Um sistema para acompanhar a dinâmica do comportamento de preferência social em pequenos roedores

Summary

Descrito aqui é um novo sistema experimental automatizado que oferece uma alternativa ao teste de três câmaras e também resolve várias ressalvas. Este sistema fornece múltiplos parâmetros comportamentais que permitem uma análise rigorosa da dinâmica comportamental de pequenos roedores durante os testes de preferência de preferência social e novidade social.

Abstract

Explorar os mecanismos neurobiológicos do comportamento social requer testes comportamentais que podem ser aplicados a modelos animais de forma imparcial e independente do observador. Desde o início do milênio, o teste de três câmaras tem sido amplamente utilizado como paradigma padrão para avaliar a sociabilidade (preferência social) e a preferência de novidade social em pequenos roedores. No entanto, este teste sofre de múltiplas limitações, incluindo sua dependência da navegação espacial e negligência da dinâmica comportamental. Apresentado e validado aqui é um novo sistema experimental que oferece uma alternativa para o teste de três câmaras, ao mesmo tempo, resolver algumas de suas ressalvas. O sistema requer um aparato experimental simples e acessível e um sistema de análise de código aberto disponível publicamente, que mede e analisa automaticamente vários parâmetros comportamentais em níveis individuais e populacionais. Permite a análise detalhada da dinâmica comportável de roedores pequenos durante todo o teste social da discriminação. Demonstramos a eficiência do sistema na análise da dinâmica do comportamento social durante os testes de preferência de preferência social e novidade social realizados por camundongos e camundongos machos adultos. Além disso, validamos a capacidade do sistema de revelar dinâmicas modificadas de comportamento social em roedores após manipulações como corte de bigode. Assim, o sistema permite uma investigação rigorosa do comportamento social e da dinâmica em pequenos modelos de roedores e suporta comparações mais precisas entre cepas, condições e tratamentos.

Introduction

Revelar os mecanismos biológicos subjacentes aos distúrbios do neurodesenvolvimento (NdDs) é um dos principais desafios no campo da neurociência^1. Enfrentar esse desafio requer paradigmas comportamentais e sistemas experimentais que tipificam o comportamento dos roedores de forma padrão e imparcial. Um estudo influente publicado há mais de uma década por Moy e colegas² apresentou o teste de três câmaras. Desde então, este teste tem sido amplamente utilizado para investigar o comportamento social em modelos de roedores de DND. Este teste avalia duas tendências inatas dos roedores: 1) para ficar na proximidade de um estímulo social sobre um objeto (sociabilidade, também denominado preferência social [SP]), e 2) a preferir a proximidade de um novo estímulo social sobre um familiar (preferência de novidade social [SNP])^3,4. Vários estudos subsequentes sugeriram métodos de análise automatizada do teste de três câmaras usando métodos computadorizados^5,6.

Este teste ainda sofre de várias ressalvas. Em primeiro lugar, examina principalmente a preferência de lugar social e não a motivação do sujeito para interagir diretamente com um estímulo social, embora alguns grupos também meçam o tempo de investigação olfativa (sniffing), seja manualmente⁷ ou usando sistemas informatizados comerciais^8,9,10. Em segundo lugar, o teste de três câmaras é usado principalmente para medir o tempo total gasto pelo sujeito em cada câmara, e negligencia a dinâmica comportamental. Finalmente, ele se baseia em apenas um aspecto do comportamento social, que é o tempo gasto pelo sujeito em cada câmara (ou farejando tempo, se medido).

