Quantificação absoluta do metabolismo da síntese de proteínas livres de células por cromatografia líquida de fase reversa-espectrometria

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo robusto para quantificar 40 compostos envolvidos no metabolismo central de carbono e energia em reações de síntese de proteínas livres de células. A mistura de síntese livre de células é derivada com aniline para separação eficaz usando cromatografia líquida de fase invertida e, em seguida, quantificada pela espectrometria de massa usando padrões internos isotópicos rotulados.

Resumo

A síntese de proteínas livres de células (CFPS) é uma tecnologia emergente em sistemas e biologia sintética para a produção in vitro de proteínas. No entanto, se cfps vai ir além do laboratório e se tornar um padrão generalizado e apenas no tempo de fabricação de tecnologia, temos de compreender os limites de desempenho desses sistemas. Em relação a essa questão, desenvolvemos um protocolo robusto para quantificar 40 compostos envolvidos na glicolíse, a via de fosfato de pentose, o ciclo de ácido tricarboxílico, o metabolismo energético e a regeneração do cofator nas reações da CFPS. O método utiliza padrões internos marcados com ¹³C-aniline, enquanto os compostos na amostra são derivados com ¹²C-aniline. Os padrões internos e a amostra foram mistos e analisados por cromatografia líquida de fase invertida-espectrometria de massa (LC/MS). A co-elução de compostos eliminou a supressão de íons, permitindo a quantificação precisa de concentrações de metabolizados em 2-3 ordens de magnitude, onde o coeficiente de correlação média foi de 0,988. Cinco dos quarenta compostos não foram marcados com aniline, entretanto, foram detectados ainda na amostra de CFPS e quantificados com um método padrão da curva. A corrida cromatográfica leva aproximadamente 10 min para ser concluída. Em conjunto, desenvolvemos um método rápido e robusto para separar e quantificar com precisão 40 compostos envolvidos no CFPS em uma única execução lc/ms. O método é uma abordagem abrangente e precisa para caracterizar o metabolismo livre de células, de modo que, em última análise, podemos entender e melhorar o rendimento, produtividade e eficiência energética dos sistemas livres de células.

Introdução

A síntese de proteínas livres de células (CFPS) é uma plataforma promissora para a fabricação de proteínas e produtos químicos, uma aplicação que tradicionalmente tem sido reservada para células vivas. Sistemas livres de células são derivados de extratos de células brutas e eliminar as complicações associadas com o crescimento celular¹. Além disso, o CFPS permite o acesso direto aos metabólitos e às máquinas biossintéticas sem a interferência de uma parede celular. No entanto, tem faltado uma compreensão fundamental dos limites de desempenho dos processos livres de células. Métodos de alta taxa de produção para quantificação de metabólitos são valiosos para a caracterização do metabolismo e são fundamentais para a construção de modelos computacionais metabólicos^2,3,4. Os métodos comuns usados para determinar concentrações de metabolizados incluem ressonância magnética nuclear (RM), espectroscopia transformo-infravermelha de Fourier (FT-IR), ensaios baseados em enzimas e espectrometria de massa (MS)^{5,6,7 8.} No entanto, estes métodos são muitas vezes limitados pela sua incapacidade de medir eficientemente vários compostos de uma só vez e muitas vezes exigem um tamanho amostral maior do que as reações típicas livres de células. Por exemplo, ensaios baseados em enzimas muitas vezes só podem ser usados para quantificar um único composto em uma corrida, e são limitados quando o tamanho da amostra é pequeno, como em reações de síntese de proteínas livres de células (normalmente executado em uma escala de 10-15 μL). Enquanto isso, nmr requer uma alta abundância de metabólitos para detecção e quantificação⁵.  Para essas deficiências, os métodos de cromatografia em conjunto com a espectrometria de massa (LC/MS) fornecem várias vantagens, incluindo alta sensibilidade e a capacidade de medir várias espécies simultaneamente^9; no entanto, a complexidade analítica aumenta consideravelmente com o número e a diversidade de espécies sendo medidos. É importante, portanto, desenvolver métodos que realizem plenamente o potencial de alta taxa de veiviação dos sistemas LC/MS. Os compostos em uma amostra são separados pela cromatografia líquida e identificados através da espectrometria de massa. O sinal do composto depende de sua eficiência de concentração e ionização, onde a ionização pode variar entre compostos e também pode depender da matriz da amostra.

