Os ensaios de interação cocultura apresentados neste protocolo são de baixo custo, alta taxa de transferência e simples. Esses ensaios podem ser usados para observar interações microbianas na cocultura, identificar padrões de interação e caracterizar o potencial inibitório de uma cepa microbiana de interesse contra patógenos humanos e ambientais.
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Artigo de método
Ensaios de co-cultura de alta produtividade para a investigação de interações microbianas
Neste artigo
Resumo
Resumo
O estudo das interações entre microrganismos levou a inúmeras descobertas, desde novos antimicrobianos até insights em ecologia microbiana. Muitas abordagens utilizadas para o estudo das interações microbianas necessitam de equipamentos especializados e são dispendiosas e demoradas. Este artigo apresenta um protocolo para ensaios de interação de cocultura que são baratos, dimensionáveis para grandes números amostrais e facilmente adaptáveis a inúmeros experimentos experimentais. Os microrganismos são cultivados em conjunto, com cada poço representando uma combinação de microrganismos emparelhados. Um organismo de teste é cultivado em um lado de cada poço e primeiro incubado em monocultura. Subsequentemente, os organismos alvo são inoculados simultaneamente no lado oposto de cada poço, utilizando um carimbo de inoculação impresso em 3D. Após a cocultura, os ensaios concluídos são marcados para fenótipos visuais, como crescimento ou inibição. Esses ensaios podem ser usados para confirmar fenótipos ou identificar padrões entre isolados de interesse. Usando este método simples e eficaz, os usuários podem analisar combinações de microrganismos de forma rápida e eficiente. Esta aproximação da cocultura é aplicável à descoberta antibiótica assim como a pesquisa cultura-baseada do microbioma e foi aplicada já com sucesso a ambas as aplicações.
Introdução
Na natureza, os microrganismos raramente existem isoladamente; Consequentemente, eles estão constantemente interagindo com outros organismos. Portanto, estudar como os microrganismos interagem entre si é essencial para a compreensão de uma multiplicidade de comportamentos microbianos1. Interações microbianas podem ser mutualistas, comensais ou antagonistas. Estes em terações podem afetar não somente os micro-organismos eles mesmos mas também os ambientes e os anfitriões que os micro-organismos colonizam1,2.
Muitos cientistas estudam interações microbianas para identificar novas moléculas antimicrobianas. Uma das primeiras moléculas antimicrobianas clinicamente importantes foi encontrada através do estudo das interações microbianas. Sir Alexander Fleming observou um isolado contaminante de Penicillium spp. que inibiu o crescimento de uma cepa de Staphylococcus , o que levou à descoberta da penicilina antibiótica comumente utilizada3. A caracterização dos mecanismos que os microrganismos usam para antagonizar seus concorrentes continua a ser um recurso frutífero para a descoberta de moléculas antimicrobianas. Por exemplo, foi demonstrado recentemente que a estirpe de Streptomyces SP. Mg1 produz linearmicinas antibióticas, que têm uma atividade lítica e degradativa contra Bacillus subtilis4.
Mais, um peptide não-ribosomally sintetizado nomeado lugdunin foi descoberto recentemente após a observação que o Staphylococcus comensal nasal Lugdunensis inibe o Staphylococcus aureus5. Estudos também mostraram que interações mutualistas entre microrganismos são igualmente poderosas como interações antagônicas para a descoberta de moléculas antimicrobianas. Por exemplo, muitas formigas que cultivam fungos na tribo Attini abrigam bactérias simbióticas chamadas Pseudonocardia em seu exoesqueleto que produz moléculas antifúngicas para inibir um patógeno obrigatório de sua cultura fúngica6. Como o estudo das interações microbianas tem sido benéfico para a descoberta de moléculas antimicrobianas, o uso de telas de alta taxa de transferência pode resultar na descoberta de novas moléculas antimicrobianas.
Com relação ao custo e à facilidade de desempenho, as metodologias utilizadas para estudar interações microbianas variam de simples a complexas. Por exemplo, um teste de plugue de agar é um método barato e simples que pode ser usado para investigar o antagonismo entre múltiplos microrganismos7. No entanto, um ensaio de plugue de agar não é um procedimento eficiente e pode ser trabalhoso para muitas combinações emparelhadas. Para avaliar os efeitos de produtos microbialmente produzidos em isolados alvo de interesse de uma forma de alta produtividade, muitos laboratórios utilizam ensaios de difusão de disco8. Estes ensaios são fáceis e baratos e podem ser dimensionáveis para números mais elevados de amostras7. No entanto, este ensaio requer a geração de extratos microbianos e pode produzir resultados enganosos para certas combinações de organismos-alvo e antibióticos, tais como salmonelas e cefalosporinas9.
