Summary
Esophageal rekonstruksjon er en utfordrende prosedyre, og utvikling av en vev-konstruert spiserør som muliggjør regenerering av esophageal mucosa og muskel, og som kan implanteres som en kunstig pode er nødvendig. Her presenterer vi vår protokoll for å generere en kunstig spiserør, inkludert stillasproduksjon, bioreaktordyrking og ulike kirurgiske teknikker.
Abstract
Bruk av biokompatible materialer for omkrets esophageal rekonstruksjon er en teknisk utfordrende oppgave hos rotter og krever en optimal implantatteknikk med ernæringsmessig støtte. Nylig har det vært mange forsøk på esophageal vev engineering, men suksessraten har vært begrenset på grunn av vanskeligheter i tidlig epitelisering i det spesielle miljøet av peristaltikk. Her utviklet vi en kunstig spiserør som kan forbedre regenerering av esophageal slimhinnen og muskellag gjennom en tolags rørformet stillas, en mesenchymal stamcellebasert bioreaktor system, og en bypass fôring teknikk med modifisert gastrostomi. Stillaset er laget av polyuretan (PU) nanofibre i en sylindrisk form med en tredimensjonal (3D) trykt polycaprolactone strand viklet rundt ytterveggen. Før transplantasjon ble menneskeavledede mesenchymale stamceller sådd inn i lumen av stillaset, og bioreaktordyrking ble utført for å forbedre cellulær reaktivitet. Vi forbedret graft overlevelsesraten ved å bruke kirurgisk anastomose og dekker den implanterte protesen med skjoldbruskkjertelklaff, etterfulgt av midlertidig nonoral gastrostomi fôring. Disse grafts var i stand til å rekapitulere funnene av første epitelisering og muskel regenerering rundt implanterte nettsteder, som demonstrert av histologisk analyse. I tillegg ble det observert økte elastinfibre og neovaskularisering i periferien av transplantatet. Derfor presenterer denne modellen en potensiell ny teknikk for omkrets esophageal rekonstruksjon.
Introduction
Behandlingen av esophageal lidelser, som medfødte misdannelser og esophageal karsinommer, kan føre til strukturell segmenttap av spiserøret. I de fleste tilfeller har autologe erstatningstransplantater, for eksempel magetrekkingsrør eller kolonforlag, blitt utført1,2. Imidlertid har disse esophageal erstatninger en rekke kirurgiske komplikasjoner og reoperasjon risiko3. Dermed kan bruk av vevskonstruerte spiserørstillasettere den innfødte spiserøret være en lovende alternativ strategi for til slutt å regenerere tapte vev4,5,6.
Selv om en vevskonstruert spiserør potensielt tilbyr et alternativ til dagens behandlinger av esophageal defekter, er det betydelige barrierer for sin in vivo søknad. Postoperativ anastomotisk lekkasje og nekrose i det implanterte spiserøret stillas fører uunngåelig til en dødelig infeksjon i det omkringliggende aseptiske rommet, for eksempel mediastinum7. Derfor er det ekstremt viktig å forhindre mat eller spyttforurensning i såret og nasogastrisk rør. Gastrostomi eller intravenøs ernæring bør vurderes til primær sårheling er fullført. Hittil har esophageal tissue engineering blitt utført i store dyremodeller fordi store dyr bare kan mates ved intravenøs hyperalimentasjon i 2-4 uker etter implantasjon avstillaset 8. En slik ikke-oral fôringsmodell er imidlertid ikke fastslått for tidlig overlevelse etter esophageal transplantasjon hos små dyr. Dette er fordi dyrene var ekstremt aktive og ukontrollerbare, slik at de ikke kunne holde fôringsrøret i magen i en lengre periode. Av denne grunn har det vært få tilfeller av vellykket esophageal transplantasjon hos små dyr.
I lys av omstendighetene rundt esophageal vev engineering, designet vi en to-lags rørformede stillas bestående av elektrospun nanofiber (indre lag; Figur 1A) og en 3D-trykt tråd (ytre lag; Figur 1B) inkludert en modifisert gastrostomiteknikk. Den interne nanofiber er laget av PU, en ikke-nedbrytbar polymer, og forhindrer lekkasje av mat og spytt. De eksterne 3D-trykte trådene er laget av biologisk nedbrytbar polykaprolacton (PCL), som kan gi mekanisk fleksibilitet og tilpasse seg peristaltisk bevegelse. Human adipose-avledet mesenchymal stamceller (hAD-MSCs) ble seeded på det indre laget av stillaset for å fremme re-epitelization. Nanofiberstrukturen kan lette innledende mucosal regenerering ved å gi et strukturelt ekstracellulær matrise (ECM) miljø for cellemigrasjon.
