Artigo de método

Comparando modelo de carcinoma de célula séuológica metastática clara estabelecida no rim do rato e na membrana chorioallantoico de frango

8.6K vistas

⸱

DOI:

10.3791/60314

⸱

8 de fevereiro de 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular and Medical Pharmacology, David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles, 2Department of Molecular, Cell, and Developmental Biology, University of California, Los Angeles, 3Department of Bioengineering, Hanyang University, 4Department of Ecology and Evolutionary Biology, University of California, Los Angeles, 5Department of Microbiology, Immunology, and Molecular Genetics, University of California, Los Angeles, 6School of Life Sciences, Beijing Normal University, 7Department of Urology, West China Hospital, Sichuan University, 8Department of Urology, David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Carcinoma de células renais metastáticas claras é uma doença sem um modelo animal abrangente para investigação pré-clínica completa. Este protocolo ilustra dois novos modelos animais para a doença: o modelo de camundongo sutópicamente implantado e o modelo de membrana chorioallantoico de frango, ambos demonstram metástase pulmonar semelhante a casos clínicos.

Resumo

Carcinoma de células renais metastáticas (CCCc) é o subtipo mais comum de câncer renal. CcRCC localizado tem um resultado cirúrgico favorável. No entanto, um terço dos pacientes com CCCc desenvolverá metástases no pulmão, o que está relacionado a um desfecho muito ruim para os pacientes. Infelizmente, nenhuma terapia está disponível para este estágio mortal, porque o mecanismo molecular da metástase permanece desconhecido. Sabe-se há 25 anos que a perda de função do gene supressor de tumor von Hippel-Lindau (VHL) é pathognomonic do CCRCC. No entanto, nenhum modelo de camundongo transgênico clinicamente relevante de CCRCC foi gerado. O objetivo deste protocolo é introduzir e comparar dois modelos animais recém-estabelecidos para ccRCC metastático. A primeira é a implantação renal no modelo do mouse. Em nosso laboratório, o sistema de edição de genes CRISPR foi utilizado para derrubar o gene VHL em várias linhas celulares RCC. A implantação ortotópica de populações heterogêneas de CCRCC para a cápsula renal criou novos modelos ccRCC que desenvolvem metástases pulmonares robustos em camundongos imunocompetentes. O segundo modelo é o sistema de membrana chorioallantoico de frango (CAM). Em comparação com o modelo do mouse, este modelo é mais tempo, mão-de-obra e custo-eficiente. Este modelo também suportava formação e intravasão tumoral robustas. Devido ao curto período de 10 dias de crescimento tumoral em CAM, nenhuma metástase foi observada pela imunohistoquímica (IHC) nos tecidos de embriões coletados. No entanto, quando o crescimento do tumor foi estendido por duas semanas no frango eclodido, as lesões de ccRCC micrometastáticos foram observadas pelo IHC nos pulmões. Esses dois novos modelos pré-clínicos serão úteis para estudar melhor o mecanismo molecular por trás da metástase, bem como para estabelecer novos xenoenxertos derivados do paciente (PDXs) para o desenvolvimento de novos tratamentos para ccRCC metastático.

Introdução

O carcinoma de células renais (RCC) é o7º câncer mais comum nos Estados Unidos. Anualmente, estima-se que 74.000 americanos sejam diagnosticados recentemente, representando mais de 14.000 mortes (o subtipo histológico de células claras, ou CCRCC, é o subtipo mais comum, representando aproximadamente 80% dos casos de RCC. Pacientes com malignidade localizada são tratados com nefrectomia e têm uma taxa de sobrevivência favorável de 5 anos de 73%1. No entanto, 25%-30% dos pacientes desenvolvem metástases distantes para órgãos vitais, como os pulmões, resultando em uma baixa sobrevida média de 13 meses e 5 anos de sobrevivência de apenas 11%1,2,3. É necessária uma compreensão adicional do mecanismo metastático para melhorar o resultado mortal para ccRCC metastático.