Aqui apresentamos um sistema experimental novo e acessível que é uma alternativa ao aparelho de três câmaras. Ele também permite o desempenho dos mesmos testes comportamentais ao resolver as ressalvas acima mencionadas. O sistema comportamental apresentado mede automaticamente e diretamente o comportamento investigativo de um roedor em direção a dois estímulos. Além disso, analisa a dinâmica comportamental de forma independente do observador. Além disso, esse sistema mede múltiplos parâmetros comportamentais e os analisa em nível individual e populacional; assim, ele suporta uma análise rigorosa do comportamento social e sua dinâmica durante cada teste. Além disso, o reposicionamento aleatório das câmaras em cantos opostos da arena durante os vários estágios de teste neutraliza quaisquer efeitos da memória espacial ou preferência. Este sistema também pode ser usado para outros testes de discriminação, como a discriminação sexual. O aparelho personalizado é fácil de produzir, e o sistema de análise é acessível ao público como um código de código aberto, permitindo assim seu uso em qualquer laboratório. Demonstramos a capacidade deste sistema de medir múltiplos parâmetros de comportamento social em cepas de roedores com cores distintas de pele durante os testes de preferência social e novidade social. Também validamos a capacidade do sistema de revelar dinâmicamodifica do comportamento social em roedores após manipulações, como corte de bigode.

Software TrackRodent: três algoritmos foram escritos em MATLAB (2014a-2019a) para rastrear o sujeito experimental e suas interações com os estímulos. Todos os algoritmos foram depositados no GitHub, encontrados em . O principal objetivo de todos os quatro algoritmos é rastrear os contornos do corpo do sujeito para detectar qualquer contato direto com as áreas de estímulos.

Algoritmo baseado no corpo: este algoritmo tem três versões que rastreiam os contornos de um mouse escuro sem fio em um fundo branco (BlackMouseBodyBased), um mouse branco em um fundo escuro (WhiteMouseBodyBased), ou um rato branco em um fundo escuro (WhiteRatBodyBased ). A interface gráfica do usuário (GUI) do software requer que o experimentador escolha um experimento usando mouses ou ratos e, em seguida, selecione o código correto. Para cada versão do algoritmo, existem dois códigos opcionais: um que apresenta o processo de rastreamento na tela enquanto executa a análise, e um que não (portanto, ele é executado mais rápido e é denominado "rápido"). Por exemplo, os nomes dos códigos relevantes para o algoritmo BlackMouseBodyBased são: "BlackMouseBodyBased23_7_14" e "BlackMouseBodyBased23_7_14_Fast". Todos os algoritmos que terminam com "rápido" não mostram o rastreamento on-line, e os usuários devem salvar diretamente os dados para o arquivo de resultados (arquivo.mat). Todos os algoritmos baseados no corpo exigem a definição de um único limite ("limite baixo" no GUI do software) para detectar o corpo do sujeito.

Algoritmo baseado na direcionalidade da cabeça: o segundo algoritmo, que está disponível apenas para camundongos pretos, é baseado no algoritmo baseado no corpo, além de determinar a direcionalidade da cabeça. Esse algoritmo detecta as interações da cabeça do sujeito com as áreas de "estímulos", evitando assim falsos positivos que podem surgir de contatos aleatórios do sujeito com essas áreas. Para este algoritmo, dois limiares de detecção de contornos do corpo do rato são definidos: limiar elevado, que inclui a cauda mais brilhante de ratos pretos, e baixo limiar, que inclui o corpo sem cauda. Depois disso, o algoritmo se encaixa em um elipsóide para os limites detectados usando o limiar inferior e define a localização da cabeça e cauda do mouse (sem distinção entre os dois). A discriminação final entre a cauda e a cabeça baseia-se nos limites definidos pelo limiar mais elevado.

Algoritmo animal com fio: o terceiro algoritmo visa minimizar artefatos resultantes de cabos (ou seja, fio elétrico ou fibra óptica) conectados ao animal, permitindo a análise do comportamento do animal enquanto conectado a um cabo. Este algoritmo tem códigos apenas para ratos pretos e ratos brancos. O código para ratos requer que o experimentador defina limites baixos e altos, enquanto o código do mouse requer apenas um limiar baixo.

Protocol

Todos os métodos descritos foram aprovados pelo Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) da Universidade de Haifa.

