É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.

Artigo de método

Culturas organóides da próstata como ferramentas para traduzir genótipos e perfis mutacionais para respostas farmacológicas

9.9K visualizações

⸱

DOI:

10.3791/60346

⸱

24 de outubro de 2019

 ,  ,  , 
1Human Oncology and Pathogenesis Program, Memorial Sloan Kettering Cancer Center, 2Howard Hughes Medical Institute

Neste artigo

Resumo

Apresentado aqui é um protocolo para estudar as respostas farmacológicas em organóides epitelia da próstata. Organóides se assemelham à biologia in vivo e recapitulam a genética do paciente, tornando-os sistemas modelo atraentes. Organóides da próstata podem ser estabelecidos a partir de próstatas wildtype, modelos de camundongos geneticamente modificados, tecido humano benigno, e câncer de próstata avançado.

Resumo

Apresentado aqui é um protocolo para estudar farmacodinâmica, potencial de células-tronco e diferenciação de câncer em organóides epitelia da próstata. Organóides da próstata são culturas orrógenas e tridimensionais (3D) cultivadas em um meio definido que se assemelha ao epitélio prostático. Organóides da próstata podem ser estabelecidos a partir de modelos de camundongos do tipo selvagem e geneticamente modificados, tecido humano benigno e câncer de próstata avançado. Importante, os organóides derivados pacientes assemelham-se pròxima a tumores na genética e na biologia in vivo do tumor. Além disso, os organóides podem ser manipulados geneticamente usando sistemas CRISPR/Cas9 e shRNA. Essas genéticas controladas tornam a cultura organóide atraente como uma plataforma para testar rapidamente os efeitos dos genótipos e perfis mutacionais nas respostas farmacológicas. No entanto, os protocolos experimentais devem ser especificamente adaptados à natureza 3D das culturas organóides para obter resultados reprodutíveis. Descritos aqui são protocolos detalhados para a realização de ensaios de semeada para determinar a capacidade de formação organóide. Posteriormente, este relatório mostra como realizar tratamentos medicamentosos e analisar a resposta farmacológica através de medições de viabilidade, isolamento de proteínas e isolamento de RNA. Finalmente, o protocolo descreve como preparar organóides para xenoenxerto e subsequentes ensaios de crescimento in vivo usando enxerto subcutâneo. Esses protocolos produzem dados altamente reproduzíveis e são amplamente aplicáveis a sistemas de cultura 3D.

Introdução

A resistência aos medicamentos é um dos principais problemas clínicos no tratamento do câncer. O tratamento metastático do câncer de próstata (PCa) é direcionado principalmente para o eixo de sinalização de andrógenos. Terapias anti-andrógenos de última geração (por exemplo, enzalutamida e abiraterona) mostraram grande sucesso clínico, mas praticamente todas as PCa eventualmente progridem em direção a um estado independente de andrógeno, ou câncer de próstata resistente à castração (CRPC).

Perfil genômico e transcriptômico recente do CRPC revelou que existem três mecanismos gerais de resistência no câncer de próstata: 1) ativando mutações, resultando na restauração do receptor andrógeno (AR) sinalização1; 2) ativação da sinalização de bypass, como exemplificado em um modelo pré-clínico para a resistência à terapia anti-andrógeno de última geração em que a ativação do receptor glicocorticoide (GR) pode compensar a perda de sinalização ar2; e 3) o processo recentemente identificado de plasticidade da linhagem, em que as células tumorais adquirem resistência ao alternar linhagens de um tipo de célula dependente do alvo da droga para outro tipo de célula que não depende disso (que, em PCa, é representado como AR-negativo e/ou doença neuroendócrina [NEPC])3,4. No entanto, os mecanismos moleculares que causam resistência aos medicamentos não são compreendidos. Além disso, a resistência antiandrógena adquirida pode levar a vulnerabilidades terapêuticas que podem ser exploradas. Portanto, é essencial avaliar as respostas de medicamentos em sistemas modelo que imitam fenótipos e genótipos de pacientes.