A perda do gene supressor do tumor VHL é uma lesão genética marcante observada na maioria dos casos de CCRCC humano4,5,6,7. No entanto, o mecanismo oncogênico preciso da perda de VHL no CCRCC é desconhecido. Além disso, o status de expressão VHL não é preditivo do resultado no CCRCC8. Notavelmente, apesar de inúmeras tentativas de nocaute de VHL alvo renal-epitelial, os cientistas falharam em gerar anormalidade renal além das lesões císticas pré-neoplásticas observadas em camundongos9, mesmo quando combinadas com a exclusão de outros supressores tumorais como PTEN e p5310. Esses achados apoiam a ideia de que a perda de VHL por si só é insuficiente para tumorigênese ou a metástase espontânea subsequente.

Recentemente, nosso laboratório criou uma nova linha de células VHL knockout (VHL-KO) usando a exclusão mediada CRISPR/Cas9 do gene VHL na linha de células murine VHL+ ccRCC (RENCA, ou VHL-WT)11,12. Mostramos que vhl-ko não é apenas mesenquimal, mas também promove transição epitelial para mesonquimal (EMT) das células VHL-WT12. A EMT é conhecida por desempenhar um papel importante no processo metastático13. Nosso trabalho mostrou ainda que a metástase pulmonar distante ocorre apenas com a co-implantação de células VHL-KO e VHL-WT no rim, apoiando um mecanismo cooperativo de metástase. É importante ressaltar que nosso modelo VHL-KO e VHL-WT implantados ortotópicos leva a metástases pulmonares robustas, recapitulando os casos clínicos de CCRCC. Este modelo ccRCC metastático espontâneo compensa a falta de um modelo de camundongo metastático transgênico, especialmente no desenvolvimento de novas drogas antimetástas. Este protocolo demonstra a implantação da cápsula renal das populações de células heterogêneas de células RENCA geneticadas.

Os modelos chicken CAM têm uma longa história em pesquisa para angiogênese e biologia tumoral devido às suas inúmeras vantagens, conforme resumido na Tabela114,15,16,17,18. Resumidamente, a janela de tempo para o crescimento do tumor CAM é curta, permitindo um máximo de 11 dias até que a CAM seja destruída após a eclosão do frango16. Apesar do curto tempo de crescimento, o rico fornecimento de nutrição e o estado imunodeficiente do embrião de frango permitem enenxerto tumoral muito eficiente16,19,20,21. Finalmente, o custo de cada óvulo fertilizado é de ~$1, em comparação com mais de US $ 100 para um mouse SCID. Juntos, o modelo CAM pode servir como um valioso modelo animal alternativo na criação de novos PDXs a uma grande economia no tempo e custo em comparação com o mouse. Neste protocolo, avaliamos se o modelo foi capaz de recapitular a biologia do ccRCC metastático observado no modelo ortotópico do camundongo.

(SCID) MouseCamNota
Custo>$100 cada~$1 cadaViabilidade variando de 50 a 75%
Necessidade de moradia de barreirasSimNãoReduz ainda o custo e simplifica o monitoramento em série dos tumores
Tumor diretamente visívelNãoSimFigura 3A
Hora do primeiro enenxerto (RENCA)2 semanas2-4 diasárbitro 14, 15
Ponto final do crescimento (RENCA)3-6 semanas10 diasárbitro 14, 15
Metástase (RENCA) observadaSimSim, em pintinhos.Figura 3D
Passagens em sérieSimSimref 16-18
Passagem para ratos (RENCA)SimSimHu, J., et al. revisão (2019)
Manter a heterogeneidade tumoralSimSimHu, J., et al. revisão (2019)

Tabela 1: Vantagens e limitações dos modelos mouse e CAM. Esta tabela compara os dois modelos por suas vantagens e limitações em termos de tempo, custo, mão-de-obra, bem como a biologia. O modelo CAM tem vantagens em eficiência, mas também tem suas próprias limitações únicas devido à diferente morfologia entre aves e mamíferos. Por isso, é importante confirmar que o modelo pode reter a biologia dos xenoenxertos.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Protocolo