Alcançar a mesma eficiência de ionização entre a amostra e os padrões é um desafio ao usar LC/MS para quantificar os analitos. Além disso, a quantificação torna-se mais desafiadora com a diversidade de metabólitos devido à divisão de sinais e heterogeneidade na afinidade e polaridade de prótons¹⁰. Por fim, a matriz de co-eluting da amostra também pode afetar a eficiência de ionização dos compostos. Para resolver esses problemas, os metabólitos podem ser quimicamente derivatizados, aumentando a resolução e sensibilidade de separação por sistemas LC/MS, ao mesmo tempo em que diminuem a divisão de sinais em alguns casos^10,11. A derivatização química funciona marcando grupos funcionais específicos de metabólitos para ajustar suas propriedades físicas, como carga ou hidrofóbica, para aumentar a eficiência de ionização^11. Vários agentes de marcação podem ser usados para atingir diferentes grupos funcionais (por exemplo, aminas, hidroxils, fosfatos, ácidos carboxílicos, etc.). Aniline, um tal agente de derivatização, tem como alvo vários grupos funcionais ao mesmo tempo, e adiciona um componente hidrofóbico em moléculas hidrofílicas, aumentando assim a sua resolução de separação e sinal¹². Para abordar o efeito de supressão de íons de matriz cooperativa, Yang e colegas de trabalho desenvolveram uma técnica baseada na rotulagem da Tecnologia De Padrão Interno Específico do Grupo (GSIST), onde os padrões são marcados com isótopos aniline ¹³C e misturados com a amostra ^12,13. O metabolito e o padrão interno correspondente têm a mesma eficiência de ionização desde que co-elute, e sua razão de intensidade pode ser usada para quantificar a concentração na amostra experimental.

Neste estudo, desenvolvemos um protocolo para detectar e quantificar 40 compostos envolvidos na glicolíse, a via de fosfato de pentose, o ciclo de ácido tricarboxílico, metabolismo energético e regeneração de cofator em reações de CFPS. O método é baseado na abordagem GSIST, onde usamos ¹²C-aniline e ¹³C-aniline para marcar, detectar e quantificar metabólitos usando LC/MS de fase invertida. A escala linear de todos os compostos mediu 2-3 ordens do valor com um coeficiente médio da correlação de 0.988. Assim, o método é uma abordagem robusta e precisa para interrogar o metabolismo livre de células e, possivelmente, extratos de células inteiras.

Protocolo

1. Preparação de reagentes para marcação de aniline

1. Prepare uma solução aniline de 6 M no pH 4.5. Trabalhando em um capô, combinar 550 μL de aniline com 337,5 μL de água grau LCMS e 112,5 μL de 12 M ácido clorídrico (HCl) em um tubo de centrífuga. Vortex bem e armazenar a 4 °C.
   NOTA: A aniline pode ser armazenada a 4 °C por 2 meses.
   CUIDADO: Aniline é altamente tóxico e deve ser trabalhado com em um capô de fumaça. O ácido clorídrico é altamente corrosivo
2. Prepare uma solução aniline 6 M ¹³C no pH 4.5. Combine 250 mg de ¹³C₆-aniline com 132 μL de água e 44 μL de 12 M HCl. Vortex bem e armazenar a 4 °C.
3. Prepare 200 mg/mL N-(3-dimetilaminopropyl)-N-etilcarbodiimide hidrochloride (EDC) solução. Dissolva 2 mg de EDC em 10 μL de água para cada amostra a ser marcada e vórtice bem.
   NOTA: A solução EDC deve ser preparada no mesmo dia da reação. Edc atua como um catalisador para a derivatização de compostos com aniline¹².

2. Preparação de normas

1. Faça soluções de estoque separadas de todos os compostos dissolvidos em água de grau LC/MS(Tabela 1).
2. Preparação da solução de ações padrão interno
   1. Combine todos os compostos com exceção do dinucleotídeo de adenina (NAD), fosfato de dinucleotídeo de nicotinamida adenina (NADP), flavin adenina dinucleotídeo (FAD), coenzima acetil A (ACA) e glicerol 3-fosfato (Gly3P), com os volumes apropriados para criar uma solução de estoque de 2 mM de todos os compostos.
3. Combine NAD, NADP, FAD, ACA e Gly3P com os volumes apropriados para criar uma solução de estoque de 2 mM.