Vi har også økt overlevelsesraten og bioaktiviteten til de inokulerte cellene gjennom bioreaktordyrking. Det implanterte stillaset var dekket med en skjoldbruskkjertelklaff for å muliggjøre mer stabil regenerering av spiserøret smukosog muskellag. I denne rapporten beskriver vi protokoller for esophageal vev engineering teknikker, inkludert stillas produksjon, mesenchymal stamcellebasert bioreaktor dyrking, en bypass fôring teknikk med modifisert gastrostomi, og en modifisert kirurgisk anastomose teknikk for omkrets esophageal rekonstruksjon i en rotte modell.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle metoder som er beskrevet her, er godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC Nr. 17-0164-S1A0) fra Seoul National University Hospital.
1. Stillas Produksjon
MERK: Tolags esophageal stillas er produsert ved å kombinere elektrospinning og 3D-utskrift. Den indre membranen av det rørformede stillaset ble fabrikkert av elektrospinnende polyuretan (PU) med roterende rustfritt stål mandrels som samlerne9.
- For fremstilling av rørformede PU nanofibre, lag en 20% (w / v) løsning av PU polymer ved å røre i N, N-dimetylformamid (DMF) for 8 timer ved romtemperatur.
- Plasser PU-oppløsningen på sprøyten med en stump metallnål (22 G), og elektrospin på roterende mandrels i rustfritt stål (diameter = 2 mm) i en avstand på 30 cm mellom nålespissen og den roterende samleren.
MERK: Strømforsyningen er satt til en høyspent direkte strøm på 15 kV potensial. Matehastigheten til oppløsningen er festet ved 0,5 ml/t ved hjelp av en sprøytepumpe. - Lag et rørformet nanofiberlag på overflaten av mandrel roterende på 3,14 m / s.
- Tørk PU nanofiber i en vakuumovn ved 40 °C over natten for å fjerne gjenværende løsemiddel.
MERK: Den 3D-trykte ytterveggen av spiserøret stillas er utarbeidet ved hjelp av et raskt prototypingssystem. 3D-utskriftsutstyret består av en dispenser, dyse, kompresjons-/varmekontroller, konverteringstrinn med 3 akse og programvaresystem. - PCL pellets oppløses ved 100 °C i en varmesylinder og deretter trykt på overflaten av nanofibrene ved høyt trykk (7 bar) under kontroll av et bioplottingssystem. Dysestørrelsen er 300 μm og strandavstanden er 700 μm.
- Etter å ha fjernet det tolags stillaset fra mandrel, steriliseres ved å bløtgjøre i 70% etanol under ultrafiolett lys.
MERK: Mer detaljerte egenskaper ved stillaset er rapportert i tidligere studier10.
2. Celle seeding på grafts og bioreaktor dyrking
MERK: Humane fettavledede mesenchymale stamceller (hMSCer) kjøpt fra et selskap ble brukt uten endring.
- Før celletransplantasjon, steriliser 3D trykt spiserør stillas i 1 t under ultrafiolett lys, våt den i 10 min med etanol, og vask den 3x med fosfatbufret saltvann (PBS).
- Kultur og utvid hMSCer i vekstmedium (basal medium / vekst supplement). Tolags rørformede stillas ble overført til nonadherent 24 brønnvevkulturplater.
- For å feste cellene til den indre overflaten av stillaset, legg forsiktig hMSC-suspensjonen med en tetthet på 1 x 106 celler / ml i kjellermembranmatrise som inneholder vekstmediet.
- Deponer kjellermembranens matrisesuspensjon på den indre overflaten av det tolags rørformede stillaset.
- Fast fikse hMSC-seeded rørformede stillas til akryl holderen i kulturkammeret av bioreaktoren ved hjelp av en pulsatile flyt bioreaktor system.