As abordagens anteriores dependem de componentes isolados para provocar uma resposta em um organismo alvo, em vez de permitir que os microrganismos interajam uns com os outros. Isso é de notar porque as interações entre os micróbios podem provocar a produção de moléculas antimicrobianas "crípticas" que não são produzidas em monocultura. Por exemplo, foi demonstrado recentemente que a keyicina antimicrobiana só é produzida por um Micromonospora SP. quando cocultivado com um Rhodococcus SP. que é isolado do mesmo microbioma de esponja10. Metodologias de interação mais complexas contornam esse potencial obstáculo à monocultura. Por exemplo, o iChip é útil para isolar bactérias raras e difíceis de cultivar de amostras ambientais e permite a observação de interações microbianas através do crescimento in situ11. Para investigar as interações em detalhe, a espectrometria de massa de imagem de dessorção/ionização a laser assistida por matriz (MALDI-TOF-IMS) pode ser usada. Essa abordagem fornece informações detalhadas sobre a composição e distribuição de pequenas moléculas e peptídeos produzidos por colônias microbianas interagindo com alta resolução espacial. MALDI-TOF-IMS também tem sido utilizado em múltiplos estudos de interações bacterianas para caracterizar os mecanismos de competição12,13,14,15. No entanto, MALDI-TOF-IMS muitas vezes requer preparação de amostra trabalhoso, especialização especializada para operar o equipamento, e espectrómetros de massa caros e especializados. Por estas razões, é uma técnica difícil de usar para estudos de alta taxa de transferência. Assim, um ensaio de cocultura simples, escalável e de alta taxa de transferência para interações microbianas que supera muitas limitações das abordagens acima seria benéfico.
Aqui, um protocolo para a cocultura microbiana da taxa de transferência elevada é apresentado. Este ensaio é simples e facilmente incorporado em estudos pré-existentes de interações microbianas. Em contraste com muitos métodos comumente usados para o estudo de interações microbianas, nosso método é simples, barato, e é capaz de investigar um grande número de interações. Estes ensaios não são apenas fáceis de executar, mas os materiais estão amplamente disponíveis a partir da maioria dos fornecedores de laboratórios ou recursos públicos (por exemplo, bibliotecas e makerspaces). Consequentemente, este ensaio é vantajoso como uma primeira linha de investigação para identificar e analisar padrões interessantes entre muitas combinações emparelhadas de microrganismos, o que pode ser especialmente útil para a investigação da ecologia microbiana.
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Protocolo
O consentimento informado foi obtido dos pais do doador, e o Comitê de assuntos humanos da Universidade de Wisconsin-Madison aprovou o estudo (Conselho de revisão institucional [IRB] número de aprovação H-2013-1044).
1. cultura da amostra
Nota: Este procedimento é utilizado aqui para o estudo de interações entre bactérias isoladas da cavidade nasal humana. Em princípio, os seguintes métodos são aplicáveis a qualquer condição de cultura. O caldo cérebro-coração-infusão (BHI) é usado para a propagação geral de bactérias nasais. Todas as placas são solidificadas usando 1,5% agar. Para este estudo, as amostras são retiradas da solução salina lavada no nariz de um doador (lavagem nasal), transferidas para tubos de microcentrífuga e congeladas a-80 ° c.
- Use técnicas de cultura padrão para a placa 100 μL de cada uma das amostras de lavagem descongelados nas placas BHI.
- Incubar as placas aerobicamente a 37 ° c durante 1 semana.
- Após a incubação, selecione ≥ 2 colônias de cada Morfotipo distinto por a placa e passagem os isolados aerobiamente em placas de BHI estrias uma colônia da placa inicial em uma placa nova de BHI e incubando a placa em 37 ° c. Repita até que as culturas bacterianas são puras.
Nota: Os isolados bacterianos podem ser identificados através da morfologia da colônia, da grama-mancha, do sequenciamento do gene 16S rRNA ou de outro método. No entanto, conhecer a identidade do isolado não é necessário para continuar o protocolo. - Cryopreserve todos os isolados bacterianos em-80 ° c após a combinação de 1 mL de 50% de glicerol com 1 mL de cultura bacteriana durante a noite (ver secção 3) em criostídeos.
2. selos da impressão 3D
Nota: O policarbonato foi selecionado como o material de carimbo devido a sua temperatura de vidro elevada da transição (° c 147) que excede temperaturas padrão da autoclave (° c 121), que minimiza o potencial para a deformação após usos repetidos.