Todos os métodos aqui descritos foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC), designado como Comitê de Pesquisa Animal (ARC) (ARC 2002-049-53 e ARC 2017-102-01A). O protocolo 2002-049-53 é otimizado para a implantação de células tumorais ccRCC na cápsula renal de camundongos Nus ou BALB/c. Experimentos de implantação de tumores em ovos de frango fertilizados antes da eclosão não exigem aprovação do IACUC. Para estender o tempo para o estabelecimento da metástase pulmonar, os embriões com tumor CAM são autorizados a eclodir e crescer em galinhas. O protocolo 2017-102-01A abrange esses experimentos animais.

1. Estudos tumorais ortotópicos em camundongos

NOTA: A linha do tempo para este experimento é mostrada na Figura 1A. Esses procedimentos foram adaptados das publicações anteriores11,12.

  1. Preparando suspensão celular única para enxerto
    1. Desconecte as células RENCA VHL-WT e VHL-KO dos pratos culturais usando trippsina/EDTA.
    2. Conte as células com hemocímetro e resuspenda em uma mistura pré-refrigerada 1:1 de PBS e solução de matriz extracelular a uma concentração de 1 x 105 células/μL.
      NOTA: Use uma proporção 1:4 de células VHL-WT:VHL-KO para implantes heterogêneos e VHL-WT sozinho para implantes homogêneos.
    3. Transfira as células resuspensas para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL e mantenha o gelo até a implantação.
  2. Implantação para cápsula renal
    1. Anestesia: Pré-aqueça uma almofada quente a 37 °C e cubra-a com um pedaço de cortina estéril grossa. Anestesiar o mouse por inalação de isoflurano através de uma câmara de indução ou injeção intraperitoneal (IP) de 1% de sódio pentobarbital na dosagem de 10 mL/kg.
    2. Raspe o cabelo do local cirúrgico. Este passo pode ser ignorado para ratos nus.
    3. Desinfecção e draping cirúrgica: Desinfete a parte de trás do camundongo inteiramente com povido-iodo 3x seguido de 70% de etanol 1x e limpe-o com cotonetes de algodão estéreis. Em seguida, aplique três curativos médicos estéreis sequencialmente, cobrindo toda a parte traseira, a fim de criar um campo cirúrgico, bem como imobilizar o camundongo.
    4. Incisão e exteriorização renal: Antes da operação, desinfete os dedos do operador com povido-iodo ou use um par de luvas estéreis. Coloque o mouse na posição propensa e use os dedos para localizar o rim esquerdo bem debaixo do flanco esquerdo. Use um par de fórceps e tesouras sem cortes para cortar a pele aberta e a camada muscular o local especificado. Use cotonetes e fórceps de algodão estéreis para externar parcialmente o rim esquerdo do abdômen.
    5. Implantação de células tumorais: Carregue a suspensão celular preparada na etapa 1.1 em seringas de insulina ou seringas Hamilton personalizadas (consulte Tabela de Materiais para especificações). Injete 20 μL de células resuspensas a cápsula renal.
      NOTA: A injeção bem sucedida é determinada pela formação de uma protuberância translúcida na superfície do rim. A injeção acidental no parenchyma renal resulta em sangramento e uma taxa de mortalidade pós-operatória de até 90% devido à hemorragia fatal no local da injeção.
    6. Retire lentamente a agulha para permitir que a solução de matriz extracelular se solidifique e evite hemorragia ou vazamento de células tumorais. Então, usando um cotonete de algodão estéril, empurre o rim de volta para o abdômen.
    7. Costura da ferida: Use uma sutura VICTRYL revestida 5-0 para costurar a camada muscular. Desinfete a pele com povido-iodo uma vez e feche a pele com autoclipes de ferida.
    8. Recuperação: Coloque o mouse na almofada quente até acordar. Se o rato foi anestesiado por inalação, retire o isoflurano e mantenha o mouse na almofada quente até que esteja acordado.
  3. Imagens de bioluminescência (BLI) e coleta de tecidos
    1. Seis semanas após a implantação do tumor, tire imagens bli baseadas em vagalume-luciferase. Em seguida, eutanize camundongos com inalação isoflurano seguido de luxação cervical.
    2. Coletar sangue para detecção de células tumorais circulantes (CTC) por citometria de fluxo.
    3. Colher tumor e órgãos de interesse (rins, pulmões, fígado, intestinos e baço) usando uma técnica de colheita de tecido estéril22. Fixá-los em 4% paraformaldeído durante a noite para incorporação de cera de parafina.

