É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.

Artigo de método

Infecção por HIV crônica, aguda e reativada em modelos de camundongos imunodeficientes humanizados

10.3K visualizações

⸱

DOI:

10.3791/60315

⸱

3 de dezembro de 2019

 ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Human Virology, School of Medicine, University of Maryland, 2Grupo Inmunovirología, Facultad de Medicina, Universidad de Antioquia

Neste artigo

Resumo

Aqui estão três abordagens experimentais para estudar a dinâmica da infecção pelo HIV em camundongos humanizados. O primeiro permite o estudo de eventos de infecção crônica, enquanto os dois últimos permitem o estudo de eventos agudos após infecção primária ou reativação viral.

Resumo

Camundongosanulosos humanizados no nod/scid/il-2 receptor nulos recapitulam algumas características da imunidade humana, que podem ser exploradas em pesquisas básicas e pré-clínicas sobre doenças infecciosas. Aqui estão três modelos de camundongos imunodeficientes humanizados para estudar a dinâmica da infecção pelo HIV. O primeiro é baseado na injeção intrahepática de CD34+ células-tronco hematopoiéticas em camundongos recém-nascidos, o que permite a reconstituição de várias células confinadas no sangue e tecido linfóide, seguida de infecção por uma cepa de HIV de referência. Este modelo permite o monitoramento por até 36 semanas após a infecção e, portanto, é chamado de modelo crônico. O segundo e o terceiro modelos são referidos como os modelos agudos e de reativação, nos quais as células mononucleares periféricas do sangue são injetadas intraperitoneally em camundongos adultos. No modelo agudo, as células de um doador saudável são enxertadas através da rota intraperitoneal, seguidas de infecção por uma cepa de HIV de referência. Finalmente, no modelo de reativação, as células de um doador infectado pelo HIV terapia antirretroviral são enxertadas através da rota intraperitoneal. Neste caso, um ambiente livre de drogas no mouse permite a reativação do vírus e um aumento na carga viral. Os protocolos aqui fornecidos descrevem a abordagem experimental convencional para modelos de camundongos humanizados e imunodeficientes da infecção pelo HIV.

Introdução

O modelo humanizado de camundongos nod/SCID/interleucina (IL)-2 receptor diminuidor (doravante referido como huNS γ-cadeianulo)modelo de camundongo tem sido amplamente utilizado para estudar a patogênese de infecções, autoimunidade e câncer, bem como para estudos pré-clínicos de drogas e terapias baseadas em células humanas1,2. Estes camundongos são baseados em um fundo diabético não obeso (NOD), com a mutação cidacada e mutação direcionada no locus il-2 receptor matador-cadeia (massa de turma comum de turma t-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15 e IL-21), que induzem um grave prejuízo no desenvolvimento de células t-, b-e-assassino natural (NK) do ratoT-,B-e natural (NK) . Assim, eles suportam o enxerto de tecido humano, CD34 humano+ células-tronco hematopoiéticas (HSCs), e células mononucleares do sangue periférico humano (PBMCs)3,4,5. Além disso, a expressão transgênica de fatores hematopoiéticos humanos, como fator de células-tronco (SCF), fator estimulante da colônia de granulócitos/macrófagos (GM-CSF) e IL-3 promove o enxerto das populações mieloides humanas6,7,8.

Para estudos de HIV, vários modelos de camundongosnulos da cadeia de metodos huNS foram descritos, que diferem na cepa do camundongo, tipo de células humanas usadas, tipo de tecidos para o enxerto e origem das células (ou seja, saudável vs. Doador infectado pelo HIV)9,10. A cepa original, no entanto, é amplamente utilizada devido aos altos níveis de enxerto de células humanas e replicação viral após a infecção com uma referência da cepa HIV11,12,13. Cepas de camundongos imunodeficientes semelhantes com expressão transgênica de fatores hematopoiéticos humanos (por exemplo, RATOS NOG-EXL ou NSG-SGM3) ou com implantes de tecidos do fígado humano e do timo (camundongos de medula óssea-fígado-timo [BLT]) são úteis para avaliar o papel das populações mieloides na resposta imune anti-HIV, efeitos do HIV nesses tecidos e sua participação como reservatórios virais14,15. Além disso, algumas cepas com expressão transgênica de moléculas de antígeno leukócito humano (HLA), bem como camundongos BLT, podem ser usadas para estudar a resposta das células T à infecção pelo HIV16,17.

Em geral, nesses camundongos, a humanização depende da origem celular, da rota de entrega (intraperitoneal, intrahepática, intravenosa, intracardiac) e da idade do rato no momento do enxerto18,19,20. Em relação à origem celular, CD34+ HSC humano derivado de sangue do cordão umbilical, fígado fetal ou sangue periférico mobilizado pode ser injetado em camundongos recém-nascidos ou jovens3,21. Além disso, camundongosnulos adultos da cadeia de γ podem ser humanizados pela injeção de PBMC (aqui, referido como camundongosnulos da cadeia de metodolses de cadeia de metodolses hu-PBL-NS), permitindo a circulação temporal dessas células no sangue, órgãos linfoidos secundários e tecidos inflamados22,23,24.