1. Configuração experimental

1. Arena
   1. Construa a arena experimental para camundongos(Figura 1A,D)colocando uma caixa de plexiglass branca ou preta (dependendo da cor do animal) (37 cm x 22 cm x 35 cm) no meio de uma câmara acústica (60 cm x 65 cm x 80 cm, feita de madeira grossa de 2 cm revestida por dentro com espuma de 2 cm de espessura). Para a luz, retire uma tira (2 cm de largura, 10 cm abaixo do teto da câmara) da espuma ao redor da câmara acústica (além da porta), e anexar uma tira de LED com lâmpadas vermelhas ou brancas. Certifique-se que a luz é tão uniforme quanto possível em torno da arena para impedir reflexões.
   2. Construa a arena para ratos similarmente a esse descrito acima para ratos, com as dimensões diferentes que cabem apropriadamente o tamanho de ratos de Sprague-Dawley (SD) (figura 1G). Coloque uma caixa de plexiglass preto (50 cm x 50 cm x 40 cm) no meio de uma câmara acústica (90 cm x 60 cm x 85 cm, feita de madeira de 2 cm de espessura revestida no interior com espuma de 2 cm de espessura).
2. Câmaras
   1. Para camundongos, crie duas câmaras triangulares pretas ou brancas (dependendo da cor da pele) (isosceles de 12 cm, 35 cm de altura, com os pisos fechados) a partir de plexiglass de 6 mm de espessura. Localizá-los em dois cantos opostos selecionados aleatoriamente da arena (Figura 1B,E). Coloque uma malha de metal (18 mm x 6 cm; 1 cm x 1 cm buracos) na parte inferior de cada câmara usando cola epóxi para permitir interações diretas com o estímulo através da malha(Figura 1C,F). Marque cada câmara de uma forma que permita a discriminação dos outros em um vídeo sem dar pistas sobre os sujeitos (ver Figura 1B,E, por exemplo).
      Nota: Cada câmara acabará por conter um estímulo social (mouse) ou objeto (brinquedo de plástico, 5 cm x 5 cm x 5 cm, com uma forma e cor distintas; Figura 1C, i inserções). Deixe o cheiro de cola epóxi evaporar por pelo menos uma semana antes do uso.
   2. Para ratos, crie duas câmaras triangulares pretas (20,5 cm de isosceles, 40 cm de altura, feita de plexiglass de 6 mm de espessura, com os pisos fechados) e coloque-as em dois cantos opostos selecionados aleatoriamente da arena (Figura 1H), cada um com uma malha metálica (25 cm x 7 cm; 2,5 cm x 1 cm de buracos) cobrindo sua porção inferior(Figura 1).
3. Coloque uma câmera monocromática de alta qualidade, equipada com uma lente grande angular, no topo da câmara acústica e conecte-a a um computador para permitir visualização e gravação claras do comportamento do sujeito usando software comercial (veja Tabela de Materiais para sugestões).

2. Paradigma comportamental

Nota: Os passos 2.1-2.7 descrevem o paradigma comportamental para camundongos. Veja a seção 2.8 para instruções específicas que envolvem ratos.