MERK: Det spesialdesignede bioreaktorsystemet består av en pumpe, boblefelle, strømningskammer, trykkmåler, kontrollerbar ventil og middels reservoar. Når du bruker skjærstress i kulturkammeret, la en hviletid på 1-2 min11. - Legg vekstmedium til kulturkammeret og bruk 0,1 dyne/cm2 strømningsindusert skjærstress under en fuktet atmosfære som inneholder 5% CO210.
MERK: Verdien av flow-indusert skjærstress ble beregnet ved å simulere peristaltikken av spiserøret avledet fra menneskekroppen fra tidligere studier10. - Bestem celleresponsen på de indre overflatene av de tolags rørformede stillasene uten bioreaktordyrking etter 5 dager ved hjelp av et LIVE/DEAD Viability Assay Kit i henhold til produsentens instruksjoner. Få bilder via konfokal mikroskopi ved hjelp av Z-stack-verktøyet.
- På den tredje dagen, observere overflaten morfologi av hMSC-seeded rørformede stillas gjennom en skanning elektron mikroskop (SEM).
- Fest stillaset som ble inkubert med hMSC med 2,5% glutaraldehyd og OsO4 for 24 timer og dehydrere med etanol.
- Coat de faste hMSCene med platina ved hjelp av en sputter coater under argon atmosfæriske forhold og få SEM-bilder med en akselererende spenning på 25 kV.
3. Kirurgisk forberedelse til dyrekirurgi
MERK: Kirurgiske preparater påføres før både gastrostomi og esophageal transplantasjon.
- Sett opp de sterile kirurgiske instrumentene: Skalpellblad, Weitlaner retractor, mikronålholder, microsuture tang, mikrovev tang, mikrosaks, Mayo-Hegar nålholder, driftssaks, iris saks, dressing tang, vev tang, splinter tang, iris tang, 5 ml sprøyte (21 G nål), 10 ml sprøyte (22 G nål), 9-0 polyamid sutur, 4-0 polyglaktin sutur.
- Bedøve dyret med en intramuskulær injeksjon av flisetamin/zolazepam (50 mg/g dose) og 2 % xylazinehydroklorid (2 mg/kg dose).
MERK: Voksne Sprague-Dawley (SD) rotter som veide 398-420 g ble brukt til esophageal transplantasjon. - Før du overfører til kirurgisk drapering, må du kontrollere dyrets passende bedøvelsestilstand ved å klemme halen med tangene.
- Plasser dyret i en supine posisjon på steril drapering og bruk klippere for å fjerne håret fra nakken (for esophageal transplantasjon) eller mage (for gastrostomi). Skrubb deretter operasjonsstedet med betadin og 70% etanol.
- Før snitt injiserer du en smertestillende middel som buprenorfin (0,05-0,1 mg/kg) for smertelindring.
4. Gastrostomi kirurgi ved hjelp av en T-tube i rotter
MERK: En modifisert gastrostomi ble utført hos alle eksperimentelle dyr for å tillate midlertidig bypass nonoral tube fôring (n = 5).
- Har rotter raskt dagen før operasjonen. Forbered kirurgi som i avsnitt 3.
- Utsett magen gjennom et mellomlinjesnitt i huden og magemusklene til de bedøvede rotter.
- Lag en 3 mm åpning i den fremre mageveggen med et skalpellblad.
- Sett tuppen av silikon-T-røret inn i defektstedet for å feste det til mageveggen.
- Sutur riktig slik at T-røret ikke løsner fra mageveggen.
- Ta ut den distale enden av det implanterte T-røret gjennom den subkutane tunnelen inn i nakken.
- Sett heparinhetten til enden av T-røret for å hindre at mageinnholdet flyter bakover.
MERK: Bruk et angiokateter til å koble enden av T-røret med heparinhetten. - Sutur alle lag av bukveggen og huden ved hjelp av 4-0 polyglactin suturer.
- Hold alle eksperimentelle rotter atskilt i et metabolsk bur etter at gastrostomien er fullført.
5. Esophageal Transplantasjon
MERK: Esophageal transplantasjon av tolags rørformede stillas utføres 1 uke etter gastrostomi (n = 5). Før transplantasjonen, inokulere hMSCer (celletetthet: 1 x 106 celler / ml i kjelleren membran matrise) inn i den indre veggen av hvert stillas og inkubat i 3 dager i bioreaktorsystemet. Den kirurgiske prosedyren er som følger.