2. Modelo de xenoenxerto tumor cam

NOTA: Esses procedimentos foram adaptados e modificados dos protocolos publicados anteriormente23,24. A linha do tempo para este procedimento é mostrada na Figura 1B. Este artigo apresenta apenas o protocolo simplificado. Para protocolos detalhados, consulte outro artigo da JoVE publicado pelo nosso grupo25.

  1. Preincubação: Incubar ovos de frango recém-colocados e fertilizados em uma incubadora de ovos rotativos a 37 °C e 55-65% de umidade por 7 dias.
  2. Solte o CAM e abra a janela (dia 7 de desenvolvimento):
    1. Localize e marque o saco de ar e veias.
      NOTA: Geralmente 10-15% dos ovos são removidos porque são inférteis ou morrem dentro de 7 dias após a fertilização.
    2. Crie um novo saco de ar em cima de uma veia marcada.
    3. Delineie o novo saco de ar, aplique fita adesiva e coloque os ovos de volta na incubadora.
      NOTA: O procedimento pode ser pausado aqui. Recomenda-se retomar os procedimentos no mesmo dia porque o saco de ar pode se mover.
    4. Abra uma janela: Usando um par de tesouras de microdissetamento curva e um par de fórceps de ponta de agulha, corte uma janela circular de 1,5 x 1,5 cm na concha.
      NOTA: A interrupção da CAM é indicada pelo sangue e um pedaço de CAM presente na peça de casca cortada.
    5. Sele o orifício com curativo médico transparente e coloque os ovos em uma incubadora estacionária a 37 °C e 55%-65% de umidade.
      NOTA: Use a mesma incubadora de ovos da etapa 2.1. Desligue o rotator para torná-lo parado.
  3. Verificação de saúde (dia 9 de desenvolvimento): Remova ovos mortos e, em seguida, agrupar aleatoriamente o resto dos óvulos para implantação celular tumoral.
    NOTA: Idealmente, a taxa de sobrevivência neste momento é de aproximadamente 80% do dia 0 do desenvolvimento.
  4. Enxertando as células tumorais na CAM recém-exposta (dia 10 de desenvolvimento)
    1. Diluir a solução de matriz extracelular em dobro do volume de RPMI pré-refrigerado 1640 (com L-glutamina). Desajuste as células RENCA e resuspenda na solução acima para alcançar uma concentração de 2 x 104 células/μL.
      NOTA: Use uma proporção 1:1 de células VHL-WT:VHL-KO para implantes heterogêneos e VHL-WT sozinho para implantação homogênea.
    2. Para pré-solidificar a suspensão celular, preencha 100 μL de cada mistura de célulaem 200 μL e coloque-as em uma incubadora celular por 15 min.
    3. Implante 100 μL de suspensão celular para cada ovo na superfície CAM através da janela.
      NOTA: Alguns protocolos requerem arranhar a CAM antes da implantação23. Isso não é necessário para as células RENCA, porque elas crescem muito rapidamente.
  5. Cresça células na CAM por 10 dias e fotografe a cada 2 dias.
  6. Eutanizar e colher o tumor, sangue e órgãos.
    1. No dia 20 (dia 10 do tumor), coleto sangue através da veia chorioallantoic com uma seringa heparinizada de 10 mL.
    2. Eutanize os embriões colocando-os no gelo por 15 min.
    3. Colher e pesar tumores. Disseceu pulmões e fígados usando uma técnica de colheita de tecido estéril semelhante à usada para camundongos22.
      NOTA: Fígados de galinhas têm dois lóbulos, que são os primeiros órgãos vistos na cavidade abdominal. Não confunda isso com os pulmões. Os pulmões de frango estão localizados o coração e o septo26. A coleção bem sucedida dos pulmões pode ser confirmada por costelas expostas.
    4. Conserte os tumores e os órgãos dissecados em 4% paraformaldeído durante a noite para incorporação de cera de parafina.
  7. Ecloda magalhada as galinhas.
    1. Para permitir um longo período de crescimento tumoral, continue a incubação até o dia 21 e deixe as galinhas eclodirem a 37 °C e pelo menos 60% de umidade.
      NOTA: As galinhas naturalmente eclodem após o dia 21 durante um período de 24 horas, mas ocasionalmente têm problemas para eclodir sozinhos. Neste caso, quebrar as cascas de ovos alguns ajuda. É importante que as galinhas completem o processo de eclosão dentro de 24 h porque morrerão por falta de nutrientes depois disso.
    2. Cultivar as galinhas em uma instalação animal (2017-102-01A) por 2 semanas.
    3. No dia 34 (dia 24 do tumor), eutaniza os filhotes com inalação de isoflurano seguido de luxação cervical.
    4. Disseceu os pulmões usando uma técnica de colheita de tecido estéril semelhante às usadas para camundongos22. Em seguida, fixá-los em 4% paraformaldeído durante a noite para incorporação de cera de parafina.

