In vivo Optical cálcio Imaging de aprendizagem induzida por plasticidade sináptica em Drosophila melanogaster

Resumo

Aqui nós apresentamos um protocolo com que o cálcio pre-e/ou pós-sináptica pode ser visualizado no contexto da aprendizagem e da memória de Drosophila . A imagem latente in vivo do cálcio que usa sensores synaptically localizados do cálcio é combinada com um paradigma olfactory clássico do condicionamento tal que a plasticidade sináptica subjacente este tipo de aprendizagem associativa possa ser determinada.

Resumo

Décadas de pesquisa em muitos organismos modelo levaram ao conceito atual de plasticidade sináptica subjacente aprendizagem e formação de memória. Mudanças induzidas pela aprendizagem na transmissão sináptica são muitas vezes distribuídas em muitos neurônios e níveis de processamento no cérebro. Portanto, os métodos para visualizar a plasticidade sináptica dependente da aprendizagem através dos neurônios são necessários. A mosca de fruto Drosophila melanogaster representa um organismo modelo particularmente favorável para estudar os circuitos neuronais de aprendizagem subjacente. O protocolo aqui apresentado demonstra uma maneira em que os processos subjacentes à formação de memórias olfatório associativas, ou seja, atividade sináptica e suas mudanças, podem ser monitorados in vivo. Usando a ampla gama de ferramentas genéticas disponíveis na Drosophila, é possível expressar especificamente indicadores de cálcio geneticamente codificados em populações de células determinadas e até mesmo células individuais. Fixando uma mosca no lugar, e abrindo a cápsula principal, é possível visualizar a dinâmica do cálcio nestas pilhas ao entregar estímulos olfactory. Além disso, demonstramos uma set-up em que a mosca pode ser submetida, simultaneamente, a choques eléctricos para o corpo. Isto fornece um sistema em que as moscas podem submeter-se ao condicionamento olfactory clássico-por meio de que um odor previamente ingênuo é aprendido para ser associado com a punição de choque elétrico-ao mesmo tempo que a respresentação deste odor (e outros odores não treinados) é observada no cérebro através de microscopia de dois fótons. Nosso laboratório relatou previamente a geração de sensores synaptically localizados do cálcio, que permite que um confinar os sinais fluorescentes do cálcio aos compartimentos pre-ou pós-sináptica. A microscopia de dois fótons fornece uma maneira de resolver espacialmente estruturas finas. Nós exemplificamos isso, concentrando-se em neurônios integrando informações do corpo do cogumelo, um centro de ordem superior do cérebro do inseto. Globalmente, este protocolo fornece um método para examinar as conexões sinápticas entre os neurônios cuja atividade é modulada como resultado do aprendizado olfativo.

Introdução

Decifrar onde e como a informação é adquirida no cérebro através da aprendizagem e, posteriormente, armazenada como memória constitui uma das tarefas mais desafiadoras na neurociência¹. A pesquisa neurocientífica levou ao conceito de mudança na transmissão sináptica como substrato neuronal que está subjacente à formação de aprendizagem e memória^2,3. É supor que, durante a aprendizagem, as conexões sináptica entre os conjuntos neuronal que são ativos durante a percepção de um estímulo tornam-se modificados de modo que seu teste padrão combinado da atividade possa ser recuperado durante a recordação da memória, assim instruindo ação comportamental futura⁴. Estas "células Engram" e suas sinapses são muitas vezes distribuídas entre as regiões cerebrais e os níveis de processamento, o que dificulta a atribuição de alterações observadas na transmissão sináptica para a aprendizagem de uma tarefa ou um estímulo. Para localizar e Visualizar essas alterações sinápticas que são causalmente ligadas a uma tarefa de aprendizado específica, uma precisa de um sistema de modelo adequado que permita confinar precisamente essas sinapses.