- Fjern nakkehåret til modelldyrene og utfør standard drapering av operasjonsstedet for aseptisk kirurgi.
MERK: Lag et stort barberområde anbefales for å opprettholde asceptic kirurgi på dyret. - Etter fremre median snitt i nakken, skill stroppen muskler og utsette trakeoesophageal struktur.
- Rett og slett dissekere vagusnerven fra spiserøret før du resecting segmentet, ellers dyrets pust er kompromittert.
- Under forstørrelse isolerer du venstre side av spiserøret fra luftrøret og forsiktig skiller den øvre delen fra skjoldbruskkjertelen.
- Lag en 5 mm lang full omkretsdefekt som inneholder alle lag i spiserøret ved hjelp av kirurgisk saks.
MERK: Før esophageal transplantasjon, kutt de forberedte stillasene ved hjelp av kirurgisk saks for å matche lengden på transplantasjonsstedet. - Under et mikroskop, utfør mikroanastomose i begge ender av den distale spiserøret defekt ved hjelp av en 9-0 suturtråd. Plasser den første suturen mellom høyre inferoposteriormargin i øvre spiserørsrest og stillas. Fortsett å suturere fra høyre til venstre mellom øvre spiserør rester og stillaset. Anastomose stillaset på samme måte som den øvre marginen av nedre spiserør resten.
MERK: Utfør mikrovaskulær anastomose som brukes i klinisk kirurgi for esophageal transplantasjon. Arbeid med et mikroskop for presis, vanntett suturering av implantatstedet. - Etterpå legger du den omkringliggende skjoldbruskkjertelklaffen over det transplanterte stedet for å sikre stabilt vedlikehold av og vaskulær tilførsel til graftene.
- Etter transplantasjon, sy subkutan muskel og hudvev med en 4-0 vicryl sutur.
- Hold alle eksperimentelle rotter individuelt i metabolske bur.
6. Postoperative prosedyrer
MERK: Postoperative prosedyrer utføres etter både gastrostomi og esophageal transplantasjon.
- Etter lukking av magesåret, legg rottene i individuelle metabolske bur og plasser burene på infrarøde oppvarmingsenheter for å forhindre hypotermi.
- Overvåk dyrene til de oppnår og opprettholde ren avskummen (dvs. liggende oppreist på brystet).
- For å minimere betennelse på operasjonsstedet, administrer antibiotikagentamicin (20 mg/kg) daglig til rotter.
- Begynn oral væskefôring på den tredje postoperative dagen til slutten av studien. Tilsett hele ernæringsformelen (20,6 g/100 ml karbohydrater, 3,8 g% protein, 0,2 g% fett) gjennom heparinhetten 3x per dag som begynner dagen etter operasjonen.
- Kontroller dyrenes utseende og kroppsvekt daglig. Sjekk for å håndtere atferd, for eksempel selvskading snittsted eller motstand mot rørinntaket, samt ulike kirurgiske komplikasjoner. Når kroppsvekten til rottemodellene reduseres raskt med 20% eller mer, utfør eutanasi ved CO 2-innånding.
7. Histologi og immunhistokjemi
MERK: For histologisk analyse ekstraheres alle spiserøret i de euthaniserte dyrene ved hjelp av kirurgisk saks. Hematoksylin og eosinfarging og Massons trichromefarfarging ble utført ved hjelp av standard histologiske teknikker. Immunhistokjemi ble utført i henhold til følgende protokoll.
- Fest hele spiserøret som inneholder de transplanterte stedene i 4% paraformaldehyd. Lag en parafinblokk og kutt 4 μm tykke seksjoner.
- Deparaffiniser vevsdelene og dehydrer dem i en etanolserie. Dypp vevsskliene i sitratbuffer og varme i 10 min i mikrobølgeovnen. Avkjøl cellene med kald PBS i 20 min. Dypp i 3% hydrogenperoksid i 6 min, og vask med PBS i 10 min.
- Inkuber i 3% storfe serum albumin (BSA) i 1 t ved romtemperatur for å blokkere uspesifikke reaksjoner av vevseksjoner.
- Vask 3x med PBS i 5 min. Inkuber med primære antistoffer mot Desmin (fortynnet til 1:200), keratin 13 (fortynnet til 1:100), og von Willebrand Factor (vWF; fortynnet til 1:100) over natten ved 4 °C.