- Carregue a impressora 3D com filamento em policarbonato.
- Aplique a colagem branca da escola (acetato do Polyvinyl) à cama da cópia para ajudar na adesão e para minimizar o entortamento do selo da inoculação durante a cópia.
- Carregar o. Arquivo de modelo STL (arquivo de dados suplementares) para o carimbo de inoculação (Figura 1) no software da impressora 3D.
- Imprima o carimbo de inoculação a uma temperatura de bocal de 290 ° c, temperatura da cama de 60 ° c e altura da camada de 0,38 mm.
- Enrole o carimbo na folha de alumínio e esterilize por autoclavagem para 1,5 h em um ciclo de gravidade com 15 min de secagem.
Nota: Embora o policarbonato seja higroscópico, os selos só mantêm aproximadamente 0,5% de peso da água após a esterilização.
3. preparação de culturas overnight
- Utilizando uma pipeta serológica, pipete 3 mL de caldo BHI estéril em tubos de cultura de 14 mL.
- Usando uma alça de inocular estéril de 1 μL, inocular uma colônia bacteriana no caldo. Gire o laço para garantir que o moita se dispersa no caldo. Vortex os tubos de cultura brevemente antes da incubação.
- Incubar os tubos da cultura em 37 ° c durante a noite (~ 16 h) em um abanador em 250 rpm.
- Vortex para romper os aglomerantes de células, uma vez que as culturas bacterianas atingem turbidez suficiente (OD600 ≥ 1).
4. preparação de placas de bioensaio
Nota: As placas do BioAssay são preparadas em uma capa do fluxo laminar para manter a esterilidade.
- Prepare a mídia BHI com 1,5% de agar e esterilize por autoclavagem de acordo com as instruções do fabricante.
- Após autoclavagem, resfrie a mídia BHI a 55 ° c em um banho de água com controle de temperatura.
- Usando uma pipeta sorológicos, pipeta 3 ml de meios fundidos de BHI em cada um dos 12 poços em uma placa do poço 12. Assegure-se de que os poços sejam tão exatos e mesmo como possíveis. Um litro de mídia produzirá ~ 27 placas de bioensaio.
- Permitir que o agar para definir durante a noite.
5. inocular placas de bioensaio com o organismo de teste
Nota: Um organismo de teste refere-se ao organismo para o qual a produção de atividade inibitória (por exemplo, a produção de antibióticos) é determinada usando o ensaio de interação da cocultura. Para este experimento, os organismos de teste são actinobactérias isoladas de amostras de lavagens nasais.
- Inocular o organismo de teste em uma placa de bioensaio, inserindo um estéril 10 μL de ciclo de inocular na cultura durante a noite e estrias uma gota de cultura sobre o terço esquerdo de uma placa bem.
Nota: Recomenda-se a apenas uma raia de um terço do poço, como o crescimento excessivo do poço proíbe a inoculação posterior de organismos-alvo. - Repetir até que todos os 12 poços da placa tenham sido inoculados com o organismo de ensaio.
- Incubar as chapas de cabeça para baixo à temperatura apropriada durante 7 dias. Em temperaturas mais elevadas (≥ 37 ° c) ou em climas mais secos, guarde as placas num recipiente húmido para evitar que as placas SECem.
6. preparação dos organismos-alvo
Nota: Um organismo alvo refere-se ao organismo cujo estado de inibição é determinado usando o ensaio de interação da cocultura. Para este experimento, os organismos alvo são Staphylococcus spp. isolados de amostras de lavagens nasais.
- Após a incubação das placas de bioensaio durante 6 dias, prepare as culturas durante a noite dos organismos-alvo especificados, como feito acima (ver secção 3).
7. inoculação do organismo alvo
Nota: Após a incubação durante a noite, assegure-se de que as culturas sejam turvas (OD600 ≥ 1). Algumas culturas bacterianas podem flocular na parte inferior do tubo de cultura. Vórtice os tubos de cultura para dispersar aglomerantes e avaliar a turbidez da cultura.
- Prepare a placa alvo preenchendo cada poço de um prato vazio de 12 poços com 1,8 mL de BHI e 200 μL da cultura alvo durante a noite.
- Desembrulhe e coloque um carimbo de inoculação estéril na placa alvo. Agitar suavemente as culturas ao redor nos poços, tendo o cuidado de garantir que as culturas não atravessam contaminar poços vizinhos.
- Levante o carimbo de inoculação e assegure-se de que haja uma gota de cultura alvo diluída em cada ponta do carimbo.