Para tal empreendimento, a Drosophila melanogaster é particularmente adequada porque combina a simplicidade relativa do cérebro, a riqueza comportamental e a acessibilidade experimental. Entre os organismos modelo bem estabelecidos, a Drosophila está situada entre o nematódeo C. elegans e mamíferos geneticamente tratável como camundongos em termos de complexidade neuronal. O número estereotipado de neurônios (~ 300) e o repertório comportamental limitado é observado em C. elegans. Os mamíferos, por outro lado, têm milhões de neurônios e uma complexidade comportamental surpreendente. O cérebro da mosca da fruta é, com o seu ~ 100.000, neurônios significativamente menores do que os cérebros da maioria dos vertebrados, e muitos dos neurônios são individualmente identificáveis⁵. No entanto, a Drosophila demonstrar um amplo espectro de comportamentos complexos, incluindo uma capacidade de apresentar formação olfatória associativa robusta e de memória, descrita pela primeira vez há mais de 40 anos⁶. No decorrer deste procedimento de condicionamento clássico, grupos de moscas são submetidos a um odor como o estímulo condicionado (CS⁺), enquanto eles recebem um choque elétrico punindo como o estímulo não condicionado (EUA). Um segundo odor (CS^-) é então apresentado sem qualquer punição. Assim, os animais aprendem a evitar o odor associado com a punição, que pode ser testado em uma situação de escolha subsequente entre os dois odores, CS⁺ e cs^-. O trabalho na dissecação do substrato neuronal subjacente a esse comportamento na Drosophila identificou os corpos de cogumelos (MB) como o local primário do "Engram"^7,8,9,10 e, portanto, o circuito desta região cerebral foi e é objeto de intensa pesquisa, a fim de desvendar a lógica pela qual um engrama de memória é adquirido e armazenado (recentemente revisado em^11,12).

A Drosophila MB consiste em ~ 2.000 neurônios intrínsecos (células de Kenyon) por hemisfério, organizados em projeções axonais paralelas¹³. Os axônios dos neurônios de projeção olfativa são estendidos ao protocerebra lateral e aos calyces do MB, o local de entrada dendrítico principal do MB e recebem a entrada olfactory dos lóbulos sensilas. O feixe longo, paralelo dos axônios de pilhas de Kenyon constituem o pedúnculo e os lóbulos. A maioria das células de Kenyon bifurcate formando β/β'-lóbulos horizontais, estendendo uma colateral para a linha média do cérebro, e os lobos verticais α/α'-por estender a segunda garantia projetando na direção dorsal-anterior. O outro grupo de células de Kenyon forma os γ-lóbulos horizontais¹³ do MB onde o processo de aprendizagem e a formação subseqüente da memória a curto prazo podiam ser localizados¹⁰. Os lóbulos MB recebem entrada aferente e proporcionam saída eferente, ambos tipicamente restritos a distintas sub-regiões compartimental ao longo dos axônios da célula de Kenyon^14,15,16. Em particular, os neurônios de entrada de MB dopaminérgicos aferentes têm sido mostrados para mediar os efeitos baseados em valor, por exemplo, PUNITIVOS, reforçando na aprendizagem olfatória associativa^15,17. Os neurônios de saída de MB eferentes estereotípicos e individualmente identificáveis dos lóbulos de corpo de cogumelo integram informações em um grande número de células Kenyon, segmentam diversas áreas cerebrais e carregam informações apetitoso ou aversivas de comportamento-instrutiva¹⁵ . Esta arquitetura neuronal conduziu a um conceito da organização do Engram associativo. Os odores são codificados relativamente precisamente por conjuntos escassamente ativados de células de Kenyon. A atividade coincidente destes conjuntos de células de Kenyon e liberação de dopamina-evocado por punindo estímulos-modula transmissão de células de Kenyon presynapses em MB neurônios de saída, de tal forma que os animais irão subsequentemente evitar este cheiro particular^{10 ,12}. Nós usamos este engrama rather precisamente definido e localizado como um caso paradigmática para ilustrar como estas mudanças aprendizagem-dependentes na atividade sináptica podem ser determinadas e monitoradas.