- Vask 3x med PBS i 15 min. Inkuber med egnet sekundærantistoff ved en konsentrasjon på 1:500 for Desmin og Keratin 13 ved romtemperatur. Vask deretter lysbildene to ganger med PBS i 10 min.
MERK: Vevsseksjoner for vWF ble inkubert ved hjelp av et pepperrotperoksidasekonjugert sett (se Materialtabell) og deretter visualisert ved hjelp av 3,3'-diaminobenzidin (DAB). - Monter med en glassdekselslip og 4',6-diamidino-2-fenolindol (DAPI) som inneholder monteringsmedium.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 viser et skjematisk diagram over produksjonsprosessen til PU-PCL tolags rørformede stillas. PU-løsningen ble elektrospunnet fra en 18 G nål for å lage en sylindrisk indre struktur med en tykkelse på 200 μm. Deretter ble smeltet PCL trykt på ytterveggen av PU nanofiber med jevne mellomrom. Overflaten morfologi av de indre og ytre veggene i det ferdige rørformede stillaset kan sees i skanning elektron mikroskopi bilder.
Figur 2 viser prosessen med å sette inn et gastrostomirør i en rotte for ekstern næringsforsyning (figur 2A). Det T-formede silikonrøret ble satt inn i mageveggen og suturert (Figur 2B). Røret ble deretter flyttet gjennom den subkutane tunnelen til baksiden av nakken og forbundet med en heparinhette (figur 2C). Røret forenkler injeksjon av flytende mat. Det forbyr også omvendt strøm av mageinnholdet gjennom rørene.
Figur 3 viser prosessen med celleinokulasjon på stillasets indre vegg, bioreaktordyrking og esophageal transplantasjon. Den hMSC-innebygde kjellermembranmatrisen ble påført jevnt på stillasens indre vegg via injeksjon (figur 3A). SEM-bildet viser morfologien til den cellefestede indre overflaten. Levende /døde flekker for å analysere cellelevedyktighet på det tolags rørformede stillaset (luminaloverflate) indikerte at de fleste cellene var levedyktige, og de spredte seg godt på nanofiberstrukturen på 5 dager. Stillaset inokulert med cellene ble festet til bioreaktoren, og skjærstresset ble påført av pumpen (Figur 3B). De hMSC-seedede rørformede stillasene, inkludert bioreaktordyrking, ble transplantert inn i rotter med full omkrets esophageal defekter via mikrosutur teknikker. Transplantatet var dekket med skjoldbruskkjertelklaff for stabil fiksering og vaskulær tilførsel av det implanterte stedet (figur 3C). Vektendringen av rotter etter transplantasjon ble observert til slutten av eksperimentet. Esophageal transplanterte rotter forble på 340 g til den niende dagen, men deretter raskt redusert i vekt på grunn av ulike årsaker (Figur 3D). Som et resultat døde de fleste dyr innen 15 dager.
Figur 4 viser esophageal regenerering etter graft implantasjon. Selv om de fleste rotter utviklet neoesophageal obstruksjon forårsaket av, var det ingen grove bevis på perforering, anastomoselekkasje med fistel, seromaakkumulering, abscessdannelse eller omkringliggende bløtvevsnekrose i noen eksperimentell rotte. Re-epitelisering av transplantasjonsstedet ble bekreftet av immunofluorescensfarging for keratin 13. Morfologien til kollagenlaget og elastinfibrene ble tydelig bekreftet på regenereringsstedet. Tilstedeværelsen av rikelig elastin og kollagenfibre kan bidra til bedre mekaniske egenskaper. Regenerering av esophageal muskellaget ble utstilt av desmin immunohistochemistry, og rikelig neovaskalisering ble observert på dette stedet.