Descrito aqui é um protocolo detalhado para o estabelecimento de modelos de camundongosnulos da cadeia de metodos huNS para o estudo da infecção pelo HIV. O primeiro é o modelo crônico, em que cd34 humanos+ HSCs derivados do sangue do cordão umbilical de um doador saudável são injetados em camundongos recém-nascidos, seguido de infecção com uma cepa de REFERÊNCIA HIV após 14 semanas de reconstituição do sistema imunológico humano. Este modelo permite a monitoração dos ratos por até ~36 semanas após a infecção. O segundo modelo é um modelo agudo, no qual pbmcs derivados de um doador saudável são injetados em adultos ns- cadeia de ratosnulos, seguido por infecção com uma referência da estirpe de HIV após 3 semanas de expansão de células T humanas no mouse. Finalmente, o terceiro modelo é o modelo de reativação, no qual os PBMCs derivados de um doador infectado pelo HIV terapia antirretroviral supressiva (TARV) são injetados em camundongosnulos adultos da cadeia de metodols. Neste caso, um ambiente livre de drogas permite a reativação viral e aumento da carga viral. Os dois últimos modelos permitem o monitoramento por até ~9 semanas após o enxerto.

No geral, esses três modelos são úteis para estudos virológicos, estudos pré-clínicos de novos medicamentos e avaliação dos efeitos da infecção pelo HIV na resposta imune global. Também é importante considerar que o uso de camundongos humanizados infectados pelo HIV requer revisão e aprovação pelo Comitê Institucional de Biossegurança (IBC), bem como pelo Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) antes de qualquer experimento. Isso garante que o estudo siga todas as regulamentações institucionais internas e externas para o uso de material biológico perigoso e manuseio humano de animais experimentais.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Protocolo

Neste trabalho, todos os cuidados e procedimentos para animais foram realizados de acordo com protocolos revisados e aprovados pelo Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) da Faculdade de Medicina da Universidade de Maryland (números de protocolo 1018017, 1018018 e 0318009).

1. Enxertia humana de CD34+ HSC de camundongos recém-nascidos

  1. Use sempre o equipamento de proteção pessoal descartável (PPE), incluindo esfrega estéreis, luvas, sapatas dedicadas, tampas de sapata, máscara, óculos de proteção, capota do cabelo/barba, e revestimentos de laboratório estéreis.
  2. Resuspenda 1 x 106 de CD34+ HSCs congelados (ver Tabela de Materiais)em 10 mL de mídia RPMI 1640 10% FBS um armário de biossegurança certificado e manter condições estéreis.
  3. Use 10 μL da suspensão para contar (para assegurar a presença do número esperado de células) e verifique a viabilidade celular por coloração de exclusão azul trypan em um hemocytometer.
  4. Centrífuga a 400 x g por 15 min à temperatura ambiente (RT). Descarte o supernatant e resuspenda no frio 1x PBS para a concentração necessária (1,4 x 105 de CD34+ HSCs em 50 μL). Mantenha as células no gelo até a injeção.
  5. Coloque os filhotes (NS γ-cadeianulo filhotes de ambos os sexos de 1-4 dias de idade) em um estéril 100 mm2 Placa de Petri, juntamente com uma pequena quantidade de material de cama da gaiola criador. Além disso, esfregue a cama limpa entre as mãos para mascarar ainda mais quaisquer odores estranhos sobre os filhotes receptores.
    NOTA: Isto minimiza os odores extrangeiros que estão sendo impregnados nos filhotes de cachorro, desse modo melhorando as possibilidades das mães que aceitam seus filhotes de cachorro de novo em gaiolas após o procedimento.
  6. Coloque a placa de Petri em uma gaiola de transporte limpo e coloque a gaiola em uma gaiola microisolator de rato limpo para proteger os filhotes do meio ambiente. Cubra a gaiola de transporte com uma almofada de cobertura para evitar a exposição de animais à luz externa, enquanto em trânsito para a sala de irradiação.
  7. Irradiar filhotes com 100 cGy irradiação corporal inteira (WBI) pela exposição a uma fonte de 137 Cs. Limpe o interior do irradiador com solução desinfetante, coloque os ratos no radiador e ligue a plataforma giratória para que todos os filhotes sejam irradiados homogeneamente. Feche o radiador e pressione o interruptor de energia para iniciar o processo de irradiação. Espere até que o tempo de irradiação seja concluído e retire imediatamente os ratos.
    NOTA: Desde que a irradiação não gera o esforço nos ratos, a anestesia precedente não é exigida.
  8. 2-4 h após o procedimento de irradiação, coloque os filhotes em um armário de biossegurança dentro de uma placa de Petri estéreis refrigerados coberto com gaze estéril no gelo, até anestesiar (~ 5-10 min). Anestesia suficiente é alcançada quando os movimentos brutos cessam.
  9. Carregue a seringa com uma agulha anexada (29 G, 0,5) com 50 μL da suspensão celular e 1,4 x 105 de CD34+ HSCs o armário certificado de biossegurança.
  10. Para o enxerto via injeção hepática, contenha os filhotes com o polegar e os dedos indicadores. Para minimizar a contenção do mouse (~ 30-45 s), deixe um investigador segurar o filhote e administrar a injeção, e ter o segundo investigador carregar a seringa com a suspensão HSC. Limpe o local da injeção com 70% de álcool e entregue 50 μL de células diretamente no fígado. Use um ângulo de agulha raso ao injetar para evitar perfurar completamente o fígado. Como controle, injete camundongos com 50 μL de 1x PBS no fígado.
  11. Coloque os filhotes em uma placa de Petri estéril pré-aquecida coberta com gaze estéril por 1-5 min para permitir a recuperação. Pré-aqueça o prato usando uma almofada de aquecimento infravermelho para roedores a 20 °C para garantir que os filhotes não serão mais aquecidos.
  12. Imediatamente antes de devolver os filhotes para seus pais, aplique uma pequena quantidade de pomada à base de mentol e eucalipto, usando o polegar e os dedos indicadores, ao cnout de ambos os pais para evitar canibalismo ou rejeição dos filhotes.
  13. Verifique as gaiolas todos os dias, procurando quaisquer sinais de doença enxerto versus hospedeiro (GVHD) nos filhotes, como pele seca, sem alimentação, erupção cutânea e alopecia. Eutanásia os animais se algum desses sinais são observados.
  14. Ratos de wean em 3 semanas da idade, agrupando os pelo género. Não coloque mais de 5 animais por gaiola. Verifique o enxerto no sangue periférico por citometria fluída aos 14 semanas de idade.
    NOTA: A taxa de sucesso do enxerto é entre 80%-100%.

