Artigo de método
O objetivo deste método é obter matrizes 3D derivadas de fibroblasto como um andaime natural para ensaios celulares subsequentes. Os fibroblastos são semeados em uma placa de cultura pré-tratada e estimulados com ácido ascórbico para geração de matriz. As matrizes são descelularizadas e bloqueadas para a cultura de células relevantes (por exemplo, células endotélias).
A matriz extracelular (ECM) é um andaime tridimensional que atua como o principal suporte para as células nos tecidos. Além de sua função estrutural, o ECM também participa da migração celular, proliferação e diferenciação. Fibroblastos são o principal tipo de células modificando o arranjo de fibra e a produção de ECM. No câncer, os CAFs (fibroblastos associados ao câncer) estão em estado de ativação permanente, participando da remodelação do ECM, facilitando a migração de células tumorais e estimulando a angiogênese associada ao tumor, entre outros papéis pró-tumorigenic. O objetivo deste método é criar uma matriz tridimensional com uma composição de fibra semelhante às matrizes in vivo, utilizando fibroblastos imortalizados ou CAFs primários humanos. Os fibroblastos são cultivados em placas de cultura celular pré-tratadas e cultivados estimulação de ácido ascórbico. Em seguida, os fibroblastos são removidos e matrizes são bloqueadas para semeadura celular. Neste modelo De ECM, os fibroblastos podem ser ativados ou modificados para gerar diferentes tipos de matriz, cujos efeitos podem ser estudados na cultura celular. As matrizes 3D também são moldadas por sinais celulares, como degradação ou enzimas que ligam cruzadas que podem modificar a distribuição de fibras. Neste contexto, a angiogênese pode ser estudada, juntamente com outros tipos de células, como células tumorais epiteliais.
A matriz extracelular (ECM) é uma estrutura dinâmica presente em todos os tipos de tecido. Consiste em proteínas e polissacarídeos que criam uma rede de fibras cruciais para a adesão celular, migração e comunicação1. A composição de ECM varia dependendo do tecido. Enquanto o colágeno tipo-I é a proteína estrutural mais prevalente, os tipos de colágeno II, III, V e XI também podem ser encontrados em vários tecidos2. Fibronectina gerada por fibroblastos é necessária para a adesão celular2. Além disso, existem outras moléculas estruturais como elastina, laminina e receptores de superfície chamados in....
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Amostras de tecido humano foram obtidas com a aprovação do Conselho de Ética de Pesquisa do Hospital Ramón y Cajal, Madrid.
1. Preparação de Soluções
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Os fibroblastos estimulados pdgf-bb criam um ECM mais espesso. Herrera et al. mostraram como os fibroblastos estimulados pelo PDGF geraram uma matriz mais espessa, bem como maior orientação defibras 7. Os fibroblastos BJ-hTERT foram incubados com ou sem PDGF e áreas representativas observadas mostraram uma distribuição celular mais alinhada em matrizes produzidas pelo fibroblasto estimulado pelo PDGF (Figura 1a). A exp.......
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Matrizes podem ser geradas com fibroblastos imortalizados ou culturas fibroblastprimárias. Fibroblastos são fáceis de manter na cultura in vitro com uma alta taxa de crescimento e resistência ao estresse. Podem mesmo ser isolados do tecido post-mortem3,embora a contaminação poderia ser uma limitação, dependendo da origem do tecido.
O modelo 3D-matrix aqui oferece um sistema novo e eficaz para estudar com sucesso a composição e a orientação da fibra de ECM. Também é adeq.......
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Os autores declaram nenhum conflito de interesses.
O desenvolvimento deste protocolo contou com o apoio do PI12/02037, PI15/02101, PI17/01847, PI18/01034 e RD12/0036/0041 do Instituto de Salud Carlos III; pelo Fondo Europeo de Desarrollo Regional (FEDER); por "CIBER de Cáncer", CB16/12/00273 e CB16/12/00446, do Instituto de Salud Carlos III-FEDER; e pela Fundación Científica AECC (uma abordagem multifacetada para atingir o câncer de pâncreas). Cristina Peña é beneficiária de um Contrato Miguel Servet do Instituto de Salud Carlos III. M. Eaude ajudou com o texto em inglês. Agradecemos aos membros do laboratório por ajuda e conselhos ao longo desta pesquisa.
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| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Hidróxido de amônio (NH4OH) | Roth | A990.1 | |
| Anfotericina | Corning | 30-003-CF | |
| Albumina de soro bovino (BSA) | Sigma | A7906-50G | |
| Meio de águia modificado de Dulbecco (DMEM) | Corning | 10-014-CVR | |
| Meio basal endotelial (EBM) | Lonza | CC-3121 | adicionar suplementos antes de usar |
| Suplementos de Meio Basal de Células Endoteliais (EGM-2) | Lonza | CC-4176 | |
| Etanolamina | Sigma | 411000-100ML | |
| Soro Bovino Fetal (FBS) | Biowest | S181B-500 | inativado por calor antes do uso |
| Crescimento de Fibroblastos Meio Basal (FBM) | Lonza | CC-3131 | adicionar suplementos antes de usar |
| Suplementos e fatores de crescimento do meio de crescimento do fibroblasto (FGM-2) | Gelatina de Lonza | CC-4126 | |
| da pele bovina | Sigma | G9391-100G | |
| Glutaraldeído | Sigma | g5882 | |
| Ácido L-ascórbico | Sigma | A92902-100G | luz - |
| L-Glutamina | Lonza | BE17-605E | |
| Normocin | Invivogen | 3ANT-NR-2 | |
| Pencillin/Streptomycin (Pen/Strep) | Gibco | 15140122 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Corning | 21-040-CVR | |
| Triton X100 | Roth | 3051 | |
| Telomerase recombinante transfectada imortalizada fibroblastos de prepúcio humano (BJ-hTERT) | ATCC | ATCC CRL-4001 | |
| Veia umbilical humana células endoteliais (HUVECs) | ATCC | PCS-100-013 |
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