1. Certifique-se de que as gaiolas de todos os animais (sujeitos: camundongos machos de 2-4 meses de idade; estímulos: camundongos juvenis de 21-30 dias de idade) permaneçam na sala experimental por pelo menos 1 h antes de iniciar o experimento comportamental.
2. Após o período de aclimatação, insira duas câmaras vazias na arena aleatoriamente em dois cantos opostos. Coloque o assunto no meio da arena por 15 min de habituação. Durante esse tempo, coloque os dois estímulos sociais, cada um em uma câmara diferente localizada fora da arena para habituação. Coloque um objeto (um brinquedo de plástico, 5 cm x 5 cm x 5 cm, com uma forma e cor distintas) em outra câmara.
3. Para realizar o teste de preferência social (SP), inicie a gravação de vídeo e continue gravando até o final do teste.
4. Retire as duas câmaras vazias e insira imediatamente o objeto e um dos estímulos sociais, cada um em uma câmara distinta. Localizar essas câmaras aleatoriamente nos cantos opostos da arena que estavam vazios durante a habituação. Permita que o sujeito interaja com os estímulos para os 5 min do teste sp. No final do teste, pare de gravar.
5. Após o teste sp, remover as câmaras contendo estímulos da arena e deixar o assunto na arena vazia por 15 min. Limpar as câmaras de fora com 10% lenços de etanol.
6. Para realizar o teste de preferência de novidade social (SNP), iniciar gravação de vídeo e inserir duas câmaras na arena: uma contendo o mesmo estímulo social utilizado para o teste sp (estímulo familiar), e o outro contendo o novo estímulo social. Coloque essas câmaras aleatoriamente em dois cantos opostos da arena, certificando-se de que esses locais não foram usados para o teste sp. Permita que o sujeito interaja com os estímulos para os 5 min do teste SNP.
7. No final do teste SNP, parar a gravação de vídeo, remover o assunto e câmaras da arena, e colocar o assunto de volta em sua gaiola em casa. Deixe os estímulos nas câmaras para o próximo experimento (com outro assunto) ou devolvê-los às suas gaiolas em casa. Limpe a arena e câmaras com água corrente seguida de 10% de etanol e deixe secar.
8. Paradigma comportamental para ratos
   1. Para os ratos, repita o paradigma comportamental descrito nos passos 2.1-2.7, com duas modificações: 1) lidar com os sujeitos do rato e habituar os estímulos sociais para as câmaras por 2 dias (10 min todos os dias) antes do experimento; e 2) estender o teste sp para 15 min para dar aos ratos um longo período de exposição a estímulos sociais. Posteriormente, restringir a análise do teste SP ao inicial de 5 min.
      Nota: Pelo menos uma arena e cinco câmaras são necessárias para executar uma única sessão.

3. Usando o GUI TrackRodent para análise comportamental

Nota: Veja o painel superior da Figura 2A para o TrackRodent GUI.