2. Enxerto de PBMC humano de camundongos juvenis

  1. Para os modelos agudos e de reativação, injete camundongosnulos de 6-8 semanas de idade na cadeia de metodos nulos de NS intraperitoneally com PBMCs humanos derivados de um doador saudável ou paciente infectado pelo HIV que estava TAR, respectivamente. Em ambos os modelos, incluem camundongos injetados com PBMCs de um doador saudável sem infecção pelo HIV (farsa) como controles.
  2. Camada 15 mL de sangue inteiro em 5 mL de gradiente de densidade estéril médio em um tubo cônico de 50 mL.
  3. Centrífuga a 400 x g por 30 min no RT, sem freios, para evitar que o casaco buffy se misturasse com o meio de gradiente de densidade.
  4. Coletar cuidadosamente a fração de células mononucleares (entre o gradiente de densidade médio e supernatant) e transferir o casaco buffy para um tubo de centrífuga de 15 mL contendo 10 mL de 1x PBS. Centrífuga a 300 x g por 10 min na RT.
  5. Descarte o supernatant e remova os glóbulos vermelhos restantes lysing com 5 mL do amortecedor de ACK adicionado às pilhas pelleted. Incubar por 4 min em RT.
  6. Centrífuga a 300 x g por 10 min na RT. Descarte o supernatant e resuspenda em 10 mL de 1x PBS ou RPMI 1640 médio.
  7. Use 10 μL da suspensão celular para contar as células e verificar a viabilidade por coloração de exclusão azul trypan em um hemocytometer. Normalmente, 1-2 x 106 células são obtidas para cada 1 mL de sangue, com mais de 95% de viabilidade.
  8. Centrífuga a 300 x g por 10 min na RT. Descarte o supernatant e ajuste o número celular para a concentração necessária (neste caso, 3,5 x 106 células em 200 μL de 1x PBS).
  9. Carregue a seringa com uma agulha anexada (28 G, 0,5) com 3,5 x 106 de PBMCs em 200 μL de 1x PBS um armário certificado de biossegurança.
  10. Retire o mouse da gaiola e segure-o pela cauda para que ele possa segurar a malha, aplicando tração suave para trás. Em seguida, coloque o indicador e os dedos do polegar sobre os ombros do animal, agarrando a pele solta do pescoço e usando o dedo médio para estabilizar as costas.
  11. Deslize a cabeça do rato para trás de modo que sua parte traseira esteja acima da cabeça. Isso permite que as vísceras na cavidade abdominal sejam deslocadas para trás e reduz o risco de perfuração dos órgãos internos durante a injeção.
  12. Limpe o local da injeção com 70% de álcool.
  13. Penetre a seringa usada na etapa 2.9 através da parede abdominal e aspira antes de injetar as pilhas, se algum material é aspirado, remova a seringa e rejeite-a. Caso contrário, injetar as células lentamente na cavidade intraperitoneal, remover a seringa e descartá-lo. Injetar 1x PBS para controlar ratos.
  14. Devolva o animal à sua gaiola.
  15. Verifique o enxerto no sangue periférico por citometria de fluxo em 3 semanas após a injeção.

3. Cuidados pós-enxerto

  1. Identifique ratos por marcação de ouvido.
  2. Observe os camundongos usados nesses experimentos de perto 2x por dia após cada procedimento para sinais clínicos de angústia.
  3. Após o transplante de células humanas, monitore camundongos para GVHD. Para monitorar os sintomas de GVHD em camundongos recém-nascidos, juvenis e adultos, avalie os animais para o aparecimento de doença sofra (ou seja, cor, secura, erupção cutânea, alopecia), além da medida de peso corporal. Avalie os animais que mostram estes sinais por um veterinário para considerar a eutanásia adiantada.

