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Artigo de método

Abordagem experimental para examinar a sinalização de leptina nos corpos carótidas e seus efeitos sobre o controle da respiração

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DOI:

10.3791/60298

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25 de outubro de 2019

 ,  ,  , 
1Department of Medicine, Johns Hopkins University, 2Instituto de Biomedicina de Sevilla (IBiS), Centro de Investigación Biomédica en Red de Enfermedades Respiratorias (CIBERES), Hospital Universitario Virgen del Rocío/Universidad de Sevilla

Neste artigo

Resumo

Nosso estudo se concentra nos efeitos da sinalização de leptina no corpo carótida (Cb) na resposta ventilatória hipóxico (HVR). Realizamos experimentos de "perda de função" medindo o efeito da leptina no HVR após a denervação do CB e experimentos de "ganho de função" medindo HVR após superexpressão do receptor de leptina na Cb.

Resumo

Uma leptina hormonal produzida por adiócito é um estimulante respiratório potente, que pode desempenhar um papel importante na defesa da função respiratória na obesidade. Os corpos carótidas (CB), um órgão-chave da sensibilidade hipóxico periférica, expressam a longa isoforme funcional do receptor de leptina (LepRb),mas o papel da sinalização de leptina no controle da respiração não foi totalmente elucidado. Examinamos a resposta ventilatória hipóxico (HVR) (1) em camundongos C57BL/6J antes e depois da infusão de leptina na linha de base e após a denervação do CB; (2) em LepRb-deficientes camundongos obesos db/db na linha de base e após a superexpressão leprb em CBs. Em camundongos C57BL/6J, a leptina aumentou o HVR e os efeitos da leptina no HVR foram abolidos pela denervação do CB. Em camundongos db/db, a expressão de LepRb em CB aumentou o HVR. Portanto, concluímos que a leptina atua na Cb para aumentar as respostas à hipóxia.

Introdução

Um adipócito produzido hormônio leptina atua no hipotálamo para suprimir a ingestão de alimentos e aumentar a taxa metabólica. Estudos realizados em nosso laboratório1,2 e por outros investigadores3,4 mostraram que a leptina aumenta a resposta hipercapônica ventilatória (HVR) prevenindo a hipoventilação da obesidade na leptina obesidade deficiente. No entanto, a maioria dos indivíduos obesos têm altos níveis de leptina plasmática e demonstram resistência aos efeitos metabólicos e respiratórios do hormônio5,6,7,8. A resistência à leptina é multifatorial, mas a permeabilidade limitada da barreira sangue-cérebro (BBB) à leptina desempenha um papel importante. Propomos que a leptina aja abaixo do BBB em um órgão-chave de sensibilidade hipóxico periférica, os corpos carótidas (Cb), para defender a respiração em indivíduos obesos. CBs expressar a longa isoforme funcional do receptor de leptina, LepRb, mas o papel da Cb em efeitos respiratórios da leptina não foi suficientemente elucidado9,10.

O objetivo do nosso método era examinar o efeito da sinalização de leptina no CB no HVR. Nossa lógica era realizar (a) perda de experimentos de função infundindo leptina em camundongos com corpos carótidos intactos e corpos carótidos denervatados seguidos por medições de HVR; (b) ganho de experimentos de função em camundongos db/db sem LepRb,no qual medimos o HVR na linha de base e após a expressão de LepRb exclusivamente em CB. A vantagem de nossas técnicas era que nós executamos todas nossas experiências em ratos desenfreados desenfreados durante o sono e o wakefulness. Investigadores anteriores realizaram seus experimentos anestesia9 ou não mediram os efeitos da leptina durante o sono10. Além disso, nosso estudo é o primeiro a utilizar um ganho único de abordagem de função com expressão seletiva de LepRb em Cb descrita acima.

No contexto amplo, nossa abordagem pode ser generalizada para outros receptores expressos na Cb e seu papel na sensibilidade hipóxico. Os investigadores podem infundir um ligand a um receptor do interesse e medir o HVR na linha de base e após o denervation do CB. Como uma abordagem complementar, um receptor de interesse pode ser superexpresso nas medições de CB e HVR pode ser realizado antes e depois da superexpressão usando nossa tecnologia descrita neste manuscrito.

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Protocolo

Todos os protocolos experimentais foram aprovados pelo Institutional Animal Care and Use Committee (MO18M211).