Organóides da próstata são culturas organotípicas cultivadas em uma matriz de proteína 3D com um meio definido. Importante, organóides da próstata podem ser estabelecidos a partir de tecido benigno e canceroso de urina ou origem humana, e eles mantêm características erofópicas e genotípicas encontradas in vivo5,6. É importante ressaltar que tanto as células sensíveis ao PCa e crpc antiandrógenas estão representadas no atual compêndio de organóides. Além disso, os organóides da próstata são facilmente manipulados geneticamente usando CRISPR/Cas9 e shRNA5. Assim, organóides da próstata são um sistema modelo adequado para testar respostas de medicamentos e elucidar mecanismos de resistência. Aqui, um protocolo detalhado é descrito para realizar testes de drogas e analisar as respostas farmacológicas usando organóides da próstata.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Protocolo

Todo o trabalho descrito neste protocolo foi executado com organóides previamente estabelecidos do murine e organoids paciente-derivados. Todo o trabalho animal foi realizado em conformidade com as diretrizes do Centro de Recursos Animais de Pesquisa do Memorial Sloan Kettering Cancer Center (IACUC: 06-07-012). Todos os tecidos derivados do paciente foram coletados em conformidade com as regras e regulamentos do Memorial Sloan Kettering Cancer Center (IRB: 12001).

1. Preparação média e tampão

  1. Descongele a matriz da membrana do porão (por exemplo, Matrigel) a 4 °C durante a noite antes de iniciar o experimento. Mantê-lo no gelo durante o uso.
  2. Coloque as placas de cultura a 37 °C por 24 h antes dos experimentos. Isso ajudará a cúpula da matriz de membrana do porão (a partir daí referida como cúpula matriz) a polimerizar. Os organóides de revestimento são descritos na etapa 2.1.2.
  3. Prepare o meio organóide de acordo com o protocolo estabelecido5.
  4. Prepare o meio organóide sem a adição do fator de crescimento epidérmico (EGF; consulte tabela de materiais para componentes). EGF suprime a saída transcricional AR e confere resistência anti-andrógeno5.
  5. Prepare o meio modificado da águia de Dulbecco (DMEM) com o soro bovino fetal de 10% (FBS).
    NOTA: Esta mídia é usada para inibir a digestão enzimática com substituição de trippsina nas seções 2-4.
  6. Prepare soluções de medicamentos de acordo com o protocolo do fabricante. Para enzalutamide/mdv3100 (posteriormente referido como anti-andrógeno de segunda geração), prepare uma solução de estoque de 100 μM em dimetil sulfoxide (DMSO). O estoque pode ser armazenado a -20 °C por até 6 meses e não precisa ser feito fresco.