1. Abra o MATLAB (testado com 2014a-2019a) e escolha a pasta TrackRodent.
2. Adicione todas as subdobras à via de trabalho clicando em cada pasta e selecionando Adicionar ao Caminho | Pastas selecionadas e subdobradores.
3. Tipo TrackRodent na janela de comando e imprensa Enter.
4. Envie um único arquivo ou vários arquivos de vídeo (formato AVI ou MP4) selecionando o arquivo da sessão de carga (AVI).
5. Um inspetor de filmes, permitindo a inspeção do clipe de vídeo quadro a quadro, será imediatamente aberto para o primeiro arquivo na lista(Figura 2A). Use-o para examinar o clipe de vídeo e definir o primeiro e último quadros do segmento a serem analisados. Registre os números desses quadros, que serão necessários mais tarde. Feche a janela quando estiver pronto.
6. Para inspecionar arquivos de vídeo adicionais, abra o inspetor de vídeo a qualquer momento pressionando o filme inspect e selecionando um arquivo de vídeo específico.
7. Selecione as espécies testadas (rato ou rato; o rato é o padrão).
8. Exclua todas as áreas que podem interromper o rastreamento, de acordo com as cores do sujeito e da arena (preto ou branco).
   1. Para excluir uma determinada área, a imprensa exclui a área,e após as alterações do cursor para uma forma transversal, marque todos os cantos da área para exclusão. Quando feito, clique à direita no mouse, em seguida, clique duas vezes à esquerda no centro da área marcada. A área excluída se tornará um tom de vermelho na tela. Repita este procedimento para excluir tantas áreas quanto necessário.
9. Para remover uma área da exclusão, pressione remover a área excluída,em seguida ( usando o cursor cruzado) clique na área para ser removido da exclusão.
10. Para definir cada câmara como uma área de "estímulo", para detecção automática de sua investigação pelo sujeito, escolha a forma da área de 'estímulo' para ser poligão ou elíptica, verificando a caixa apropriada, em seguida, pressionando Estímulo X (onde "X" representa 1, 2 ou 3). Marque as áreas de "estímulo" de forma semelhante às áreas excluídas, que se tornarão de cor amarela. Para alterar a localização de uma área específica de "estímulo", pressione o Estímulo X novamente e marque o novo local da área (isso atualizará automaticamente o local).
    Nota: Escolha o número de estímulos diferentes de forma consistente para todos os arquivos (ou seja, objeto como estímulo 1 para todos os arquivos de teste SP).
11. Para acompanhar a presença do sujeito em um compartimento virtual específico dentro da arena, escolha a forma da área 'compartimento' (polígono ou elíptico), em seguida, pressione o Compartimento X (onde "X" representa 1, 2, 3, 4 ou 5). Marque as áreas "compartimento" de forma semelhante às áreas excluídas ou estímulos, que, em seguida, tornar-se-ão de cor azul. Para alterar a localização de uma área específica de "compartimento", pressione o Compartimento X novamente e marque o novo local da área (isso atualizará automaticamente o local).
12. Escolha o algoritmo desejado (BlackMouseBodyBased foi usado para o vídeo) da lista (veja algoritmos disponíveis na Figura 2B).
13. Escreva os números de quadros de partida e final para a análise nas caixas de eitamento correspondentes do GUI.
14. Escolha um limite para detectar o corpo do sujeito.
    Nota: A maioria dos algoritmos usa apenas o limite "baixo", enquanto os algoritmos baseados em direcionalidade da cabeça também usam o limite "Alto". Para o limite "baixo", escolha um nível que inclua o corpo do rato/rato sem a cauda (tanto quanto possível), quando o ponto inicial "elevado" igualmente der a cauda. No caso do uso de algoritmos baseados em direcionalidade da cabeça, o software determinará a localização da cabeça como sendo oposta à localização da cauda.
    Nota: O software mais tarde ignora pequenos objetos detectados usando o limite escolhido.
15. Para avaliar a detecção automática das fronteiras do sujeito para um determinado limite, insira um valor no campo limite relevante e pressione O Digite no teclado.
16. Ao escolher vários arquivos, mova-se para o próximo arquivo (usando o botão Next na parte superior) e selecione as definições apropriadas para cada arquivo. Quando terminar, verifique os parâmetros e locais da área para todos os arquivos, movendo-se entre cada um, usando os botões Anteriores e Next na parte superior do GUI.
    Nota: As definições de todas as áreas e parâmetros são específicas de um determinado arquivo.
17. Para iniciar a análise comportamental de todos os arquivos selecionados, mova-se para o primeiro arquivo e pressione O Início.
18. No final da análise, um arquivo de resultados (.arquivo mat) é guardado para cada filme no mesmo diretório dos arquivos do filme.
    Nota: Se a versão lenta (não-rápida) do algoritmo for usada, ele também salvará uma versão do filme com uma cruz branca do centro da massa corporal, que muda sua cor a cada quadro que é detectado como investigação, a menos que o botão de alternância do filme analisado da Save seja descontrolado. Esta versão do filme (salvo no mesmo diretório, com o mesmo nome do filme original, com o sufixo 'filme analisado') pode ser usada offline para avaliar a qualidade da detecção automática realizada pelo sistema.

4. Usando o GUI TrackRodent para apresentação de resultados

Nota: Veja o painel inferior da Figura 2A para apresentação de resultados.