1. Infusão de Leptina

Nota: A fim de examinar o efeito da leptina na respiração, infundimos leptina subcutâneamente em camundongos C57BL/6J magros por uma bomba osmótica para elevar os níveis de leptina circulante para aqueles observados em camundongos obesos.

  1. Preparação da bomba osmótica
    1. Pese a bomba vazia para verificar o peso líquido da solução carregada.
    2. Adicione leptina (5 mg/mL) à bomba osmótica (1 μL/h por 3 dias). Encha a bomba com uma seringa pequena (1 mL). Após o enchimento, feche a bomba com o tubo de enchimento de 27 de ponta sem corte fornecido.
      Nota: A seringa e o tubo anexado devem estar livres de bolhas de ar.
    3. Após o enchimento, pese a bomba outra vez para verific o peso líquido da solução.
    4. Insira a bomba de leptina subcutâneamente na área do interscapular.
      NOTA:       Se você quiser iniciar a infusão imediatamente, incubar a bomba pré-cheia no soro fisiológico estéril em 37 °C por pelo menos 4 a 6 h (de preferência durante a noite).

2. Resposta ventilatória hipóxida (HVR)

Nota: Condições termoneutras eliminam fatores estressantes impostos pela temperatura ambiente fria e modificam significativamente o metabolismo em camundongos. Portanto, todas as medidas respiratórias devem ser realizadas nas condições termoneutras (t = 30 °C) utilizando uma incubadora neonatal12 (Figura 1A). A câmara de plethysmoography do corpo inteiro (WBP) foi usada para todas as medidas. Todos os animais devem ser aclimatados à câmara de plethysmography barométrica e a um colar de garganta do sham para a gravação subseqüente da oximetria do pulso por 3-5 dias antes das medidas de HVR. HVR é registrado entre 10:00 e 17:00 HVR é suprimido durante o sono, portanto, pode ser medido separadamente durante o sono e vigília tranquila13. Para garantir a fase específica de sono-vigília do animal durante a medição de HVR, os eletrodos EEG/EMG devem ser implantados como um headmount EEG/EMG, como descrito anteriormente14. Os animais devem ser autorizados a recuperar por pelo menos 72 h após o headmount. A encenação do sono deve ser executada em 5 s épocas. O sono NREM é reconhecido pela atividade de EEG de ondas lentas que ocupa mais de 50% da época. Vigília silenciosa é manifestada pela atividade alfa EEG na ausência de movimentos. O sono REM é identificado pela atividade predominante de alfa e EEG na presença de tom muscular reduzido na EMG. Normalmente, o sono REM não é observado durante os desafios do gás HVR.