2. Isolamento, digestão enzimática e estabelecimento de organóides

  1. Isolar organóides da próstata do rato ou tecido humano de acordo com os protocolos previamente estabelecidos5,7. Uma breve descrição é fornecida abaixo.
    1. Mince e enzimaticamente digerir tecido da próstata para produzir uma única suspensão celular. Neste experimento, 1 mL de 5 mg/mL collagenase tipo II em ADMEM/F12 foi utilizado para a digestão de 50 mg de tecido da próstata.
    2. Coletar células por centrífuga a 300 x g por 5 min, contar as células, resuspendê-las na matriz da membrana do porão e placa na densidade apropriada5,7 nas cúpulas matricia em placas de cultura organóide pré-aquecida (chapeamento método é mostrado na Figura 1A).
    3. Permita que as cúpulas se solidiem e adicionem mídia nos topos das cúpulas para que elas estejam completamente cobertas.
  2. Crescer organóides para a quantidade desejada para aplicações a jusante. O número celular pode ser determinado por métodos de contagem padrão. Veja a seção específica do protocolo para obter detalhes adicionais sobre densidade.
  3. Usando uma pipeta P1000, elaborar o meio e pipeta para cima e para baixo para interromper. Quando a matriz da membrana do porão é interrompida inteiramente, transfira a suspensão a um tubo cónico de 15 mL. Não coloque mais de 10 cúpulas por único tubo cônico de 15 mL. Centrífuga a 300 x g por 5 min.
  4. Desenhe o supernatant e lave a pelota da pilha com 5 mL de PBS. Centrífuga a 300 x g por 5 min.
  5. Tire o supernatant e resuspender a pelota em 4 mL de substituição trypsin. Resumo para 5-10 min com agitação a 37 °C. Adicione um volume igual de meio organóide + 10% FBS para inibir a substituição de tripsina. Centrífuga a 300 x g por 5 min.
  6. Desenhe o supernatant e resuspenda em 1 mL de PBS.
  7. Filtrar a suspensão com um filtro de 40 μm para garantir uma única suspensão celular. Quantifique o número da célula usando um hemocytometer ou dispositivo de contagem equivalente.
    NOTA: Se a obtenção de células únicas viáveis é difícil, use a classificação do fluxo para obter uma solução de célula única.

3. Avaliação da capacidade de formação organóide

NOTA: Para determinar a porcentagem de células que podem gerar um organóide, um ensaio de semeadura pode ser realizado como um proxy para o potencial de tronco/progenitor. A capacidade de formação organóide também é importante para definir um número de semeadura celular para os ensaios de viabilidade.

  1. Diluir a suspensão celular obtida na etapa 2,7 a 100 células por 10 μL da suspensão usando o meio organóide contendo 10 μM Rho kinase inibidor Y-27632.
  2. Transfira 1.100 células (110 μL de suspensão) para um novo tubo cônico.
  3. Adicione 285 μL de matriz de membrana do porão e resuspenda as células. Isso resultará em uma concentração de matriz de ~70%.
    NOTA: Diluição da matriz de membrana do porão durante a semeanação reduz muito a variação no tamanho da cúpula, causada pela viscosidade da matriz proteica.
  4. Células de sementes em 35 μL de cúpulas matricias em uma placa de 24 poços pré-aquecida, resultando em 200 células/poço. Placa 3-5 replica por amostra (também ver o método de revestimento na Figura 1A e passo 2.1.2).
  5. Para garantir que as células permaneçam dentro da cúpula da matriz, vire a placa e coloque-a em uma incubadora celular para solidificar a matriz da membrana do porão.
  6. Após 10 min, retire a placa da incubadora e adicione o meio contendo o inibidor da quinase Rho.
  7. Refresque o meio a cada 2 dias. Após 7 dias, quantifique o número de organóides. Mantenha o inibidor da quinase Rho na mídia durante todo o experimento.
  8. Conte o número de organóides estabelecidos por cúpula e calcule a porcentagem de organóides formados a partir do número total de células banhadas (200 células).
    NOTA: As proporções de estabelecimento organóide variam de 3% a 60%, dependendo do tipo celular e do genótipo.