3. Preparação daamostra (Figura 1)

1. Saciar e precipitar as proteínas em uma reação de síntese de proteínas livre de células, adicionando um volume igual de etanol gelado 100% à reação. Centrífuga a amostra a 12.000 x g por 15 min a 4 °C. Transfira o supernatant para um novo tubo de centrífuga.
   NOTA: As amostras podem ser armazenadas a -80 °C neste momento e analisadas em um momento posterior

4. Reação de rotulagem

1. Amostra de rotulagem com ^{solução 12}C-animenais
   1. Transfira 6 μL de amostra em um novo tubo de centrífuga e elevará o volume para 50 μL comágua.
      NOTA: O tamanho da amostra de volume pode depender da reação específica do CFPS.
   2. Adicione 5 μL de 200 mg/mL solução EDC.
   3. Adicione 5 μL de ¹²solução c-aninilina.
      NOTA: A solução de aniline separa em duas fases. Misture bem antes de adicionar à reação.
   4. Vortex a reação com agitação suave por 2 h à temperatura ambiente.
   5. Após 2 h, retire os tubos da coqueteleira e adicione 1,5 μL de trietimamina (TEA) à reação em um capô de fumaça.
      NOTA: Trietimamina levanta o pH da solução que pára a reação de marcação de aniline e estabiliza os compostos.
      CUIDADO: A trietimamina é tóxica e causa irritação dos olhos e do trato respiratório.
   6. Centrífuga a 13.500 x g por 3 min.
2. Rotulagem de padrões internos com ¹³solução c-animenaline
   1. Diluir a solução de estoque interno para 80 μM com um volume final de 50 μL.
      NOTA: A concentração de padrões internos pode ser ajustada a níveis próximos à amostra experimental.
   2. Adicione 5 μL de 200 mg/mL solução EDC.
   3. Adicione 5 μL de ¹³solução c-aninilina.
   4. Vortex a reação com agitação suave por 2 h à temperatura ambiente.
   5. Após 2 h, retire os tubos da coqueteleira e adicione 1,5 μL de CHÁ à reação em um capô de fumaça.
   6. Centrífuga a 13.500 x g por 3 min.
3. Combinando padrão interno marcado e amostra marcada
   1. Misture 25 μL de ¹²amostra rotulada de aninilidade C com 25 μL de ¹³padrão de metais C.
   2. Transfira para um frasco de amostra automática e analise pelo procedimento LC/MS.
4. Criando uma curva padrão para metabólitos não marcados
   1. Solução de estoque diluído de metabólitos não escalonados (NAD, NADP, FAD, ACA e Gly3P) para concentrações finais de 320 μM, 80 μM, 20 μM e 5 μM com um volume de 50 μL.
   2. Adicione 5 μL de 200 mg/mL solução EDC.
   3. Adicione 5 μL de ¹²solução c-aninilina.
   4. Vortex a reação com agitação suave por 2 h à temperatura ambiente.
   5. Após 2 h, retire os tubos da coqueteleira e adicione 1,5 μL de CHÁ à reação em um capô de fumaça.
   6. Centrífuga a 13.500 x g por 3 min.
   7. Transfira o supernatant a um frasco do auto-sampler e analise pelo procedimento do LC/MS.
      NOTA: Os metabólitos não marcados seguem o mesmo procedimento que a amostra para replicar a matriz da amostra, a fim de manter a eficiência de ionização semelhante.