  1. O protocolo de gravação hvr
    1. Use a câmara WBP do tamanho seguinte: diâmetro interno de 80 mm, altura de 50,5 mm e volume de 0,4 L. A câmara WBP é composta por duas câmaras, câmaras seladas e de referência, e uma plataforma circular para colocar o mouse14 (Figura 1B). A entrada e a saída dentro da câmara são controladas por fontes de pressão positivas e negativas que mantêm a pressão atmosférica. Esse controle cria um fluxo de viés constante na câmara e impede a retenção de CO2. Para mais detalhes sobre a configuração WBP, ver Hernandez e colegas15.
    2. Medir a temperatura dentro da câmara e a umidade relativa na sala antes de colocar o mouse no WBP.
    3. Medir o peso corporal e temperatura retal.
    4. Coloque o colar oximômetro ao redor do pescoço do mouse (a área deve ser raspada anteriormente).
    5. Coloque o mouse dentro do WBP e certifique-se que a câmara está completamente selada, a fim de evitar vazamentos de ar.
    6. Aguarde aproximadamente 30 min até que o mouse esteja quieto e a câmara esteja em um volume constante.
    7. Normoxia: após 30 min, se o rato estiver quieto, comece a gravar os sinais respiratórios e a saturação periférica de oxigênio (SpO2)na fase normoxia (21% FiO2 a 1 caixa de pressão) por 20 min, usando labchart 7 Pro (versão 7.2).
    8. Hipóxia: após 20 min de normoxia tranquila, começar a gravar o primeiro ciclo de hipóxia aguda e SpO2. Para a fase de hipóxia, expor os animais a um fluxo constante de gás misto composto por 10% O2 e 3% CO2 para 5 min.
      1. Durante os primeiros 30 segundos da hipóxia, o gás misto flui através da câmara através de 2 pequenos portos laterais na base, permitindo que o FiO2 caia de 21% (em 1 caixa de pressão) para 10%.
      2. Após os 30 s iniciais, fechar um dos pequenos portos laterais da câmara WBP e manter a gravação na hipóxia constante em 10% FiO2 para 5 min.
        NOTA: A mistura de 10% O2 e 3% CO2 na hipóxia é usada para manter a eucapnea11.
    9. Após os 5 min da hipóxia, exponha o rato ao ar do quarto outra vez (21% FiO2 em 1 atm da pressão) comutando a fonte de entrada.
    10. Aguarde pelo menos 30 min até a próxima gravação de normoxia, a fim de se recuperar da exposição hipóxico anterior para evitar o fenômeno ventilatório de roll-off (ou seja, supressão central da respiração durante a hipóxia16).
      Nota: Repita os ciclos de normoxia/hipóxia três vezes em cada camundongo para garantir a reprodutibilidade das medições. Em nossa experiência, exposições hipóxicos adicionais (superiores a 3 vezes em um determinado dia) devem ser evitadas, devido à adaptação ventilatória (o fenômeno roll-off).
    11. No final do experimento, calibrar a câmara WBP (com o mouse ainda está dentro), injetando 1 mL de ar quarto 3 vezes com uma seringa conectada em um dos pequenos portos laterais na base da câmara.
    12. Medir a temperatura na câmara novamente com o animal dentro dela.
    13. Abra a câmara e medir a temperatura retal do mouse antes de colocá-lo de volta para sua gaiola em casa.
  2. Cálculo do HVR
    1. Digitalize todos os sinais para o cálculo do HVR em 1.000 Hz (frequência de amostragem por canal).
      Nota: WBP análise de volume das marés é realizada no Lab Chart 7 com base na equação Drorbaugh e Fenn17. As variáveis exigidas compreendem a temperatura rectal do rato e a temperatura da câmara (antes e depois da medida de HVR), a umidade relativa, e a constante do gás de câmara. Esta constante é resultante da deflexão da pressão WBP após as injeções de 1 mL de ar na fase de calibração. Para mais detalhes, consulte Hernandez e colegas15.
    2. Depois de calcular a equação de Drorbaugh e Fenn, multiplique o canal de câmara do volume das marés (Vt) pela constante.
    3. Seleção de gravações para a análise
      1. Normoxia: selecione apenas seções de respiração constante com volume constante de marés. Evite seções próximas aos movimentos do rato.
      2. Hipóxia: descarte os primeiros 30 s quando os níveis O2 estão diminuindo de 21% para 10%, seções selecionadas de 30 s para 2 min de 10% O2 exposição (um intervalo de 90 s). Dentro desse intervalo, selecione apenas seções com respiração constante com volume constante de marés. Evite seções próximas aos movimentos do rato. A análise é confiável se pelo menos 10 s de hipóxia forem selecionadas em cada ciclo.
        Nota: O componente periférico do chemoreflex governado pela CB predomina durante o primeiro 1-2 min de exposição16,18,19. Durante a segunda fase, entre 2 min e 5 min de exposição hipóxica, componente periférico e central desempenham um papel. Finalmente, a terceira fase, > 5 min, é caracterizada pela hipoventilação (o fenômeno roll-off) governada predominantemente por quimioreceptores centrais. Nossa experiência mostra que os ratos são muitas vezes acordados durante a exposição hipóxico por causa dos interruptores manuais na fonte de fluxo de ar.
    4. Após a seleção, calcule a ventilação média minuto (VE)em condições normoxic e hipóxicas usando a fórmula VE = volume de maré da taxa respiratória X.
    5. Calcule o SpOmédio 2 em condições de normoxia e hipóxia.
    6. Calcule o HVR manualmente usando a fórmula HVR = (VE (10% O2) - VE (21%O2))/ (SpO2 (10% O2)- SpO2 (21% O2)).
      Nota: Em camundongos C57BL/6J, a bomba osmótica para infusão de leptina pode prejudicar a detecção precisa de sinal SpO2 pelo colar cervical. Neste caso, o HVR é calculado com base nos valores fio2 em condições normoxic e hipóxicas como HVR = ΔVE / ΔFiO211.

3. Carotid Body Denervation ou Carotid Sinus Nerve Dissection (CSND)

Nota: Realizamos denervação cirúrgica e química combinada com uma semana de diferença, porque a denervação cirúrgica por si só não abolia o chemoreflex hipóxico.