O valor de Drosophila como um sistema modelo confia fortemente na caixa de ferramentas genética incomparável que permite que um expresse transgenes para identificar, monitorar, e controlar únicos neurônios dentro dos circuitos complexos¹⁸. O advento de técnicas de monitoramento de atividade neuronal-como a imagem de cálcio, discutido aqui-permitiu a determinação de padrões de atividade neuronal em resposta a um estímulo específico. Combinando a expressão Gal4-driven específica de indicadores genetically codificados do cálcio (GECIs) com estimulação olfactory, uma pode visualizar a dinâmica odor-evocada do cálcio dos neurônios do interesse¹⁹. Neste protocolo, mostra-se que, ao acoplar essa técnica com um paradigma de condicionamento clássico, é possível examinar essas respostas olfativas no contexto da aprendizagem. A plasticidade induzida pela aprendizagem pode ser mais dissecada usando GECIs que não são apenas localizadas a um único Neuron específico, mas também a subcompartimentos específicos de um Neuron. Pech et al.²⁰ estabeleceram uma seleção de ferramentas que permitem exatamente isso. Alvejando o GCaMP3²¹ ao pre-ou ao postsynapse-através da ligação ao vertebrados synaptophysin ou ao Homer de d, respectivamente²⁰-a modulação diferencial destes locais pode ser distinguida. Esta localização confere, neste contexto, uma vantagem sobre a maioria dos GECIs que estão presentes em todo o citosol-por exemplo, GCaMP²², GCaMP3²¹, ou GCaMP6²³ -porque significa que os transientes pré e pós-sinápticos podem ser distinto do influxo integrado geral do cálcio que ocorre em conseqüência da ativação do neurônio. Isso pode fornecer pistas sobre a localização e os tipos de plasticidade que ocorrem como resultado de ou que causam a formação de aprendizagem e memória. Como um exemplo, o protocolo fornecido aqui mostra o valor desta ferramenta em decifrar a modulação de neurônios de saída MB durante a aprendizagem associativa olfatória, direcionando a expressão do sensor de cálcio para apenas o postsynapse. Monitorando, dentro de uma mosca individual, atividade odor-evocada antes e depois do condicionamento olfactory uma comparação direta pode ser extraída entre uma resposta ingênua do odor e uma resposta aprendida do odor. Embora fixado na mesma Câmara de imagem, as moscas são expostas a uma seleção de odores. Em seguida, eles recebem um protocolo de condicionamento associativo aversivo em que um desses odores é emparelhado com choque elétrico (tornando-se o CS⁺) e outro odor é apresentado sem reforço (tornando-se o cs^-). Finalmente, as moscas são novamente expostos aos mesmos odores como na primeira etapa. A dinâmica do cálcio é observada usando microscopia de dois fótons.

Protocolo

1. moscas transgênicas de frutas, Drosophila melanogaster

1. A fêmea transversal do Virgin e do macho voa (levantado em 25 ° c na umidade relativa de 60% em um ciclo claro/escuro de 12 h) que carreg as construções desejadas de Gal4 e de UAS²⁵, respectivamente, para produzir as moscas em que os neurônios específicos do interesse expressam um genetically codificado indicador de cálcio.
2. Age a progêia feminina da Cruz acima até que estejam na faixa de 3-6 dias após a eclosão. As moscas fêmeas são preferíveis por causa de seu tamanho ligeiramente maior.

2. preparação da mosca da fruta para a imagem latente in vivo do cálcio

1. Selecione uma única mosca fêmea e anestesie no gelo por não mais do que 5 minutos.
2. Usando o fórceps fino, coloc a mosca na câmara da imagem latente (demonstrada em Figura 1c). Assegure-se de que o tórax e as pernas estejam em contacto com os fios eléctricos na parte inferior da câmara e que a cabeça se estabeleça plana. Fixar a posição da mosca usando fita adesiva clara.
   Nota: Este protocolo requer uma câmara de construção personalizada na qual as moscas são fixas, com a cápsula de cabeça acessível para abertura, e as moscas capazes de receber tanto estimulações de odor para as antenas e choques elétricos para o tórax e pernas (Figura 1).
3. Usando uma lâmina cirúrgica do bisturi fixada ao punho do bisturi (veja a tabela de materiais), corte uma janela na fita em torno da cabeça da mosca, deixando as antenas cobertas e somente a porção anterior-a mais do tórax expor.
4. Cerque os lados e a parte traseira da cabeça com a colagem de cura da azul-luz, manipulada com cuidado usando um pino do inseto prendido por maxilas côncavas-convexas. Defina a cola usando uma lâmpada LED azul de emissão de luz.
5. Verifique se a cola está completamente ajustada e limpe qualquer cola residual não endurecida da superfície dorsal da cabeça de mosca.
6. Aplique uma gota de solução de Ringer²⁴ (ver tabela de materiais) para cobrir a cutícula exposta da cabeça.
7. Usando uma faca de facada muito fina, corte através da cutícula. Para a remoção mais eficiente da cutícula, primeiro corte através do posterior da cabeça usando o ocelos como um ponto de partida. Em seguida, cortar cada lado, medial para os olhos, para formar um retalho da cutícula que pode ser facilmente arrancado usando fórceps.
8. Remover qualquer excesso de cutícula que pode bloquear a região do cérebro de interesse.
9. Limpe com cuidado a superfície dorsal de toda a traquéia usando o fórceps fino, evitando o rompimento do tecido de cérebro próprio. Remova e refresque a solução de Ringer²⁴ (veja a tabela de materiais) como necessário para limpar a área de detritos de tecido.
10. Coloque a agulha de entrega de odor hipodérmica em posição, aproximadamente 1 cm da cabeça da mosca. Assegure-se de que não há nada que possa obstruir a entrega do odor às antenas.
11. No microscópio, conecte a câmara da imagem latente ao sistema da odor-entrega através da agulha hipodérmica da entrega do odor.
12. Para permitir que a mosca recupere completamente da anestesia e da cirurgia, e para se adaptar ao fluxo de ar, implemente um período de repouso de 10 minutos nesta fase.