4. Determinando respostas farmacológicas de organóides

  1. Continuando a partir do passo 2.7, sementes 1.000-10.000 células em uma cúpula matriz. Use a eficiência de formação organóide e velocidade de crescimento como um proxy para determinar o número final da célula.
    NOTA: Os números de celular recomendados são fornecidos na Tabela 1. Use três a cinco replica por condição por análise. Use uma concentração final de 70% de matriz de membrana do porão para reduzir os erros de tubulação induzidos pela viscosidade.
  2. Semente 35 μL de cúpulas matricezem em uma placa de 24 poços e deixe as cúpulas solidificarem como feito na seção 3 (também veja o método de revestimento na Figura 1A e passo 2.1.2). Adicione o meio contendo o inibidor de quinase Rho e a droga de escolha. Este método pode ser aplicado a todas as drogas, mas neste protocolo, um anti-andrógeno de segunda geração é usado em 10 μM por exemplo. Para determinar a concentração inibidora máxima (IC50), realize um log10 incremental e, como controle, use o veículo no qual a droga foi dissolvida.
  3. Refresque o meio a cada dois ou três dias e analise os organóides no dia 7 para determinar a resposta farmacológica da droga. Os pontos de tempo podem variar entre a escolha do experimento e da droga.
    NOTA: Organóides não precisam ser trypsinizados para realizar esses ensaios.
  4. Para manter os organóides intactos, usando uma pipeta P1000, elabore o meio e pipeta para cima e para baixo para interromper a matriz da membrana do porão.
  5. Quando a matriz da membrana do porão é interrompida inteiramente, transfira a suspensão a um tubo cónico de 15 mL. Não transfira mais de 10 cúpulas matricadas por tubo cônico de 15 mL.
  6. Centrífuga a 300 x g por 5 min. Tire o supernatant e lave com 5 mL de PBS.
  7. Resuspenda organóides em 1 mL de PBS e interrompa os organóides usando trituração e uma pipeta pasteur de vidro.
  8. Quantificar o número de fragmentos organóides. Semente 5 replica contendo 100 fragmentos organóides, conforme descrito no passo 2.1.2.
  9. Realize o ensaio de viabilidade celular descrito abaixo na seção 7.

5. Isolamento de RNA de organóides

NOTA: Os métodos baseados em colunas comercialmente disponíveis produzem boa quantidade e qualidade de RNA. Para garantir rna de boa quantidade, use um mínimo de uma cúpula por amostra; no entanto, o uso de três cúpulas é recomendado, que pode ser semeado em um único poço de uma placa de 12 poços.

  1. Adicionar ß-mercaptoetanol (1%) para o tampão de linéia glutationa no kit de isolamento RNA.
  2. Retire o meio das cúpulas de membrana do porão contendo organóides e adicione 750 μL deste buffer. Pipeta para cima e para baixo usando uma pipeta P1000. Verifique se toda a matriz de membrana do porão foi dissolvida.
  3. Adicione 750 μL de 70% de etanol e misture por pipetting. Posteriormente transferir 700 μL da mistura para a coluna, centrífuga em 12.000 x g por 1 min, e repita com o restante do lysate.
  4. Executar laves e tratamento de DNase na coluna de acordo com as instruções do fabricante. Elute RNA em 30-50 μL de água livre de RNAse.
  5. Medir as concentrações usando um flódromo em OD = 260 nm e 280 nm e armazenar a -80 °C ou continuar com aplicações a jusante.

6. Isolamento proteico de organóides

NOTA: Para o isolamento de proteínas, prepare o amortecedor RIPA padrão contendo inibidores de fósforoe protease(Mesa de Materiais). Usando pelo menos três cúpulas é recomendada, que pode ser semeada em um único 12 bem.

  1. Usando uma pipeta P1000, elabore o meio da célula com as cúpulas de membrana do porão contendo organóides e pipetos para cima e para baixo para interromper a matriz da membrana do porão.
  2. Quando totalmente interrompido, transfira a suspensão para um tubo cônico de 15 mL. Centrífuga a 300 x g por 5 min.
  3. Desenhe o supernatant e lave com 5 mL de PBS gelado. Centrífuga a 300 x g por 5 min.
  4. Tire o supernatant e resuspender a pelota em 4 mL de substituição trypsin. Dime por 5-10 min enquanto treme a 37 °C.
  5. Adicione um volume igual de meio organóide + FCS de 10% para inibir a substituição da trippsina. Centrífuga a 300 x g por 5 min.
    NOTA: Pós-centrífugação, nenhuma matriz de membrana do porão deve ser visível na pelota.
  6. Desenhe o supernatant e lave com 5 mL de PBS gelado. Desenhe o supernatant e resuspenda a pelota da pilha em 300 μL do amortecedor da lyse usando um pipet de P1000, a seguir transfira a um tubo do microcentrífuga de 1.5 mL.
  7. Incubar no gelo por 10 min e, posteriormente, sonicate 2x para 30 s cada em água resfriada com uma temperatura de 4 °C. Coloque o tubo de volta no gelo e realizar quantificação de proteína usando métodos padrão.
  8. Desnaturar a proteína adicionando sulfato dodcyl de sódio (SDS) contendo tinuoso de carregamento e deixe ferver por 5 min a 95 °C. Armazenar lysates a -80 °C ou continuar com aplicações a jusante.