  1. Preparação cirúrgica
    1. Realize todos os procedimentos em camundongos C57BL/6J machos adultos. Esterilizar todos os instrumentos cirúrgicos. Use luvas cirúrgicas estéreis, seringas e aplicadores derrubados de algodão.
    2. Anestesie camundongos C57BL/6J masculinos com isoflurane de 1-2% usando um cone de nariz e coloque um cobertor quente para evitar a hipotermia. Isoflurane é cuidadosamente titificado para manter a taxa respiratória em 1 Hz (60 respirações / min). A adequação da anestesia antes do início das cirurgias será avaliada pela frequência respiratória, ausência de movimentos e ruídos sonoros, ausência de resposta a estímulos táteis e reflexo de retirada de pedal sapateado ou membro dianteiro.
    3. Administrar buprenorfina (0,05 mg/kg) intraperitoneally para evitar desconforto na dor. Retire o cabelo na região ventral do pescoço e desinfete a área com betadina e álcool.
    4. Para evitar a dessecação da córnea, lubrifique os olhos dos camundongos com pomada oftalmolámica estéril durante a anestesia.
  2. Procedimentos CSND
    Estágio 1: Denervação cirúrgica
    1. Após a incisão midline, expor a bifurcação das artérias carótidas comuns, removendo tecidos conjuntivos e tecido adiposo.
    2. Identifique o nervo hipoglossal, que geralmente é muito proeminente, e depois levantá-lo para expor o nervo glossofingeal imediatamente embaixo. Dissecar nervos do sinusia carótida bilateralmente usando micro tesouras de primavera.
    3. Feche a incisão com sutura de seda 6-0.
    4. Administrar 1 mL de saline normal subcutâneamente para evitar a desidratação.
    5. Abrigar os ratos em uma câmara de recuperação e monitorar seu comportamento a cada 15 min para inicial 1 h até que os ratos recuperar a consciência para manter recumbency sternal. Devolva os ratos para suas gaiolas domésticas depois que eles são totalmente recuperados. Continue monitorando os ratos duas vezes por dia para os próximos 3 dias. Dê buprenorfina adicional se os ratos mostrarem quaisquer sinais de dor (por exemplo, redução do apetite, inquietação).
      Estágio 2: Denervação química
    6. Uma semana após a cirurgia, pinte a artéria carótida com uma solução de 2% fenol diluído em etanol nos pontos de ramificação do nervo glossofingeal até o pólo craniano do CB. O mesmo cuidado post-operative deve ser fornecido após o denervation químico como descrito acima na seção cirúrgica do denervation.
      NOTA: Para um grupo de cirurgia simulada, os mesmos procedimentos são realizados, exceto a dissecação do nervo do sinuo carótido.
    7. Deixe os animais recuperar por 5-7 dias antes das medições de HVR.

4. Expressão de LepRb no CB usando um vetor adenoviral(Ad-LepRb) vs controle (Ad-LacZ)

  1. Ad-LepRb e suspensão Ad-LacZ
    1. Transfect os camundongos com adenovírus (Ad-LepRb-GFP, 2-5x1010 pfu/mL para superexpressão, Ad-Lacz, 1 x 1010 pfu/mL para controle) para a área cb.
    2. Descongele a matriz matrigel submergindo o frasco no gelo em uma geladeira de 4 °C durante a noite.
    3. Suspender suavemente o adenovírus na matriz líquida de Matrigel às 1:5 (1 μL da matriz Matrigel e 4 μL de adenovírus aplicados bilateralmente).
    4. Mantenha sempre a suspensão viral no gelo até que seja aplicado no CB.
  2. Preparação cirúrgica
    1. Use os mesmos instrumentos cirúrgicos do protocolo CSND.
    2. Anestesia LepRb-deficiente db/db ratos com 2-2,5% isoflurane usando um cone de nariz e coloque os animais em um cobertor quente para evitar a hipotermia. Isoflurane é cuidadosamente titificado para manter a taxa respiratória em 1 Hz (60 respirações / min). A adequação da anestesia será avaliada pela frequência respiratória, ausência de movimentos e ruídos sonoros, ausência de resposta a estímulos táteis e reflexo de retirada do pedal do membro anterior ou dos membros traseiros.
    3. Administrar buprenorfina (0,05 mg/kg) intraperitoneally.
    4. Retire o cabelo na região ventral do pescoço e desinfete a área com betadina e álcool como no protocolo CSND.
    5. Para evitar a dessecação da córnea, lubrifique os olhos dos camundongos com pomada oftalmolámica estéril durante a anestesia.
  3. Tratamento do Adenovírus do CB
    1. Expor CBs, conforme descrito no protocolo CSND e aplicar 5 μL da suspensão viral para a área cb bilateralmente.
    2. Espere 2-3 min até que a matriz matrigel líquido se torne um gel. Depois de confirmar que a suspensão viral foi congelada, feche a incisão com 6,0 sutura de seda.
  4. Após a cirurgia
    1. Abrigar os ratos em uma câmara de recuperação e monitorar seu comportamento a cada 15 min para inicial 1 h até que os ratos recuperar a consciência para manter recumbency sternal. Devolva os ratos para suas gaiolas domésticas depois que eles são totalmente recuperados. Continue monitorando os ratos duas vezes por dia para os próximos 3 dias. Dê buprenorfina adicional se os ratos mostrarem quaisquer sinais de dor (por exemplo, redução do apetite, inquietação).
    2. Administrar buprenorfina (0,05 mg/kg) intraperitoneally conforme necessário para evitar desconforto na dor durante o período pós-operatório.
    3. Medida HVR 9 dias após a transfecção do adenovírus.