3. imagem latente in vivo do cálcio

1. Use um microscópio multifóton equipado com um laser infravermelho e um objetivo de imersão em água (ver tabela de materiais), instalado em uma tabela de vibração isolada. Para a visualização de indicadores de cálcio baseados em GFP, sintonize o laser com um comprimento de onda de excitação de 920 nm e instale um filtro passa-banda GFP.
2. Usando o botão de ajuste de Z grosseiro, digitalizar através do eixo Z do cérebro e localizar a região do cérebro de interesse. Use a função de recorte para focar a digitalização apenas nesta área para minimizar o tempo de digitalização e para girar a vista de digitalização de modo que o anterior da cabeça esteja voltado para baixo.
3. Ajuste o tamanho do quadro para 512 x 512 px, velocidade de digitalização para > 4 Hz e região de digitalização (na dimensão Y) para que os neurônios de interesse sejam cobertos.

4. visualização de transientes de cálcio com odor evocado através de condicionamento olfativo

1. Use um sistema de entrega do odor^19,26 que possa entregar diversos estímulos do odor em uma maneira temporally exata.
   1. Use um computador adicional para controlar o dispositivo e para se comunicar com o software de microscópio de imagem para coordenar estimulações de odor com captura de imagem durante experimentos.
   2. Inicie um pacote macro pré-programado capaz de vincular o software de aquisição de imagem e o programa de entrega de odores (por exemplo, um pacote de macros VBA instalado no software de controle de microscópio, consulte tabela de materiais) que responde a uma entrada externa desencadeamento fornecido pelo início de um protocolo de entrega de odor em um programa separado).
2. Inicie a medição monitorando o "pré-treinamento"/transientes de cálcio evocados por odor ingênuo em uma resolução de 512 x 512 PX e uma taxa de quadros de 4 Hz. entregar um estímulo de odor 2,5 s ladeado por aquisição de imagem adicional para 6,25 s início odor anterior (para estabelecer um F ₀ valor basal) e 12,5 s após o deslocamento do odor. Repita isso com um segundo odorante e, em seguida, com um terceiro odorante.
3. Continue 3 min após esta medida com condicionamento clássico ("treinamento") a mosca.
   1. Selecione um dos odores apresentados na fase de "pré-treinamento" para se tornar o CS⁺ odor e outro para se tornar o cs^- odor. Apresente o CS⁺ odor usando o sistema de odor-entregar controlado por computador para 60 s ao lado de 12 90 V choques elétricos.
   2. Após uma ruptura de 60 s, apresente o CS^- odor sozinho para 60 s. Use como odorantes 4-methylcyclohexanol e 3-octanol. Não apresente o terceiro odorante (por exemplo, 1-octen-3-OL) durante este treinamento, pois ele é usado como controle apenas antes (etapa 4,2.) e depois (etapa 4,4) a fase de treinamento.
4. Meça o "borne-treinamento" transientes odor-evocados do cálcio outra vez repetindo o protocolo da estimulação do odor do "pre-treinamento" (etapa 4,2.) 3 minutos após ter terminado a fase do treinamento (etapa 4,3).
   Nota: o momento desta etapa deve refletir o tempo de interesse após a formação da memória (por exemplo, realizar este passo 3-4 min após a etapa de condicionamento para investigar a memória de curto prazo). Tipicamente, as moscas podem sobreviver por várias horas nesta preparação.
5. Salve arquivos de imagem em um formato apropriado (por exemplo, TIFF) para análise de imagem posterior.