5. Configuração do procedimento LC/MS

1. Preparação de solventes
   1. Prepare 5 m tri-butilamina (TBA) solução aquosa ajustada ao pH 4.75 com ácido acético.
      NOTA: TBA na fase móvel ajuda os analitistas alcançar boa resolução e separação¹⁴.
   2. Prepare 5 mM TBA em acetônio (ACN).
   3. Prepare o solvente da lavagem com água de 5% e 95% ACN.
   4. Prepare o solvente da remoção com água de 95% e 5% ACN.
2. Criação das condições da EM
   1. Defina o espectrômetro de massa para o modo de íon negativo com uma temperatura de sonda de 520 °C, tensão capilar negativa de -0,8 kV, tensão capilar positiva de 0,8 kV e defina o software para adquirir dados em 5 pontos/s.
   2. Defina gravações de íons selecionados (SIR) para cada metabólito com tensões de cone especificadas e valores de massa acima da carga (m/z). Veja a Tabela 1.
3. Inicialização da LC/MS de acordo com as instruções do fabricante
   1. Primeiras linhas solventes no gerente de solvente por 3 min.
   2. Solvente de lavagem prime (5% de água, 95% ACN) e solvente de purga (95% de água, 5% ACN) para 15 s por 5 ciclos.
   3. Defina o gerente da amostra a 10 °C.
   4. Instale uma coluna C18 (1,7μm, 2,1mm x 150mm) e ininicialize a coluna com 100% ACN a 0,3 mL/min por 10 min.
   5. Condicionar a coluna em 95% de água e 5% ACN em 0,3 mL/min por 10 minutos antes da introdução de solventes com buffers.
   6. Condicionar a coluna a 95% solvente A (5mM TBA aquoso, pH 4.75) e 5% solvente B (5 mM TBA em ACN) em 0.3 mL/min por 10 min.
   7. Configure um protocolo de gradiente com a elução a partir de 95% solvente A e 5% solvente B, aumentado para 70% solvente B em 10 min, aumentado para 100% solvente B em 2 min e mantido em 100% solvente B por 3 min. Retorno às condições iniciais (95% solvente A , 5% solvente B) mais de 1 min e segurar por 9 min para reequilibrar a coluna.
   8. Condicionar a coluna com o protocolo de gradiente 3 vezes antes de quaisquer injeções na coluna.
4. Injetar amostra e padrões
   1. Injete 5 μL da amostra na coluna e adquira as intensidades apropriadas do íon do m/z para a amostra marcada ¹²C-aniline.
   2. Injete 5 μL da mesma amostra novamente, mas desta vez adquirir as intensidades de íons m/z para os ¹³padrões marcados c-aniline.
      NOTA: Nosso sistema LC/MS é incapaz de adquirir intensidades ^{de 12}C e ¹³C m/z nas janelas de tempo SIR especificadas, uma vez que são dados demais para adquirir na janela de tempo especificada. Portanto, injetamos a mesma amostra duas vezes.
   3. Injete padrões de metabolizados não marcados da menor concentração para a mais alta e registre as intensidades adequadas de íons m/z.

6. Quantificação

1. Criação do método de exportação
   1. No software de aquisição de dados, selecione Arquivo > Novo Método > Métodode Exportação .
   2. Especifique um nome de arquivo, como AnilineTagging_Date.
   3. Verifique o Arquivo Export ASCII e escolha um diretório para exportar o arquivo de texto para.
   4. No tipo de relatório,selecione resumo por todos.
   5. Em Delimiters,para coluna selecione a,. Para Row,selecione [cr][se].
   6. Na tabela,selecione exportação e, em seguida, eitie tabela para incluir SampleName, Área, Altura, Quantidade e Unidades.
   7. Salvar o método de exportação.
2. Quantificar metabólitos com padrões internos usando software de aquisição de dados
   1. De acordo com a guia Sample Sets, clique na execução LC/MS correspondente e selecione View as > Canais.
   2. Selecione todos os canais SIR para os ¹³padrões internos c-aniline de uma injeção, clique certo e revisãoselecionada.
   3. Se a janela de layout do método de processamento LC não aparecer automaticamente, acesse o Layout do Método de Processamento View >.
   4. No layout do método de processamento,acesse a guia integração e defina o ApexTrack como algoritmo.
   5. Vá para a guia de suavização e definir o tipo de média e o nível de suavização para 13.
      NOTA: Qualquer nível de suavização pode ser selecionado, desde que seja consistente em todas as amostras.
   6. Na aba MS Channel, desabilitar MS 3D Processing.
   7. Na janela do canal SIR, integrar cada pico, um canal de cada vez. Uma vez que um pico é integrado, vá para opções > Preencha a partir do resultado e os detalhes do pico serão preenchidos na guia Componentes. Alterar o nome de pico para o nome composto correspondente.
   8. Uma vez que todos os canais SIR foram avaliados, salvar o método de processamento e fechar janela.
   9. Selecione todos os canais SIR da amostra ¹³C-aniline e ¹²com marcação C-aniline, clique direito e processoseleto.
   10. Verifique a caixa de processo, selecione use o método de processamento especificadoe escolha o método de processamento que é apenas salvo. Verifique também a caixa de exportação, selecione método de exportação especificado use e escolha o método de exportação salvo criado anteriormente. Clique ok.
   11. Abra o arquivo de texto exportado com o Excel e calcule a concentração do composto desconhecido usando:
       