4. Procedimento de infecção pelo HIV e procedimento de infecção simulada

NOTA: Para os modelos crônicos e agudos, os ratos são contaminados com a tensão da referência de HIV BaL na semana 14 e na semana 3 borne-engraftment, respectivamente. As injeções com HIV são administradas intraperitoneally nos quadrantes abdominais mais baixos.

  1. Realize o processo de carregamento do vírus/PBS em seringas, usando uma agulha de 28 G 0.5", em armários BSL2 que seguem procedimentos ABSL2. A quantidade total de vírus injetado é 15.000 dose infecciosa mediana da cultura do tecido (TCID50)em 200 μL de RPMI estéril 1640.
  2. Retire o mouse da gaiola e segure-o por sua cauda para que ele possa segurar a malha, aplicando tração suave para trás. Em seguida, coloque o dedo indicador e o polegar sobre os ombros do animal, agarrando a pele solta do pescoço e usando o dedo médio para estabilizar as costas.
  3. Deslize a cabeça do rato para trás de modo que sua parte traseira esteja acima de sua cabeça. Isso permite que as vísceras na cavidade abdominal sejam deslocadas para trás e reduz o risco de perfuração de órgãos internos durante a injeção.
  4. Limpe os ratos com uma almofada de álcool pré-wetted no quadrante esquerdo/direito mais baixo do abdômen. Injetar 15.000 TCID50 do vírus HIV BaL contido em 200 μL de RPMI estéril 1640.
  5. Após a injeção, devolva o rato à sua gaiola em casa.

5. Coleta de sangue por punção retroorbital

NOTA: O sangramento retroorbital permite a coleta rápida de sangue, reduzindo assim o tempo de coleta geral e aumentando a estabilidade dos marcadores de linfócitos humanos. Use tubos EDTA para coletar sangue de camundongos.

  1. No modelo crônico, às 14 semanas de injeção pós-HSC, recolher o sangue via veia retroorbital. Nos modelos agudos e de reativação, realize este procedimento a 3 semanas após a injeção de PBMC.
  2. Anestesie os animais usando 250 μL de inalação de isoflurano antes da coleta de sangue em uma classe B2 de capa de biossegurança que é canalizada externamente.
  3. Dispense o Isoflurane em almofadas de algodão uma malha de arame em um frasco 1 L claro em um armário de biossegurança ventilado fora do edifício. O uso da malha garante que os animais não entrem em contato com a almofada encharcado de isoflurano, o que pode causar irritação da pele e potencial overdose, uma vez que o isoflurano também é absorvido através da pele. Além disso, coloque uma toalha de papel macia entre a malha e o animal para evitar lesões nos membros.
  4. Uma vez que o frasco é saturado com isoflurane (aproximadamente 1 min depois de adicioná-lo), introduzir o animal e observar a taxa respiratória, que irá aumentar, em seguida, diminuir. Verifique se há indicação clínica de um plano profundo de anestesia, que inclui a falta de um reflexo de endireitamento (ao derrubar jar suavemente) e falta de movimentos grosseiros. Comece o procedimento de sangramento assim que o animal está completamente relaxado e sem o reflexo pitada do dedo do dedo do dedo do dodo.
    NOTA: Desde isoflurane evapora, dispensar mais drogas se não houver sinais de anestesia são observados.
  5. Para o sangramento retroorbital, pressione o mouse externo jugular veia caudal para a mandíbula com o polegar, e com a mesma mão, gentilmente elevar a pálpebra superior com o dedo indicador.
  6. Insira um tubo hematocrito no canthus medial do olho e direcione-o em uma direção ventrolateral até que o sangue comece a girar.
  7. Recolher pelo menos 100 μL de sangue. Uma vez que o volume desejado de sangue é obtido (um volume não mais do que o 1% do peso corporal do animal), interromper a pressão jugular externa e remover o tubo de hematócrito.
  8. Assegure que a hemostasis está completa aplicando a pressão direta no olho usando uma gaze estéril para um mínimo de 30 s.
  9. Aplique gotas de tetracaína no olho. Monitore o animal até que ele tenha recuperado completamente da anestesia e colocá-lo de volta na gaiola.
    NOTA: Os 100 μL de sangue coletado são utilizados para a avaliação do nível de enxerto de CD45 humano+ e outras populações de células sanguíneas, bem como para a avaliação da carga viral de plasma.