7. Ensaio de viabilidade celular com organóides

NOTA: A viabilidade celular pode ser avaliada usando o kit de ensaio de viabilidade celular disponível comercialmente e um luminomômetro. Prepare buffers de acordo com as instruções do fabricante. Recomenda-se cinco réplicas por condição: uma réplica consistindo de uma cúpula de matriz de membrana de porão de 35 μL em um poço de uma placa de 24 poços.

  1. Desenhe o meio da cultura organóide, tendo o cuidado de deixar as cúpulas matricia intactas.
  2. Adicione 65 μL de PBS e pipeta para cima e para baixo para interromper a cúpula matriz.
  3. Adicione 100 μL do buffer do kit de ensaio de viabilidade celular e resuspenda por pipetting.
  4. Incubar à temperatura ambiente (RT) para 10 min com agitação.
  5. Transfira 100 μL de mistura para uma placa não translúcida adequada para o lumimosômetro e execute a leitura de acordo com as instruções do fabricante para o kit de ensaio de viabilidade celular.

8. Preparação de organóides para xenoenxerto

NOTA: Organóides também são passíveis de enxerto subcutâneo em ambos os animais imunocomprometidos, bem como, ratos isógênicos. Para garantir que os organóides injetados sejam in vivo, rotule organóides com um fluorofiforre constitutivamenteexpressor 5. Recomenda-se realizar um experimento piloto para enxertia usando 5 x 105 células para 2 x 106 células por injeção, com incrementos de 5 x 106 células, já que a eficiência do enxerto varia entre as linhas organóides.

  1. Usando uma pipeta P1000, elabore o meio e pipeta para cima e para baixo para interromper a matriz de membrana do porão. Quando totalmente interrompido, transfira a suspensão para um tubo cônico de 15 mL. Centrífuga a 300 x g por 5 min.
    NOTA: Não transfira mais de 10 cúpulas matrica por tubo cônico de 15 mL.
  2. Desenhe o supernatant e lave com 5 mL de PBS. Centrífuga a 300 x g por 5 min.
  3. Tire o supernatant e resuspender a pelota em 4 mL de substituição trypsin. Dime por 5-10 min enquanto treme a 37 °C.
  4. Adicione o volume igual de meio organóide + 10% FBS para inibir a substituição de tripsina. Centrífuga a 300 x g por 5 min.
  5. Desenhe o supernatant e resuspenda em 1 mL de PBS. Filtrar a suspensão com um filtro de 40 μm para garantir uma única suspensão celular. Quantificar as células usando métodos padrão.
  6. Desça e resuspenda as células do inibidor pbs + rho para uma concentração de 2 x 106 células por 100 μL (ver Tabela 2 para concentrações celulares e número de células absoluta necessária para diferentes concentrações). Use um volume igual de matriz de membrana do porão para gerar uma suspensão 1:1. Coloque a suspensão no gelo.
  7. Injetar células de acordo com protocolos padrão e monitorar o crescimento xenoenxerto usando métodos padrão8.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Resultados

Eficiência de semeada
A capacidade de formação de organóides é determinada por fenótipo e genótipo. As células basais da próstata do tipo selvagem (WT) apresentaram capacidade superior de formação organóide (30%-40%) em comparação com as células luminais (3%) (Figura 1A). Após o estabelecimento organóide, a capacidade de formação aumentou drasticamente. Normalmente, 25%-30% das células derivadas de um organóide WT podem fo...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Discussão