       onde C_{x, i} é a concentração da amostra desconhecida para metabólito i, A_x,i é a área integrada do metabolito desconhecido i, A_std,i é a área integrada do padrão interno de metabolito i, C_{std, i} é o concentração do padrão interno de metabólito i, e D é o fator de diluição.
3. Quantificar metabólitos não marcados com curva padrão
   1. De acordo com a guia Sample Sets, clique na execução LC/MS correspondente e selecione View as > Canais.
   2. Selecione todos os canais SIR para os padrões não marcados de uma injeção, clique certo e selecione Revisão.
   3. Se a janela de layout do método de processamento LC não aparecer automaticamente, acesse o Layout do Método de Processamento View >.
   4. No layout do método de processamento, acesse a guia integração e defina o ApexTrack como algoritmo.
   5. Vá para a guia de suavização e definir o tipo de média e o nível de suavização para 13.
      NOTA: Qualquer nível de suavização pode ser selecionado, desde que seja consistente em todas as amostras.
   6. Na aba MS Channel, desabilitar MS 3D Processing.
   7. Na janela do canal SIR, integrar cada pico, um canal de cada vez. Uma vez que um pico é integrado, vá para opções > Preencha a partir do resultado e os detalhes do pico serão preenchidos na guia Componentes. Alterar o nome de pico para o nome composto correspondente.
   8. Uma vez que todos os canais SIR foram avaliados, salvar o método de processamento e fechar janela.
   9. De acordo com a guia Sample Sets, clique no conjunto de amostras e selecione Alter Sample.
   10. Selecione valor na nova janela.
   11. Selecione a cópia do método Process e escolha o método de processo que acabou de ser salvo.
   12. Digite a concentração de cada metabólito para cada frasco e entre na unidade como <μM para cada componente (ou a unidade correspondente) e selecione OK.
   13. Selecione a amostra definida novamente, clique direito, Ver como > Canais.
   14. Selecione todos os canais SIR dos metabólitos não marcados para os padrões, clique direito e processoseleto.
   15. Verifique a caixa do processo e escolha o método de processamento especificadouse. Selecione o método de processamento apropriado e clique em OK.
   16. Selecione os canais SIR para todos os metabólitos não marcados para as amostras, clique direito e processoselecionado.
   17. Verifique a caixa do processo, selecione use o método de processamento especificado e escolha o método de processamento que acabou de ser salvo. Verifique também a caixa de exportação, selecione método de exportação especificado use e escolha o método de exportação salvo criado anteriormente. Clique OK.
   18. Quantifique os metabólitos não escalonados com a curva padrão e exporte os resultados para um arquivo de texto para o diretório especificado.

Resultados

Como prova de conceito, usamos o protocolo para quantificar metabólitos em um sistema cfps baseado em E. coli expressando proteína fluorescente verde (GFP).  A reação do CFPS (14 μL) foi saciada e desproteinizada com etanol. A amostra cfps foi então marcada com ¹²C-aniline, enquanto os padrões foram marcados com ¹³C-aniline. A amostra e os padrões marcados foram então combinados e injetados no LC/MS (Figura 1). O protocolo detectou e quantificou 40 metabólitos ...