3. Imunohistoquímica

NOTA: Toda secção de tecidos e coloração de H&E foi feita pelo Laboratório de Patologia Translacional (TPCL) da Universidade da Califórnia, Los Angeles.

  1. Asse slides a 65 °C por 20 min e deparafina 3x usando xileno e reidrate em série de 100% de etanol para água.
  2. Recupere os antígenos em um tampão de ceítra fervido em um vapor vegetal por 25 min.
  3. Aplique 1% de BSA para bloqueio. Em seguida, aplique os anticorpos primários (anti-VHL, anti-HA, anti-bandeira) preparados a uma razão de diluição de 1:200 em PBS. Incubar durante a noite a 4°C.
  4. Depois de lavar 3x com TBST (7 min cada), incuba slides com o anticorpo secundário às 1:200 diluição. Lave 3x com TBST (7 min cada) e aplique reagentes DAB seguidos de contracoloração de hematoxylin.

4. Citometria de fluxo

  1. Processe o mouse ou o sangue do frango com tampão de lise de glóbulo vermelho (RBC) de acordo com o protocolo do fabricante.
    NOTA: A lise rbc suficiente é especialmente importante ao analisar o sangue CAM porque os RBCs de frango são nucleados e não podem ser facilmente distinguidos em citometria de fluxo usando a dispersão para frente e lateral.
  2. Execute a citometria do fluxo no lysato sanguíneo e analise os dados para expressão de mStrawberry e EGFP.
  3. Coloque os portões primários baseados na dispersão dianteira e lateral, excluindo detritos, células mortas e RBCs insacidos.
  4. Coloque os portões de fluorescência baseados nas amostras não manchadas e controles manchados únicos. Use lysate de sangue preparado com vhl-WT, VHL-KO ou células RENCA não rotuladas como controles manchados únicos e controles não manchados, respectivamente.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Resultados

Cada experimento foi realizado pelo menos 3x, a menos que seja declarado de outra forma. Os dados são apresentados como média ± desvio padrão (DP). O significado foi determinado por um teste T do aluno quando havia dois grupos ou por uma ANOVA unidirecional quando havia três ou mais grupos. Um corte de valor P de 0,05 foi usado para estabelecer significado.