Compreender os mecanismos moleculares subjacentes à resistência antiandrógena e descobrir potenciais vulnerabilidades terapêuticas requer testes de respostas farmacológicas em sistemas modelo que imitem o câncer de próstata. Descrito aqui é um protocolo detalhado para a análise confiável das respostas farmacológicas em organóides de próstata derivados e geneticamente modificados do paciente e a preparação dessas amostras organóides para aplicações a jusante.

Há dois passos críticos neste proto...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Divulgações

A C.L.S atua no conselho de administração da Novartis; é co-fundador da ORIC Pharmaceuticals e coinventor da enzalutamida e apalutamida; é consultor científico da Agios, Beigene, Blueprint, Column Group, Foghorn, Housey Pharma, Nextech, KSQ, Petra e PMV; e é co-fundador da Seragon, comprada pela Genentech/Roche em 2014. W.R.K. é um coinventor e detentor de patentes da tecnologia organóide.

Agradecimentos

K.P. é apoiado pelo NIH 1F32CA236126-01. A C.L.S. é apoiada pela HHMI; CA193837; CA092629; CA224079; CA155169; CA008748; e Starr Cancer Consortium. W.R.K. é apoiado pela Dutch Cancer Foundation/KWF Buit 2015-7545 e pela Prostate Cancer Foundation PCF 17YOUN10.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
A83-01Tocris2939Componente do meio organoide: Concentração final 200 nM
ADMEM/F12Gibco/Life technologies12634028Componente do meio organoide
B27Gibco/Life technologies17504-044Componente do meio organoide
Placas de cultura de célulasFisher657185
Cell Titer GloPromegaG7571
DHTSigma-AldrichD-073Componente do meio organoide: Concentração final 1 nM
DMSOFisherBP231-100
EGFPeprotech315-09Componente do meio organoide: Concentração final 50 ng/ml para camundongo, 5 ng/nl para humano
FGF10Peprotech100-26Componente do meio organoide específico humano: Concentração final 10 ng/ ml
FGF2Peprotech100-18BComponente de meio organoide específico humano: Concentração final 5 ng/ml
GlutamaxGibco/Life technologies35050079Componente de meio organoide
HEPESFABRICADO INTERNAMENTEN/AComponente de meio organoide: Concentração final 10 mM
Matrigel (Fator de crescimento reduzido & Livre de vermelho de fenol)CorningCB-40230CComponente do meio organoide
N-acetilcisteínaSigma-AldrichA9165Componente do meio organoide: Concentração final 1,25 mM
NicotinamidaSigma-AldrichN0636Componente do meio organoide específico humano: Concentração final 10 mM
NOGGINPeprotech ou células 293t transfectadas estáveis com construção Noggin (Karthaus et al. 2014)120-10CComponente do meio organoide: Concentração final 10% do meio condicionado ou 100 ng/ml
Penicilina/EstreptavidinaGemini Bio-Products400-109Componente do meio organoide
Inibidores da fosfataseMerck Millipore524629
Prostaglandina E2Tocris3632464
Inibidores da protease MerckMillipore539131
R-SPONDINPeprotech ou células 293t transfectadas estáveis com construção R-Spondin1 (Karthaus et al. 2014)120-38Componente do meio organoide: Concentração final 10% de meio condicionado ou tampão RIPA de 500 ng/ml
Merck20-188
RNA-easy minikitQiagen74104
SB202190Sigma-Aldrich152121-30-7Componente do meio organoide específico humano: Concentração final 10 μ M
TryplEThermoFisher12605036
Y-27632SelleckchemS1049Componente médio organoide: Concentração final 10 μ O