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Resultados

A infusão contínua de leptina aumentou significativamente o HVR em camundongos C57BL/6J magros de 0,23 para 0,31 mL/min/g/ΔFiO2 (P < 0,001, Figura 2)11. A CSND aboliu o aumento induzido pela leptina no HVR (Figura 2),enquanto nenhum efeito atenuante do CSND no HVR foi observado em grupo de cirurgia simulada após a infusão de leptina.

Expressão de LepRb no CB de LepRb

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Discussão

O foco principal do nosso estudo foi examinar os efeitos respiratórios da sinalização de leptina no Cb. Vários protocolos foram desenvolvidos para avaliar o papel da leptina de forma mecanicista. Em primeiro lugar, a contribuição específica da TCc para o HVR foi analisada por quantificação cuidadosa do HVR durante os primeiros 2 min de exposição hipóxico. Em segundo lugar, a relevância da Cb na regulação up mediada pela leptina do controle da respiração foi examinada por duas abordagens complementares. Em camundongos mag...

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Divulgações

Os autores não têm interesses ou divulgações conflitantes.

Agradecimentos

R01HL138932, RO1HL133100, RO1HL128970, AHACDA34700025

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
1 mL de seringas de insulinaBD Biosciences309311
1x PBS (pH 7,4)Gibco10010-023500 ml
Ad-LaczDr. Christopher Rhodes (Universidade de Chicago)1 x 1010 pfu/mL
Ad-LepRb-GFPVector BiolabsADV-2633802-5 x 1010 pfu/mL
Carrinho anestésicoAtlantic Biomedical
BetadinePurdue Products Ltd.12496-0757-5
Buprenorfina (Buprenex)Reckitt Benckiser Healthcare Ltd.12496-0757-50,3 mg / mL
C57Bl / 6JJackson laboratório000664Ratos Cepa
Algodão Gaze EsponjasFisherbrand22-362-178
db / dbJackson laboratório000697Ratos Cepa
EtanolPharmco-AAPER111000200
IsofluranoVetone502017
Lab GráficoData Science International (DSI)Software
Matrigel MatrixBD Biosciences356234
Micro Spring ScissorsWorld Precision Instruments (WPI)14124
Mouse Ox PlusSTARR Life Sciences Corp.Software
Mouse Ox Plus Collar SensorSTARR Life Sciences Corp.015022-2Clipe de Colar Médio Especial 7"
Câmara de Pletismografia de Corpo Inteiro de CamundongoData Science International (DSI)PLY3211
Ohio Care Plus IncubadoraOhmedaHCHD000173
Tesoura OperacionalWorld Precision Instruments (WPI)501753-G
Bomba OsmóticaAlzet1003D1 μ L/h, 3 dias
FenolSigma-AldrichP4557
Proteína de leptina de camundongo recombinanteR& D systems498-OB-05M5 mg
SalinoRICCA Químico7210-160,9% Cloreto de Sódio
Sutura Cirúrgica EstérilDemeTechDT-639-1Seda, tamanho 6-0
TermômetroSoluções Inovadoras de Calibração (INNOCAL)EW 20250-91
Reta

Referências

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