Quantificação absoluta do metabolismo da síntese de proteínas livres de células por cromatografia líquida de fase reversa-espectrometria

Michael Vilkhovoy; David Dai; Sandra Vadhin; Abhinav Adhikari; Jeffrey D. Varner

doi:10.3791/60329

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Artigo de método

Quantificação absoluta do metabolismo da síntese de proteínas livres de células por cromatografia líquida de fase reversa-espectrometria

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DOI:

10.3791/60329

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25 de outubro de 2019

Michael Vilkhovoy¹ , David Dai¹ , Sandra Vadhin^*¹ , Abhinav Adhikari^*¹ , Jeffrey D. Varner¹

¹Robert Frederick Smith School of Chemical and Biomolecular Engineering, Cornell University

^* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo robusto para quantificar 40 compostos envolvidos no metabolismo central de carbono e energia em reações de síntese de proteínas livres de células. A mistura de síntese livre de células é derivada com aniline para separação eficaz usando cromatografia líquida de fase invertida e, em seguida, quantificada pela espectrometria de massa usando padrões internos isotópicos rotulados.

Resumo

A síntese de proteínas livres de células (CFPS) é uma tecnologia emergente em sistemas e biologia sintética para a produção in vitro de proteínas. No entanto, se cfps vai ir além do laboratório e se tornar um padrão generalizado e apenas no tempo de fabricação de tecnologia, temos de compreender os limites de desempenho desses sistemas. Em relação a essa questão, desenvolvemos um protocolo robusto para quantificar 40 compostos envolvidos na glicolíse, a via de fosfato de pentose, o ciclo de ácido tricarboxílico, o metabolismo energético e a regeneração do cofator nas reações da CFPS. O método utiliza padrões internos marcados com ¹³C-aniline, enquanto os compostos na amostra são derivados com ¹²C-aniline. Os padrões internos e a amostra foram mistos e analisados por cromatografia líquida de fase invertida-espectrometria de massa (LC/MS). A co-elução de compostos eliminou a supressão de íons, permitindo a quantificação precisa de concentrações de metabolizados em 2-3 ordens de magnitude, onde o coeficiente de correlação média foi de 0,988. Cinco dos quarenta compostos não foram marcados com aniline, entretanto, foram detectados ainda na amostra de CFPS e quantificados com um método padrão da curva. A corrida cromatográfica leva aproximadamente 10 min para ser concluída. Em conjunto, desenvolvemos um método rápido e robusto para separar e quantificar com precisão 40 compostos envolvidos no CFPS em uma única execução lc/ms. O método é uma abordagem abrangente e precisa para caracterizar o metabolismo livre de células, de modo que, em última análise, podemos entender e melhorar o rendimento, produtividade e eficiência energética dos sistemas livres de células.

Introdução

A síntese de proteínas livres de células (CFPS) é uma plataforma promissora para a fabricação de proteínas e produtos químicos, uma aplicação que tradicionalmente tem sido reservada para células vivas. Sistemas livres de células são derivados de extratos de células brutas e eliminar as complicações associadas com o crescimento celular¹. Além disso, o CFPS permite o acesso direto aos metabólitos e às máquinas biossintéticas sem a interferência de uma parede celular. No entanto, tem faltado uma compreensão fundamental dos limites de desempenho dos processos livres de células. Métodos de alta taxa de produção para quantificação de metabólitos são ....