1. Para inspecionar os resultados de cada arquivo de filme, a imprensa load resulta no arquivo e escolha os arquivos .mat gerados pela análise comportamental.
2. Mova-se entre os botões de alternância para examinar na tela qualquer uma das seguintes análises: rastreamento de localização do mouse (Figura 2A); Ocupação de compartimentos ao longo da sessão (se 'compartimentos' foram definidos, não mostrados); Exploração de estímulos ao longo da sessão(Figura 2C); Tempo total em compartimentos (se 'compartimentos' foram definidos, não mostrado); e Tempo total de exploração de estímulos(Figura 2D).
   Nota: Áreas de 'estímulo' são áreas em que o software avalia a interação do sujeito, enquanto as áreas 'Compartimento' são áreas em que o software rastreia a presença do sujeito. Interromper a análise usando o botão de análise stop economizará automaticamente os resultados gerados até o último quadro analisado. Para a maioria dos computadores, deve ser possível fazer upload e analisar até 20 filmes ao mesmo tempo (dependendo do desempenho do computador).

5. Usando o TrackRodentPopulationSummary GUI para análise populacional (Figura 2E)

1. Abra o MATLAB (testado com 2014a-2019a) e escolha a pasta TrackRodent.
2. Tipo TrackRodentPopulationSummary na janela de comando e imprensa Enter.
3. Faça upload de vários arquivos de resultados do TrackRodent (formato.mat) pressionando os arquivos de resultados da Escolha.
4. Preencha os números do Último quadro para análise, nome de teste, nome de estímulo 1e nome de Estímulo 2.
5. Escolha as análises desejadas da lista de análises opcionais, verificando todas as caixas apropriadas.
6. Escolha os resultados da Exportação para uma folha de epeadsheet, verificando a caixa apropriada para extrair todos os resultados das análises verificadas como um único arquivo de planilha.
7. Pressione Comece e espere até que a análise seja concluída.
   Nota: Isso conclui a análise. O software pode ser usado para analisar os resultados de tantos arquivos de filmes quanto desejado, uma vez que todos eles foram analisados comportamentalmente usando o software TrackRodent. A análise realizada pelo software assume gravação de vídeo a uma taxa de quadros de 30 Hz. No caso de uma taxa de quadros diferente foi utilizada, multiplique o tempo em 30 e divida pela taxa de quadros utilizada para o registo para a converter ao valor correto (s).

Results

Usando o sistema para o teste de preferência social em camundongos C57BL/6J
A Figura 1 mostra três versões da configuração experimental. A primeira versão(Figura 1A-C)é projetada para ratos com cores de pele escura, como camundongos C57BL/6J. O segundo (Figura 1D-F)está prevista para camundongos com cores de peles brilhantes, como balb/c ou icr (C...

Discussion

O sistema experimental descrito aqui, que foi projetado como uma alternativa ao aparelho de três câmaras^2,5,permite o desempenho dos mesmos testes ao resolver algumas de suas limitações. O uso de câmaras triangulares, que estão localizadas em dois cantos opostos da arena retangular, limita a área de interação de estímulo ao sujeito a um plano bem definido, permitindo assim uma análise automatizada precisa do comportamento de investigação. Uma vantagem é o uso do ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Flea3 1.3 MP Mono USB3 Vision	FLIR (anteriormente PointGrey)	FL3-U3-13Y3M-C	Câmera Monocromática
FlyCap 2.0	FLIR (anteriormente PointGrey)	FlyCapture 2.13.3.61X64	Software de gravação de vídeo
Home 5 minutos Cola epóxi	Devocon	20845	Para colar a malha de metal nas câmaras de estímulos de acrílico
Matlab 2014-2019	MathWorks	R2014a - R2019a	Ambiente de programação
Placas de acrílico (6 mm de espessuraPreto ou branco)	Melina (1990) LTD, Israel	NaN	Para construção de arena e câmaras de estímulos
Tiras de led vermelhas (60 leds por metro) conectadas a uma fonte de alimentação de 12 V	2012topdeal Fornecedor do eBay	NaN	Para iluminação da câmara acústica