As células RENCA implantadas com ortotópico cresceram com sucesso nos ri...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Discussão

Para muitos pacientes com malignidades epiteliais, a metástase a órgãos vitais é a principal causa de mortalidade. Portanto, é essencial encontrar o mecanismo subjacente e uma nova via de terapia para doenças metastáticas. Infelizmente, há falta de modelos animais ccRCC metastáticos relevantes. O desafio em grande parte deve-se à incapacidade de recriar ccRCC em camundongos, apesar da geração de numerosos modelos de mouse nocaute VHL alvo transgênicos9,10. Aqui, ...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Divulgações

Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

Este trabalho foi financiado pela concessão de sementes UCLA JCCC, concessão ucla 3R, UCLA CTSI e UC TRDRP (LW). Agradecemos ao Centro de Imagens Pré-Clínicas do Instituto Crump, ao TPCL e ao Departamento de Medicina Animal Laboratorial (DLAM) da UCLA por sua ajuda com métodos experimentais. A citometria de fluxo foi realizada no Centro abrangente de Câncer (JCCC) da UCLA Johnson e no Centro de Citometria de Fluxo de Pesquisa da AIDS da UCLA, que é apoiado pelos prêmios P30 CA016042 e 5P30 AI028697, e pelo JCCC, o Instituto de Aids da UCLA, a Escola de Medicina David Geffen da UCLA, o Escritório do Chanceler da UCLA e o Escritório de Pesquisa do Vice-Chanceler da UCLA. Os serviços de consultoria estatística e análise de dados foram fornecidos pelo Programa de Bioestatística, Epidemiologia e Design de Pesquisa (BERD) da UCLA, que é apoiado pelo NIH/National Center for Advanceing Translational Science UCLA CTSI Grant Number UL1TR001881.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
0,25% de tripsina, 0,1% de EDTA em HBSS sem bicarbonato de cálcio, magnésio e sódioCorning25053CI
8050-N/18 Micro 8V Max Tool KitDremel8050-N/18
anticorpo anti-VHLAbcamab135576
BD Lo-Dose U-100 Seringas de insulinaBD Biosciences14-826-79
BD Pharm LyseBD Biosciences
BDGeneral Use and PrecisionGlide Agulhas HipodérmicasFisher Scientific14-826-5D
DAB Kit de CromogênioBiocare MedicalDB801R
D-Luciferina Firefly, sal de potássioGoldbioLUCK-1G
DPBS sem Cálcio e MagnésioGibcoLS14190250
DYKDDDDK Tag Anticorpo Monoclonal (FG4R)eBioscience14-6681-82
Cilindros de Prova de Etanol 200Gerenciamento43196-11Prepare 70% em água
Soro Fetal Bovino, Qualificado, Aprovado pelo USDA RegiõesFisher Scientific10-437-028
Tesoura de Dissecação de Ponta Afiada Fisherbrand FisherScientific08-940
Bolas de Algodão Estéril FisherbrandFisher Scientific22-456-885