-
Prepare uma placa de controle de monocultura colocando o carimbo de inoculação em uma placa de bioensaio não inoculada e balanç suavemente o carimbo para que uma gota de cultura inocula cada poço. Uma vez que o carimbo de inoculação é removido, uma gota de cultura deve ser visível nos poços da placa de bioensaio.
- Se os poços não forem inoculados com o carimbo de inoculação devido a níveis irregulares de mídia, detectar 3 μL de cultura diluída durante a noite no lado direito dos poços usando uma pipeta.
- Inocular as placas de bioensaio como feito acima (ver passo 7.4.1), mas alinhar o carimbo de modo que as pontas se alinham com o lado direito da placa de 12 poços. Assegure-se de que o carimbo não entre em contato com a colônia bacteriana existente ao inocular os poços.
- Retire cuidadosamente o carimbo e coloque de volta na chapa alvo.
- Repita a inoculação para cada placa de bioensaio até que todas as placas sejam inoculadas.
- Incubar as placas de bioensaio de cabeça para baixo à temperatura apropriada durante 7 dias.
8. Pontuação
-
Após a coculturação dos organismos de teste e alvo durante 1 semana, marcar as interações com base na seguinte avaliação visual:
- Marcar os poços com o crescimento do organismo alvo que exibe o crescimento que é indistinguível do controle de monocultura como "0" (sem inibição) (Figura 2A, B).
- Marcar os poços com organismo alvo que exibe crescimento diminuído comparado ao controle como "1" (inibição fraca) (Figura 2C).
- Marcar os poços onde o organismo alvo não cresceu como "2" (forte inibição) (Figura 2D).
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Resultados
Os ensaios de interação cocultura podem ser usados para compreender as interações microbianas, identificar padrões de interesse e descobrir isolados microbianos com atividades intrigantes. Nestes ensaios, um organismo de teste é monoculcionado em um lado de uma placa de ágar bem 12 e incubada por 7 dias. Subseqüentemente, um organismo do alvo é manchado ao lado do organismo do teste e os dois micróbios foram cocultivados por 7 dias antes de marcar para o phenotype do crescimento do organi...
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Discussão
Antibióticos e outros metabólitos secundários que mediam interações microbianas são úteis para uma infinidade de aplicações, incluindo a descoberta de drogas. Neste documento, é apresentado um protocolo para ensaios de cocultura para avaliar um grande número de interações microbianas. Esses ensaios de interação de cocultura são um meio de throughput simples, acessível, escalável e de alta capacidade para investigar muitas combinações emparelhadas de microrganismos em tandem. Os organismos do alvo são manchados ao lado do...
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Divulgações
Os autores não declaram interesses concorrentes.
Agradecimentos
Agradecemos a Daniel May, Marc Chevrette e Don Hoang pela leitura crítica do manuscrito. Este trabalho, incluindo os esforços de Cameron R. Currie, foi apoiado pela Universidade de Wisconsin-Madison, gabinete do vice-chanceler de pesquisa e pós-graduação de educação com o financiamento da Wisconsin Alumni Research Foundation, financiamento também fornecido pelo Institutos nacionais de centros de saúde para a excelência da pesquisa translacional (U19-AI109673-01). Reed M. Stubbendieck foi apoiado por uma biblioteca nacional de medicina de formação de subvenção para a computação e informática em biologia e medicina programa de formação (NLM 5T15LM007359). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e interpretação, ou a decisão de submeter o trabalho para publicação.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 1 μ L alças de inoculação de poliestireno descartáveis, azul | VWR | 12000-806 | |
| 10 μ L alças de inoculação de poliestireno descartáveis, amarelo | VWR | 12000-810 | |
| Placa de cultura de células de 12 poços, estéril com tampa | Greiner bio-one | 665 180 | |
| 14 mL tubo de fundo redondo de poliestireno, 17 x 100 mm 2style, não pirogênico, estéril | Falcon | 352057 | |
| 2.0 com tampas, estéreis | EUA científico | 1420-9710 | |
| Pipeta sorológica de 25 mL | Cell Treat | 229225B | |
| Ágar, bacteriológico | VWR | J637 | |
| Caldo de Infusão Cérebro | Coração Filamento | Dot Scientific DSB11000-5000 | |
| branco, 3 mm de diâmetro | Cola Escolar Keene Village Plastics | 12.1-3MM-WH-581.2-1KG-R | |
| Elmer's | EPIE304 | ||
| Impressora 3D Taz 6 | Lulzbot |
Referências
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Reimpressões e permissões