6. Triagem do nível de enxerto e análise de citometria de fluxo

  1. Siga um protocolo convencional de coloração de citometria de fluxo para sangue inteiro, que inclui a incubação de anticorpos anti-humanos com rótulofluorocromático (para painel de fluxo sugerido, ver Tabela de Materiais), seguido pela lisose dos glóbulos vermelhos e lavar os passos13,15.
    NOTA: Para a triagem do nível de enxerto, inclua um anticorpo CD45 anti-humano. Para a comparação, um anticorpo CD45 anti-mouse também pode ser usado. Inclua controles de compensação, bem como uma amostra de sangue humano manchada com a mesma mistura de anticorpos, amostras de camundongos e sangue humano não manchadas e controle não humanizado para testar a reatividade cruzada dos reagentes. Após a coloração, há sempre algum sinal de fundo; no entanto, todos os sinais positivos são claramente distinguidos de controles negativos e multi-reativos.
  2. Em um citometro de fluxo apropriado, adquirir pelo menos 10.000 eventos no portão linfócito (FSC-A vs SSC-A). Para análise de citometria de fluxo, após exclusão duplicada, determine a porcentagem de células CD45+ células humanas, bem como outras populações celulares de interesse.

7. Avaliação da carga viral de plasma

  1. Avalie a carga viral em animais infectados pelo HIV 1x por semana após a infecção.
  2. Após o sangramento retroorbital (aproximadamente 100 μL), obtenha plasma coletando o supernatant após centrífugação do sangue anticoagulado a 3.500 x g por 3 min em uma microcentrífuga. A pelota é usada para a infiltração das células sanguíneas.
  3. Use um kit de extração de RNA viral comercial (ver Tabela de Materiais)para obter RNA de 40 μL de plasma.
  4. Converta rna em cDNA usando a primeira mistura de síntese de cepa (ver Tabela de Materiais)e primer de mordaça do HIV SK431.
  5. Realize PCR quantitativo em tempo real usando primers HIV Gag SK38/SK39 e corantes verdes fluorescentes (por exemplo, verde SYBR) como descrito em estudos anteriores13,25.

8. Administração de terapia antirretroviral

  1. Administrar a TARA oral pelo menos 3 semanas após a infecção, quando a alta carga viral é observada, nos modelos crônicos, agudos e de reativação.
  2. Calcule as doses de tenofovir disoproxil fumarate (TDF), emtricitabina (FTC) e raltegravir (RAL), de acordo com valores km de 37 e 3 para humanos e camundongos, respectivamente26. Normalmente, as doses equivalentes a humanos de TDF, FTC e RAL são de 61,7 mg/kg/dia, 40,7 mg/kg/dia e 164 mg/kg/dia, respectivamente.
  3. Para a administração em água potável, esmagar comprimidos de drogas e adicionar a respectiva quantidade na garrafa de água, garantindo que cada rato na gaiola adquire sua dose diária. Uma vez que o pó de droga pode formar sedimentos na garrafa, periodicamente agitar a garrafa de água para conseguir suspensão homogênea.
  4. Mude a garrafa de água toda semana com drogas recém-dissolvidas.
  5. Coletar o sangue via veia retroorbital a cada semana ou a cada 2 semanas após a iniciação art para avaliar as mudanças na carga viral e cd4:cd8 relação.

9. Eutanásia do rato, coleção de órgãos secundários do linfóide, e isolação de pilhas mononuclear

  1. A eutanásia é realizada nos três modelos de camundongos humanizados, periodicamente ao longo do tempo de infecção, ou no final do experimento.
  2. Realize a eutanásia de camundongos adultos por asfixia de CO2, seguida pela luxação cervical. Para asfixia, use uma câmara não pré-carregada, dispense CO2 de um cilindro comercial com regulador de pressão fixa e restrição de linha controlando o fluxo de gás dentro de 20%-30% do volume/minuto da câmara para cumprir as diretrizes da AVMA de 2013.
  3. Mantenha o fluxo de CO2 para a parada respiratória de monitoramento de >60 (que pode levar até 5 min), seguido pela luxação cervical para garantir a eutanásia.
  4. Eutanásia neonatos <7 dias de idade por um método físico (ou seja, usando tesoura afiada).
  5. Visualize os gânglios linfáticos axillary, mediastinal e mesentéricos (que são tipicamente observados) e extrai-os com uma pinça e uma tesoura afiada. Também extraia o baço, localizado no lado superior esquerdo da cavidade peritoneal.
  6. Deposite os tecidos linfóides em tubos de centrífuga de 1,5 mL contendo rpmi estéril 1640 médio.
  7. Processe imediatamente os tecidos linfóides em um filtro de células de nylon do tamanho de um poros de 70 mm, coletando as células em um tubo de 50 mL. Não aspiratee os tecidos.
  8. Lave as células com 5 mL de RPMI 1640 médio complementado com 1% FBS para facilitar a filtragem de células.
  9. Após a desagregação do tecido, centrífuga as células de suspensão em 3.500 x g por 10 min em uma microcentrífuga.
  10. Descarte o supernatant e resuspenda as células com 500 μL de 1x PBS.
  11. Transfira a suspensão das células para um tubo de centrífuga de 1,5 mL contendo 500 μL de gradiente de densidade estéril.
  12. Centrífuga a 3.500 x g por 3 min em uma microcentrífuga, sem freio, para evitar que o casaco buffy se misturasse com o meio de gradiente de densidade
  13. Coletar cuidadosamente a fração de células mononucleares (entre o gradiente de densidade médio e supernatant) e transferir o casaco buffy para um tubo de centrífuga de 1,5 mL contendo 500 μL de 1x PBS. Centrífuga a 3.000 x g por 3 min.
  14. Retire os restantes glóbulos vermelhos, lysing com 500 μL de amortecimento ACK, incubando por 4 min em RT.
  15. Centrífuga a 3.000 x g por 3 min. Descarte o supernatant e resuspenda em 1 mL de 1x PBS ou médio.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Resultados