Pinça/Fórceps de Ponta Ultra Fina Reta de Alta Precisão da Marca FisherScientific12-000-122
FisherbrandPremium Tubos de Microcentrífuga: 1.5mLFisher Scientific05-408-129
Formaldeído Soln., 4%, Tamponado, pH 6.9 (aprox. 10% Formalina soln.), Para HistologiaMilliporeSigma1.00496.5000
Seringa personalizada HamiltonHamilton8040825 µ L, Modelo 702 SN, Calibre: 30, Estilo de Ponta: 4, Ângulo: 30, Comprimento da Agulha: 17 mm
HA-probe Anticorpo (Y-11)Santa Cruz Biotechnologysc805
HemocitômetroHausser Scientific3100
Hovabator Genesis 1588 Deluxe Kit ComboIncubadora de Ovos Incubadora ArmazémHB1588D
Solução de Isotesia (Isoflurano)Henry Schein Animal Health1169567762
Sistema de Imagem In Vivo IVIS Lumina IIPerkin Elmer
Matrigel GFR Membrane MatrixCorningC354230
Medline Surgical Instrument Drape, Clear Adhesive, 24" x 18"Medex SupplyMED-DYNJSD2158
OmniPur BSA, Fraction V [Bovine Serum Albumin] Isolamento de Choque TérmicoMilliporeSigma2910-25GM
Solução de Penicilina-Estreptomicina, 100X, 10.000 UI Penicilina, 10.000ug/mL EstreptomicinaFisher ScientificMT-30-002-CI
Pentobarbital SódioSigma Aldrich57-33-0Prepare 1% em solução salina
Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch Laboratories115-035-062
Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch Laboratories111-035-045
Solução de iodopovidona USP, 10% (p/v), 1% (p/v) Iodo disponível, para uso laboratorialRicca Chemical395516
pSicoRAddgene11579
Cloridrato de puromicina hidratado, 99%, ACROS OrganicsFisher ScientificAC227420500
RencaATCCCRL-2947
RPMI 1640 Médio (Mod.) 1X com L-GlutaminaCorning10040CV
Placas Não Saias de 96 Poços da Scientific, Perfil BaixoFisher ScientificAB-0700
Pontas de Barreira de Precisão SHARP, Para P-200, 200 µ l, 960 (10 racks de 96)Fita deThomas Scientific1159M40
, Multiuso, 1.89" x 109.4 Yd., Tan, Pacote de 6 Rolos de Suturade 220717
EthiconJ385H
Tegaderm Curativo Transparente Estilo Original da Moldura 2 3/8" x 2 3/4"Almofada Aquecida Moore Medical1634
Thermo-ChickenK& H manufacturing1000
Tygon Clear Laboratory Tubing - 1/4 x 3/8 x 1/16 parede (50 pés)TygonAACUN017
nocaute mediado por VHL-KOCRISPR/Cas9 de VHL, então marcado lentiviralmente com EGFP marcado com bandeira e luciferase de vaga-lume
VHL-WTLentiviralmente marcado com proteína fluorescente mStrawberry marcada com HA e luciferase
de vaga-lumeInstrumento de Precisão Mundial FORCEPS IRIS 10CM CVD SERRFisher Scientific50-822-331
Kit de autoclipes de feridaBraintree scientific, inc.Kit
Xilenos (Histológico), Fisher ChemicalFisher ScientificX3S-4
555899 de Envio Office DepotACS