Discussão

Os sistemas livres de células não têm parede celular, portanto, há acesso direto a metabólitos e as máquinas biossintéticas sem a necessidade de preparação complexa da amostra. No entanto, muito pouco trabalho tem sido feito para desenvolver protocolos completos e robustos para interrogar quantitativamente sistemas de reação livres de células. Neste estudo, desenvolvemos um método rápido e robusto para quantificar metabólitos em misturas de reação livre de células e potencialmente em extratos de células inteiras. Quantif...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
12C Anilina	Sigma-Aldrich	242284	Anilina 12C
13C Anilina marcada com 13C	Sigma-Aldrich	485797	Anilina 13C6
Ácido 3-fosfoglicérico	Sigma-Aldrich	P8877	3PG
Ácido acético	FisherScientific	AC222140010	ACE
Acetonitrila, LCMS	JT BAKER	9829-03	ACN
Acetil-coenzima A	Sigma-Aldrich	A2056	ACA
Acquity UPLC BEH C18 1.7 μ M, 2,1 x 150 mm Coluna	Águas	186002353
Difosfato de adenosina	da coluna Sigma-Aldrich	A2754	ADP
Monofosfato de adenosina	Sigma-Aldrich	A1752	AMP
Trifosfato de adenosina	Sigma-Aldrich	A2383	ATP
Alfa-cetoglutarato	Citrato
	Sigma-Aldrich	251275	CIT
Difosfato de citidina	Sigma-Aldrich	C9755	CDP
Monofosfato de citidina	Sigma-Aldrich	C1006	CMP
Trifosfato de citidina	Sigma-Aldrich	C9274	CTP
D-gliceraldeído 3-fosfato	Sigma-Aldrich	39705	GAP
Erythrose 4-fosfato	Sigma-Aldrich	E0377	E4P
Etanol	Sigma-Aldrich	EX0276	EtOH
Fisher Scientific accuSpin Micro 17 Centrífuga	FisherScientific
Flavina adenina dinucleotídeo	Sigma-Aldrich	F6625	FAD
Frutose 1,6-bifosfato	Sigma-Aldrich	F6803	F16P
Frutose 6-fosfato	Sigma-Aldrich	F3627	F6P
Fumarato	Sigma-Aldrich	F8509	FUM
Gluconato 6-fosfato	Sigma-Aldrich	P7877	6PG
Glicose	Sigma-Aldrich	G8270	GLC
Glicose 6-fosfato	Sigma-Aldrich	G7879	G6P
Glicerol 3-fosfato	Sigma-Aldrich	G7886	Gly3P
Difosfato de guanosina	Sigma-Aldrich	G7127	GDP
Monofosfato de guanosina	Sigma-Aldrich	G8377	GMP
Trifosfato de guanosina	Sigma-Aldrich	G8877	GTP
Ácido clorídrico	Sigma-Aldrich	258148	HCl
Isocitrato	Sigma-Aldrich	I1252	ICIT
Lactato	Sigma-Aldrich	L1750	LAC
Malato	Sigma-Aldrich	02288	MAL
myTXTL - Sigma 70 Master Mix Kit	ArborBiosciences	507024	Síntese de proteínas livres de células
N-(3-dimetilaminopropil)-N′-etilcarbodiimida cloridrato	Sigma-Aldrich	03449	EDC
Nicotinamida adenina dinucleotídeo	Sigma-Aldrich	43410	NAD
Nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato	Sigma-Aldrich	N5755	NADP
Nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato reduzido	Sigma-Aldrich	481973	NADPH
Nicotinamida adenina dinucleotídeo reduzido	Sigma-Aldrich	N8129	NADH
Oxalacetato	Sigma-Aldrich	O4126	OAA
Fosfoenolpiruvato	Sigma-Aldrich	P0564	PEP
Piruvato	Sigma-Aldrich	P5280	PYR
Ribose 5-fosfato	Sigma-Aldrich	R7750	R5P
Ribulose 5-fosfato	CarboSynth	MR45852	RL5P
Sedoheptulose 7-fosfato	CarboSynth	MS07457	S7P
Succinato	Sigma-Aldrich	S3674	SUCC
Tributilamina	Sigma-Aldrich	90780	TBA
Trietilamina	FisherScientific	O4884	TEA
água ultrapura	FisherScientific	10977-015	água
Difosfato de uridina	Sigma-Aldrich	U4125	UDP
Monofosfato de uridina	Sigma-Aldrich	U6375	UMP
Trifosfato de uridina	Sigma-Aldrich	U6625	UTP
VWR Vórtice para serviço pesado	VWR		Água de vórtice
, LCMS	JT BAKER	9831-03	ÁGUA
Waters Acquity H Gerente de solvente quaternário classe UPLC	Waters		LCMS
Waters Acquity H Gerente de amostra classe UPLC FTN	Waters		LCMS
Detector Waters Acquity Qda	Waters		LCMS
Waters Empower 3	Waters		Software
Waters LCMS Frasco de Recuperação Total Waters		186000384c	Frasco LCMS