Conforme descrito acima, em 14 semanas de injeção pós-HSC (modelo crônico) ou em 3 semanas de injeção pós-PBMC (modelos agudos e de reativação), os ratos são sangrados para a triagem do nível de enxerto de células humanas por citometria de fluxo. Uma estratégia representativa de gating para a avaliação de 1) CD45 humano+ células reconstituição e 2) porcentagem de CD4+ e CD8+ Células T é mostrado na Figura 1A. Normalmente, o nível de enxerto (...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Discussão

Avanços importantes foram alcançados no desenvolvimento de cepas de camundongos imunodeficientes para a humanização, com uma série de opções diferentes que podem ser usadas de acordo com o interesse da pesquisa1. Desde que aqui é um protocolo geral para a humanização de ratosnulos da cadeia de metodos e cepas geneticamente semelhantes a serem empregadas em três modelos diferentes para estudar a infecção pelo HIV. Na primeira abordagem experimental, camundongos recém-nascidos irradiados ...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado por fundos internos da divisão clínica do IHV para a JCZ.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
0. Tubos de microcentrífuga de 5 mlNeptune3735.S.X
1. Tubos de microcentrífuga de 5 mlNeptune3745.S.X
10 ml Pipetasserológicas estelaresVL-4090-0010
Tubos cônicos de 15 mlStellar scientificT15-600
25 ml Pipetas serológicasestelares sceintificVL-4090-0025
Pipetas serológicas de 5 mlstellar sceintificVL-4090-0005
Tubos cônicos de 50 mlTampãoT50-600
ACKQualidade biológica118-156-101
Almofadas de preparação de álcoolFisher scientific06-669-62Clone estéril
anti-humano CD3 UCHT1Biolegend300439APC clone
conjugado anti-humano CD4 OKT4Biolegend317420AF488 clone conjugado
anti-humano CD45 2D1Biolegend368522BV421 conjugado
clone anti-humano CD8 SK1Biolegend344710PerCP-Cy5.5 conjugado
Biosafaty gabinete nível 2Se possível conectado a um exauste chimeny ao manusear Isoflurano
BonnetFisher scientific17-100-900Tampa de uso único para proteção básica
CavicidaMetrex13-1000Desinfectante de superfície
Células CD34+Lonza2C-101Como muitos frascos disponíveis de um único doador
CentrífugaBeckman65-6KR
Frasco transparenteAmazon77977
Almofadade gaze de algodãoFisher scientific22-415-468
Jalecos descartáveis estéreisMicrotubos Fisher scientific19-472-422
EDTA MáscaraGreiner bio-one450480
Fisherscientific17-100-897
Solução de lise FACSBD340202
FBS premium HIAtlanta biologicsS1115OH
FicollGE health one17-1440-02
CitômetroUsamos tubos de citometria de fluxo FACS Aria II
Falcon352054 5 ml de poliestireno e fundo redondo
HIV BaLPreparado em nossa instalação central uQUANT
PBMCsVoluntários HIV positivos e negativos
Infravermelho almofada de aquecimentoVenet scientificDCT-25Almofada de aquecimento terapêutico temporária para pequenos animais
Isentress (Raltegravir)MerckNSC 0006-0227061Medicação antirretroviral para tratar o vírus da imunodeficiência humana (HIV) - inibidor da integrase
IsofluranoHenry ScheinNDC 11695-6776-2
Mark I irradiadorEquipamento pertencente à universidade de Pipetas
de micro de
MicrocentrifugeEppendorf
Mouse brincosNational Band & Tag company1005-1L1
Tubos de coleta de sangue NatelsonFisher scientific02-668-10
NOG-EXLTaconicHSCFTL-13395-F
NSG camundongosJackson5557Tempo fêmeas grávidas para enxerto CD34 e Juvenis para enxerto PBMCs
NSG-SGM3Jackson13062
Paraformaldeído 16%Ciências de microscopia eletrônica15710
PBS 1X pH 7,4Gibco100-10-023
Placas de PetriFisher scientific08-757-28
Quantistudio qPCR máquinaThermoQS3
Reservatórios de reagentesCostar4870
RPMI mídia 1640 1XGibco11875-093
Sapato cobreFisher scientific17-100-911
Luvas descartáveis estéreisMicroflexSUF-524
SuperScript II Síntese de primeira fita SuperMixInvitrogen10080-400
Seringas de síntese de cDNA 28-G x 1/2BD329-461
Seringas 29-G x 1/2BD324-702
Truvada (Emtricitabina e TenofovirGileadNDC 61958-0701-1Medicamento antirretroviral para tratar o vírus da imunodeficiência humana (HIV)-Nicleosídeo inibidor da transcriptase análoga
Trypan blueSigmaT8154Contagem de células e viabilidade
Vick VaporubSaúde escolar43214Pomada à base de mentol e eucalipto
Grau de biologia molecular da águaQualidade biológica351-029-131
de lise Stellar scientific facial de fluxo humanos Maryland