Referências

  1. Cohen, H. T., McGovern, F. J. Renal-cell carcinoma. The New England Journal of Medicine. 353 (23), 2477-2490 (2005).
  2. Bianchi, M., et al. Distribution of metastatic sites in renal cell carcinoma: a population-based analysis. Annals of Oncology. 23 (4), 973-980 (2012).
  3. Hsieh, J. J., et al. Renal cell carcinoma. Nature Reviews Disease Primers. 3, 17009(2017).
  4. Foster, K., et al. Somatic mutations of the von Hippel-Lindau disease tumour suppressor gene in non-familial clear cell renal carcinoma. Human Molecular Genetics. 3, (1994).
  5. Young, A. C., et al. Analysis of VHL Gene Alterations and their Relationship to Clinical Parameters in Sporadic Conventional Renal Cell Carcinoma. Clinical Cancer Research. 15 (24), 7582-7592 (2009).
  6. Gossage, L., Eisen, T., Maher, E. R. VHL, the story of a tumour suppressor gene. Nature Reviews Cancer. 15 (1), 55-64 (2015).
  7. Sato, Y., et al. Integrated molecular analysis of clear-cell renal cell carcinoma. Nature Genetics. 45 (8), 860-867 (2013).
  8. Choueiri, T. K., et al. The role of aberrant VHL/HIF pathway elements in predicting clinical outcome to pazopanib therapy in patients with metastatic clear-cell renal cell carcinoma. Clinical Cancer Research. 19 (18), 5218-5226 (2013).
  9. Hsu, T. Complex cellular functions of the von Hippel-Lindau tumor suppressor gene: insights from model organisms. Oncogene. 31 (18), 2247-2257 (2012).
  10. Albers, J., et al. Combined mutation of Vhl and Trp53 causes renal cysts and tumours in mice. EMBO Molecular Medicine. 5 (6), 949-964 (2013).
  11. Schokrpur, S., et al. CRISPR-Mediated VHL Knockout Generates an Improved Model for Metastatic Renal Cell Carcinoma. Scientific Reports. 6, 29032(2016).
  12. Hu, J., et al. A Non-integrating Lentiviral Approach Overcomes Cas9-Induced Immune Rejection to Establish an Immunocompetent Metastatic Renal Cancer Model. Molecular Therapy Methods & Clinical Development. 9, 203-210 (2018).
  13. Heerboth, S., et al. EMT and tumor metastasis. Clinical and Translational Medicine. 4, 6(2015).
  14. DeBord, L. C., et al. The chick chorioallantoic membrane (CAM) as a versatile patient-derived xenograft (PDX) platform for precision medicine and preclinical research. American Journal of Cancer Research. 8 (8), 1642-1660 (2018).
  15. Hagedorn, M., et al. Accessing key steps of human tumor progression in vivo by using an avian embryo model. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (5), 1643-1648 (2005).
  16. Ribatti, D. The chick embryo chorioallantoic membrane as a model for tumor biology. Experimental Cell Research. 328 (2), 314-324 (2014).
  17. Ismail, M. S., et al. Photodynamic Therapy of Malignant Ovarian Tumours Cultivated on CAM. Lasers in Medical Science. 14 (2), 91-96 (1999).
  18. Kaufman, N., Kinney, T. D., Mason, E. J., Prieto, L. C. Maintenance of human neoplasm on the chick chorioallantoic membrane. The American Journal of Pathology. 32 (2), 271-285 (1956).
  19. Janse, E. M., Jeurissen, S. H. Ontogeny and function of two non-lymphoid cell populations in the chicken embryo. Immunobiology. 182 (5), 472-481 (1991).
  20. Leene, W., Duyzings, M. J., van Steeg, C. Lymphoid stem cell identification in the developing thymus and bursa of Fabricius of the chick. Zeitschrift fur Zellforschung und Mikroskopische Anatomie. 136 (4), 521-533 (1973).
  21. Solomon, J. B. Foetal and neonatal immunology (Frontiers of biology). 20, North-Holland Pub. Co. (1971).
  22. JoVE Science Education Database. Lab Animal Research. Sterile Tissue Harvest. , Journal of Visualized Experiments. Cambridge, MA. (2019).
  23. Palmer, T. D., Lewis, J., Zijlstra, A. Quantitative analysis of cancer metastasis using an avian embryo model. Journal of Visualized Experiments. (51), e2815(2011).
  24. Fergelot, P., et al. The experimental renal cell carcinoma model in the chick embryo. Angiogenesis. 16 (1), 181-194 (2013).
  25. Sharrow, A. C., Ishihara, M., Hu, J., Kim, I. H., Wu, L. Using the Chicken Chorioallantoic Membrane In Vivo Model to Study Gynecological and Urological Cancers. Journal of Visualized Experiments. , In Press (2019).
  26. Lőw, P., Molnár, K., Kriska, G. Atlas of Animal Anatomy and Histology. , 265-324 (2016).
  27. Hu, J., Ishihara, M., Chin, A. I., Wu, L. Establishment of xenografts of urological cancers on chicken chorioallantoic membrane (CAM) to study metastasis. Precision Clinical Medicine. 2 (3), 140-151 (2019).
  28. Casar, B., et al. In vivo cleaved CDCP1 promotes early tumor dissemination via complexing with activated beta1 integrin and induction of FAK/PI3K/Akt motility signaling. Oncogene. 33 (2), 255-268 (2014).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Reimpressões e permissões

Solicitar permissão para reutilizar o texto ou as figuras deste artigo JoVE

Solicitar permissão

Etiquetas

Implante Renal em CamundongoNocaute do Gene VHLImplante Tumoral Ortot picoAn lise de Met stase PulmonarContagem de C lulas Tumorais CirculantesDetec o por Imunohistoqu micaEdi o G nica por CRISPRXenotransplantes Derivados de Pacientes

Artigos relacionados