Referências

  1. Robinson, D., et al. Integrative Clinical Genomics of Advanced Prostate Cancer. Cell. 162 (2), 454(2015).
  2. Arora, V. K., et al. Glucocorticoid Receptor Confers Resistance to Antiandrogens by Bypassing Androgen Receptor Blockade. Cell. 155 (6), 1309-1322 (2013).
  3. Ku, S. Y., et al. Rb1 and Trp53 cooperate to suppress prostate cancer lineage plasticity, metastasis, and antiandrogen resistance. Science. 355 (6320), 78-83 (2017).
  4. Mu, P., et al. SOX2 promotes lineage plasticity and antiandrogen resistance in TP53- and RB1-deficient prostate cancer. Science. 355 (6320), 84-88 (2017).
  5. Karthaus, W. R., et al. Identification of Multipotent Luminal Progenitor Cells in Human Prostate Organoid Cultures. Cell. 159 (1), 163-175 (2014).
  6. Gao, D., et al. Organoid Cultures Derived from Patients with Advanced Prostate Cancer. Cell. 159 (1), 176-187 (2014).
  7. Drost, J., et al. Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue. Nature Protocols. 11 (2), 347-358 (2016).
  8. Bose, R., et al. ERF mutations reveal a balance of ETS factors controlling prostate oncogenesis. Nature. 546 (7660), 671-675 (2017).
  9. Platt, R. J., et al. CRISPR-Cas9 Knockin Mice for Genome Editing and Cancer Modeling. Cell. 159 (2), 440-455 (2014).
  10. Carver, B. S., et al. Reciprocal feedback regulation of PI3K and androgen receptor signaling in PTEN-deficient prostate cancer. Cancer Cell. 19 (5), 575-586 (2011).
  11. Puca, L., et al. Patient derived organoids to model rare prostate cancer phenotypes. Nature Communications. 9 (1), 2404(2018).
  12. Gao, D., et al. Organoid Cultures Derived from Patients with Advanced Prostate Cancer. Cell. 159 (1), 176-187 (2014).
  13. Puca, L., et al. Delta-like protein 3 expression and therapeutic targeting in neuroendocrine prostate cancer. Science Translational Medicine. 11 (484), eaav0891(2019).
  14. Dijkstra, K. K., et al. Generation of Tumor-Reactive T Cells by Co-culture of Peripheral Blood Lymphocytes and Tumor Organoids. Cell. 174 (6), 1586-1598 (2018).
  15. van de Wetering, M., et al. Prospective derivation of a living organoid biobank of colorectal cancer patients. Cell. 161 (4), 933-945 (2015).
  16. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  17. Barker, N., et al. Lgr5(+ve) stem cells drive self-renewal in the stomach and build long-lived gastric units in vitro. Cell stem cell. 6 (1), 25-36 (2010).
  18. Bartfeld, S., et al. In vitro expansion of human gastric epithelial stem cells and their responses to bacterial infection. Gastroenterology. 148 (1), 126-136 (2015).
  19. Huch, M., et al. Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver. Cell. 160 (1-2), 299-312 (2015).
  20. Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
  21. Schutgens, F., et al. Tubuloids derived from human adult kidney and urine for personalized disease modeling. Nature Biotechnology. 37 (3), 303-313 (2019).
  22. Sachs, N., et al. A Living Biobank of Breast Cancer Organoids Captures Disease Heterogeneity. Cell. , 1-25 (2017).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Reimpressões e permissões

Etiquetas

Cultivo de OrganoidesResposta Farmacol gicaAn lise de Gen tipoTratamento MedicamentosoEnsaio de ViabilidadeIsolamento de Prote nasIsolamento de RNAEnsaio de XenotransplanteCRISPR Cas9
Culturas organóides da próstata como ferramentas para traduzir genótipos e perfis mutacionais para respostas farmacológicas
Fale conosco
Recomendar à biblioteca

Privacidade

Termos de Uso

Políticas

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Todos os direitos reservados.