Referências

  1. Shultz, L. D., Ishikawa, F., Greiner, D. L. Humanized mice in translational biomedical research. Nature Reviews Immunology. 7, 118-130 (2007).
  2. Koboziev, I., et al. Use of humanized mice to study the pathogenesis of autoimmune and inflammatory diseases. Inflammatory Bowel Diseases. 21 (7), 1652-1673 (2015).
  3. Ito, M., et al. NOD/SCID/γcnull mouse: An excellent recipient mouse model for engraftment of human cells. Blood. 100 (9), 3175-3182 (2002).
  4. Ishikawa, F., et al. Development of functional human blood and immune systems in NOD/SCID/IL2 receptor {gamma} chain(null) mice. Blood. 106 (5), 1565-1573 (2005).
  5. Kim, K. C., et al. A Simple Mouse Model for the Study of Human Immunodeficiency Virus. AIDS research and human retroviruses. 32 (2), 194-202 (2016).
  6. Wunderlich, M., et al. AML xenograft efficiency is significantly improved in NOD/SCID-IL2RG mice constitutively expressing human SCF, GM-CSF and IL-3. Leukemia. 24 (10), 1785-1788 (2010).
  7. Billerbeck, E., et al. Development of human CD4+FoxP3+ regulatory T cells in human stem cell factor-, granulocyte-macrophage colony-stimulating factor-, and interleukin-3-expressing NOD-SCID IL2Rγnull humanized mice. Blood. 117 (11), 3076-3086 (2011).
  8. Coughlan, A. M., et al. Myeloid Engraftment in Humanized Mice: Impact of Granulocyte-Colony Stimulating Factor Treatment and Transgenic Mouse Strain. Stem cells and development. 25 (7), 530-541 (2016).
  9. Kumar, P., et al. T Cell-Specific siRNA Delivery Suppresses HIV-1 Infection in Humanized Mice. Cell. 134 (4), 577-586 (2008).
  10. Victor Garcia, J. Humanized mice for HIV and AIDS research. Current Opinion in Virology. 19, 56-64 (2016).
  11. Araínga, M., Su, H., Poluektova, L. Y., Gorantla, S., Gendelman, H. E. HIV-1 cellular and tissue replication patterns in infected humanized mice. Scientific Reports. 6, 1-12 (2016).
  12. Satheesan, S., et al. HIV replication and latency in a humanized NSG mouse model during suppressive oral combinational ART. Journal of Virology. 92 (7), 2118(2018).
  13. Medina-Moreno, S., et al. Targeting of CDK9 with indirubin 3’-monoxime safely and durably reduces HIV viremia in chronically infected humanized mice. PLoS ONE. 12 (8), 1-13 (2017).
  14. Honeycutt, J. B., et al. Macrophages sustain HIV replication in vivo independently of T cells. The Journal of Clinical Investigation. 126 (4), 1353-1366 (2016).
  15. Perdomo-Celis, F., Medina-Moreno, S., Davis, H., Bryant, J., Zapata, J. C. HIV Replication in Humanized IL-3/GM-CSF-Transgenic NOG Mice. Pathogens. 8 (33), Basel, Switzerland. 1-16 (2019).
  16. Akkina, R., et al. Improvements and Limitations of Humanized Mouse Models for HIV Research: NIH/NIAID "Meet the Experts" 2015 Workshop Summary. AIDS Research and Human Retroviruses. 32 (2), 109-119 (2015).
  17. Dudek, T. E., Allen, T. M. HIV-Specific CD8+ T-Cell Immunity in Humanized Bone Marrow-Liver-Thymus Mice. The Journal of Infectious Diseases. 208, Suppl 2 150-154 (2013).
  18. Skelton, J. K., Ortega-Prieto, A. M., Dorner, M. A Hitchhiker's guide to humanized mice: new pathways to studying viral infections. Immunology. 154, 50-61 (2018).
  19. Pearson, T., Greiner, D. L., Shultz, L. D. Creation of "humanized" mice to study human immunity. Current Protocols in Immunology. , Chapter 15, Unit 15.21 (2008).
  20. Hasgur, S., Aryee, K. E., Shultz, L. D., Greiner, D. L., Brehm, M. A. Generation of Immunodeficient Mice Bearing Human Immune Systems by the Engraftment of Hematopoietic Stem Cells. Methods in molecular biology. 1438, Clifton, N.J. 67-78 (2016).
  21. Shultz, L. D., et al. Human lymphoid and myeloid cell development in NOD/LtSz-scid IL2R gamma null mice engrafted with mobilized human hemopoietic stem cells. Journal of Immunology. 174 (10), Baltimore, Md. 6477-6489 (2005).
  22. King, M., et al. A new Hu-PBL model for the study of human islet alloreactivity based on NOD-scid mice bearing a targeted mutation in the IL-2 receptor gamma chain gene. Clinical Immunology. 126 (3), Orlando, Fla. 303-314 (2008).
