de esferas e células contadas por poço para cada passagem. Proceder à etapa 5 para o cálculo de crescimento cumulativo.

4. Enumeração da esfera usando a análise digital da imagem (DIA)

1. No final de cada passagem, escaneie toda a superfície de todos os poços e adquira imagens das esferas usando uma câmera digital montada em um estereoscópio. Salve as imagens como arquivos .tif.
2. Importe as imagens de estereoscópio como uma sequência de imagem usando o ImageJ^14. Defina a escala e o tipo de imagem para 8 bits.
3. Duplice a pilha de imagens e selecione Subtrair Background do processo de guia na barra do menu. Verifique as opções Fundo claro e deslizamento parabolide e clique no botão OK. Processe todas as imagens da pilha.
4. Selecione ajustar e, em seguida, limite da imagem da guia da barra do menu. Ao clicar em Aplicar,uma janela de diálogo intitulada Converter Stack to Binary aparecerá. Selecione padrão como método e luz como pano de fundo. Verifique o limite de cálculo da caixa para cada imagem e clique no botão OK.
5. Selecione sequencialmente os comandos Watershed, Abra e Corrmoa da lista Binária o processo de guia da barra de menu. Processe todas as imagens da pilha clicando no botão Sim da caixa de diálogo que aparece.
   Nota: Esses processos permitem a segmentação visual de objetos que tocam, suavizam objetos e remoção de pixels da borda dos objetos.
6. Selecione a função Analisar partículas do menu Analise. Defina o limite de tamanho mínimo em 10.000 μm² e circularidade entre 0,50 e 1,00. Selecione a opção Elipses do menu drop-down show. Verifique Resumo, Excluir nas bordas e In situ Show e clique no botão OK. Processe todas as imagens da pilha.
7. Inspecione visualmente a correspondência das elipses com esferas e, se necessário, corrija a contagem de partículas em conformidade. Resuma as contagens de todos os quadros de cada poço para obter a contagem total de mamoesferas por poço.

5. Cálculo da Curva de Crescimento Cumulativo

Nota: O número de mamoesferas contadas em cada poço no final de cada passagem (P_N)reflete o número de células iniciando a mamoesfera semeadas no início do P_N.

1. Para cada passagem (P_N),registre o número de células banhadas e o número de células e esferas contadas por poço. Calcule o tamanho da esfera no final de cada passagem:
   tamanho da esfera P_N (células / esfera) = células contadas P_N / esferas contadas P_N
   Nota: O tamanho da esfera em P_N é uma medida do potencial proliferativo de cada célula iniciando mamosphere semeada em P_N.
2. Inferir o número de esferas banhadas dividindo o número de células banhadas para P_N pelo tamanho da esfera calculado no final da passagem anterior (P_N-1):
   esferas banhadas P_N = células banhadas P_N / esfera tamanho P_N-1
   Nota: Por convenção, o tamanho da esfera é assumido estável durante a primeira passagem da cultura (ou seja, esfera tamanho P₀ = esfera tamanho P_1). Se vários poços forem usados como réplicas técnicas, use o tamanho médio da esfera no P_N-1 como denominador.
3. Calcule o número cumulativo de células e esferas para cada poço por passagem:
   número acumulado P_N = (contagem P_N / banhado P_N)X número cumulativo_P-1.
   Nota: Por convenção, número cumulativo P₀ = P₁banhado. Se vários poços forem usados como réplicas técnicas, calcule o número cumulativo médio por amostra ou condição para cada passagem.
4. Trace os pontos de dados em uma escala semilogarítica. Exibir o número de passagem (P₀ a P_N)no eixo x (escala linear) e o número cumulativo de células ou esferas no eixo y (escala logarítica).
5. Ajuste uma tendência exponencial-linha aos pontos de dados e calcule o coeficiente da determinação (R²⁾para medir o goodness do ajuste.
   Nota: A linha de tendência instalada nos pontos de dados deve aproximar-se de uma curva exponencial, como esperado para uma população celular que cresce ou morre com uma taxa constante. R² leva valores entre 0 e 1, com valores mais próximos de 1 indicando um melhor ajuste.
6. Retratam a equação da linha de tendência como uma função exponencial natural para inferir a taxa de crescimento (GR) da cultura:
   y = y₀ e^{(GR) x}, onde y₀ é o valor de y quando x = 0.

Myc superexpressão em MECs normais, leva a um aumento da freqüência de células iniciando mamoesferas. Isto é conseguido através de um mecanismo duplo: Myc aumenta a taxa de divisões simétricas MaSC e a freqüência de reprogramação de progenitores em novos MaSCs11. Para testar o efeito da baixa expressão constitutiva de Myc, usamos o modelo de camundongo transgênico Rosa26-MycER, no qual a atividade myc pode ser induzida por 4-hidroxitamoxifen (4-OHT)15. Primeiro chapeado os MECs em placas de adesão ultra-baixa de 6 poços para remover fibroblastos, na ausência de 4-OHT. Após a primeira passagem, dividimos a cultura em dois: dois poços foram mantidos sem tratamento (controle) e dois poços foram tratados com 200 nM 4-OHT (MycER). Contamos a esfera e o número de células de 5 passagens consecutivas para três experimentos independentes(Tabela 1). Os números cumulativos de células e esferas por passagem são mostrados na Tabela 2. A indução com 4-OHT leva ao aumento da esfera e das taxas de crescimento celular, como mostrado na Figura 1.

Figura 1: Resultados representativos. Esfera cumulativa (A)e células (B)curvas de crescimento de controle e mammospheres MycER. O desvio médio e padrão de 3 experiências independentes é mostrado. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Tabela 1: Números de esferas contadas e números de células banhadas e contadas em cada passagem.

Tabela 2: Cálculo de números de esferas banhadas e números cumulativos de esferas e celulares. Clique aqui para ver uma versão maior desta tabela. (Clique direito para download.)

Os autores não têm nada a divulgar.