5. análise de imagem

1. Para analisar imagens, abra arquivos TIFF (ou similares) no software de análise de imagem, como Fiji²⁷.
2. Alinhe as pilhas usando um algoritmo de correção de movimento para garantir o movimento mínimo nas direções X e Y. Descarte todas as gravações que mostrem movimento forte no eixo Z.
3. Selecione a ferramenta do software usado para marcar uma região de interesse (ROI) em torno da área que deve ser examinada. Isso deve ser o mais preciso possível para limitar a influência da fluorescência de fundo.
4. Use a respectiva ferramenta do software para extrair dados de intensidade de fluorescência temporal como arquivos de dados do ROI selecionado, de forma que um valor seja gerado para cada quadro da gravação.
5. Abra os dados usando um programa de análise de dados para calcular os valores ΔF/F₀ para cada traço de odor. F₀ = fluorescência média nos 2 s antes do início do odor. ΔF = a diferença entre a fluorescência bruta em um determinado quadro e F₀. A partir desses valores, calcule um valor ΔF/F₀ para cada quadro que pode ser plotado contra o tempo para refletir a fluorescência relativa durante todo o período de estímulo ao odor.

Resultados

Um exemplo de imagens adquiridas com o protocolo acima pode ser observado na Figura 2. d Homer-GCaMP3 é expressado em um neurônio da saída do MB cujos os dendritos inervam o compartimento 1 do MB γ-lóbulo (o neurônio é denominado MVP2^28,29) e é visado genetically usando a linha Split-Gal4 MB112C¹⁶. Também, demonstrado é a diferença na localização subcelular de um citos...

Discussão

A dissecção dos circuitos neurais subjacentes à aprendizagem e à memória é um objetivo proeminente no campo da neurociência. A acessibilidade genética da Drosophila e a amplitude e facilidade de testes comportamentais fazem desta uma ferramenta ideal para investigar tais fenômenos. Aqui, um método é apresentado com o qual é possível visualizar, dentro de moscas individuais, a modulação que ocorre em um nível subcelular como resultado do condicionamento olfativo. Ao realizar o pré-treinamento e a visualização pós...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
1-Octen-3-ol	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA	O5284	Produto químico usado como odorante
3-Octanol	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA	218405	Produto químico usado como odorante
4-metilciclohexanol	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA	153095	Produto químico usado como odorante
Filtro passa-banda para EGFP (525/50 nm)	Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Alemanha
Fita adesiva transparente	Tesa SE, Norderstedt, Alemanha		Fita adesiva transparente padrão
Mandíbulas côncavas-convexas	Fine Science Tools, North Vancouver, Canadá	10053-09	Porta-lâminas com mandíbulas côncavas-convexas Pinças
finas	Fine Science Tools, North Vancouver, Canadá	11412-11	Pinça com ponta 0,1 x 0,06 mm
Agulha hipodérmica	Sterican - B. Braun, Melsungenk, Alemanha	4665120	1,20x40mm
Pinos de inseto Minutien	Fine Science Tools, North Vancouver, Canadá	26002-10	Diâmetro 0,1 mm, ponta 0,0125 mm
Kentoflow	Kent Express Dental Supplies, Gillingham, Reino Unido	953683	Cola fotopolimerizável azul
Lâmina de microscópio	Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe, Alemanha	0656.1	Objetiva padrão lâmina 76 x 26 mm
Óleo mineral	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	M8410	Usado como diluente para odores
Laser Ti-Sapphire com bloqueio de modo Chameleon Vision 2	Coherent Inc., Santa Clara, CA, EUA		Laser de femtossegundo infravermelho ajustável
Microscópio multifotônico LSM 7MP equipado com detectores BiG Carl	Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Alemanha		Microscópio multifotônico, várias empresas fornecem dispositivos semelhantes.
Objetiva de imersão em água Plan-Apochromat 20x (NA = 1,0)	Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Alemanha	421452-9900-000	Objetiva W "Plan-Apochromat" 20x/1,0 DIC M27 Solução
de Ringer			KCl, 130mM NaCl, 2mM MgCl2, 2mM CaCl2, 5mM Hepes-NaOH, 36mM sacarose, pH = 7,4
Faca	Sharpoint, Surgical Specialties Corporation, Reading, PA, USA	72-1551	5,0 mm Profundidade da lâmina reta restrita
Lâmina de bisturi cirúrgico	Swann-Morton, Sheffield, Reino Unido	0303	Produto nº 11
Cabo de bisturi cirúrgico	Swann-Morton, Sheffield, Reino Unido	0907	Produto nº 7S/S
Visual Basics of Applicatons (VBA) software para receber um trigger do dispositivo de entrega de odor e o dispositivo de aplicação de choque elétrico (fonte de alimentação) para interagir com o software ZEN da Zeiss que controla o microscópio.	Escrito sob medida e disponível mediante solicitação	n.a.n.a	.