  23. King, M. A., et al. Human peripheral blood leucocyte non-obese diabetic-severe combined immunodeficiency interleukin-2 receptor gamma chain gene mouse model of xenogeneic graft-versus-host-like disease and the role of host major histocompatibility complex. Clinical and Experimental Immunology. 157 (1), 104-118 (2009).
  24. Covassin, L., et al. Human peripheral blood CD4 T cell-engrafted non-obese diabetic-scid IL2rgamma(null) H2-Ab1 (tm1Gru) Tg (human leucocyte antigen D-related 4) mice: a mouse model of human allogeneic graft-versus-host disease. Clinical and experimental immunology. 166 (2), 269-280 (2011).
  25. Heredia, A., et al. Targeting of mTOR catalytic site inhibits multiple steps of the HIV-1 lifecycle and suppresses HIV-1 viremia in humanized mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (30), 9412-9417 (2015).
  26. Nair, A., Jacob, S. A simple practice guide for dose conversion between animals and human. Journal of Basic and Clinical Pharmacy. 7 (2), 27-31 (2016).
  27. Miller, P. H., et al. Analysis of parameters that affect human hematopoietic cell outputs in mutant c-kit-immunodeficient mice. Experimental Hematology. 48, 41-49 (2017).
  28. Murphy, W. J., et al. Induction of T cell differentiation and lymphomagenesis in the thymus of mice with severe combined immune deficiency (SCID). Journal of Immunology. 153 (3), Baltimore, Md. 1004-1014 (1994).
  29. Poluektova, L. Y., et al. Humanized Mice as Models for Human Disease. Humanized Mice for HIV Research. , Chapter 2 15-24 (2015).
  30. Nakata, H., et al. Potent anti-R5 human immunodeficiency virus type 1 effects of a CCR5 antagonist, AK602/ONO4128/GW873140, in a novel human peripheral blood mononuclear cell nonobese diabetic-SCID, interleukin-2 receptor gamma-chain-knocked-out AIDS mouse model. Journal of Virology. 79 (4), 2087-2096 (2005).
  31. Terahara, K., et al. Fluorescent Reporter Signals, EGFP, and DsRed, Encoded in HIV-1 Facilitate the Detection of Productively Infected Cells and Cell-Associated Viral Replication Levels. Frontiers in Microbiology. 2, 280(2012).
  32. Nicolini, F. E., Cashman, J. D., Hogge, D. E., Humphries, R. K., Eaves, C. J. NOD/SCID mice engineered to express human IL-3, GM-CSF and Steel factor constitutively mobilize engrafted human progenitors and compromise human stem cell regeneration. Leukemia. 18 (2), 341-347 (2004).
  33. Cyster, J. G., et al. Follicular stromal cells and lymphocyte homing to follicles. Immunological Reviews. 176, 181-193 (2000).
  34. Seung, E., Tager, A. M. Humoral Immunity in Humanized Mice: A Work in Progress. Journal of Infectious Diseases. 208, Suppl 2 155-159 (2013).
  35. Wahl, A., Victor Garcia, J. The use of BLT humanized mice to investigate the immune reconstitution of the gastrointestinal tract. Journal of Immunological Methods. 410, 28-33 (2014).
  36. Suzuki, M., et al. Induction of human humoral immune responses in a novel HLA-DR-expressing transgenic NOD/Shi-scid/γc null mouse. International Immunology. 24 (4), 243-252 (2012).
  37. Ali, N., et al. Xenogeneic Graft-versus-Host-Disease in NOD-scid IL-2Rγnull Mice Display a T-Effector Memory Phenotype. PLoS ONE. 7 (8), 1-10 (2012).
  38. Brehm, M. A., Wiles, M. V., Greiner, D. L., Shultz, L. D. Generation of improved humanized mouse models for human infectious diseases. Journal of Immunological Methods. 410, 3-17 (2014).
  39. Hakre, S., Chavez, L., Shirakawa, K., Verdin, E. HIV latency: experimental systems and molecular models. FEMS Microbiology Reviews. 36 (3), 706-716 (2012).
  40. Wu, F., et al. TRIM5α Restriction Affects Clinical Outcome and Disease Progression in Simian Immunodeficiency Virus-Infected Rhesus Macaques. Journal of Virology. 89 (4), 2233(2015).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Reimpressões e permissões

Etiquetas

Camundongos Imunodeficientes HumanizadosModelos de Infec o por HIVModelo de HIV Cr nicoModelo de HIV AgudoModelo de Reativa o de HIVC lulas Tronco CD34C lulas Mononucleares do Sangue Perif ricoCitometria de FluxoInje o IntraperitonealInje o Intra hep tica
Infecção por HIV crônica, aguda e reativada em modelos de camundongos imunodeficientes humanizados
Fale conosco
Recomendar à biblioteca

Privacidade

Termos de Uso

Políticas

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Todos os direitos reservados.