Figur 1: Skjematisk illustrasjon av prosessen som brukes til å fremstille 2-lags rørformede stillas. Etter å ha fabrikkert membranen ved elektrospinning ved hjelp av PU (A),ble den strukturelle styrken til det rørformede stillaset forsterket ved å legge til tråder på membranens ytre overflate ved hjelp av et 3D-utskriftssystem uten løsningsmiddel (B). SEM-bildet viser morfologien til de indre og ytre lagene av det 2-lagdelte rørformede stillaset. (Forkortelser: PU = polyuretan). Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Gastrostomi. (A) Et skjematisk diagram som viser gastrostomiteknikker gjennom T-rørinnsetting i mageveggen. (B) Et punkteringshull er laget midt i formagen, og T-rørspissen settes inn i formagen. (C) Innløpsdelen av T-røret er plassert med heparinhetten midt i nakkestøtten. Figuren nedenfor presenterer et T-tube gastrostomiapparat med forskjellige komponenter. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Esophageal transplantasjon. (A) HMSCs innkapslet i kjelleren membran matrise ble seeded på de indre lagene av tolags rørformede stillas. SEM-bildet viser morfologien til hMSCene på den indre veggen. Levedyktigheten til de inokulerte cellene ble også bekreftet av levende død farging (grønn = levende celler). De hMSC-seedede stillasene ble umiddelbart inkubert i et bioreaktorsystem (B), og deretter ble de vevskonstruerte spiserøret implantert i livmorhalsspiserøret (C). Det implanterte stedet var dekket med en skjoldbruskkjertelklaff for stabil esophageal rekonstruksjon (piler). (D) Vekttap studier etter esophageal transplantasjon. Vekttap ble bestemt som absolutt endring fra den opprinnelige vekten av rotter. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Hele histologien til den rekonstruerte spiserøret 2 uker etter ortopisk stillasimplantasjon. Massons trichromefarging viser kollagendepondeponen rundt de implanterte stedene. Regenerering av esophageal muskel og slimete lag ble bekreftet av desmin (grønn) og keratin 13 (rød) immunstaining, henholdsvis. I tillegg ble neovaskularisering (piler) tydelig observert rundt det regenererte slimhinnelaget. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Eksisterende dyrestudier på kunstig eøser er fortsatt begrenset av flere kritiske faktorer. Det ideelle kunstige esophageal stillaset bør være biokompatibelt og ha gode fysiske egenskaper. Det bør være i stand til å regenerere slimhinneepitelet i tidlig postoperativ periode for å forhindre anastomotisk lekkasje. Regenerering av de indre sirkulære og ytre langsgående muskellagene er også viktig for funksjonell peristaltikk12,13.
De mekaniske egenskapene til spiserøret er avgjørende fordi spiserøret kollapser under respirasjon og åpnes under svelging, med konstant eksponering for maksimal strekking med et rekylfenomen14. Det implanterte stillaset må også ha disse mekaniske egenskapene. Viskoelastisiteten til det implanterte spiserøret bør være tilstrekkelig for repeterende rampeavslapning av den peristaltiske bevegelsen gjennom spiserøret. Stillas som er for svake kan briste eller lekke og forårsake alvorlige forhold (f.eks. mediastinitt) i mottakeren. I motsetning kan et stillas som er for stivt, bule inn i spiserøret og forhindre matpassasje. Elektrospunnanofibre har svært gunstige fysiske egenskaper for esophageal rekonstruksjon. ECM's topografiske natur gir et miljø som er gunstig for migrering og differensiering av epitelceller i esophageal lag15. Den har også en nanopore struktur som hindrer lekkasje av spytt og ulike patogener16. Stillas laget av elektrospunnet nanofiber har imidlertid begrenset bruk på grunn av deres myke mekaniske egenskaper. For å løse dette problemet forbedret vi deres mekaniske styrke ved hjelp av 3D-utskriftsteknologi. 3D trykt strand på det ytre laget av nanofiber har en bredde på 780 μm, og den indre porestrukturen er ganske bred. Det gir fysisk støtte for esophageal intervensjoner i stedet for å lede regenerering av det omkringliggende vevet.
I denne studien ble omkretsesophageal defekter fullstendig helbredet i bioreaktoren kultiverte grafts i opptil 2 uker, men alle eksperimentelle rotter døde innen 15 dager etter operasjonen. De fleste dødsfallene var forårsaket av peritonitt og underernæring forårsaket av mat og spytt lekkasjer proksimal til anastomose området. Alle dyr fritt konsumert en flytende diett i opptil en uke, men som såret healing utviklet seg, utilsiktet mekanisk obstruksjon skjedde i rekonstruert spiserør på grunn av hårball svelging. Dette fenomenet har vist seg å forårsake fullstendig fordøyelsessykdom i de implanterte ikke-dynamiske stillasene. Det finnes flere alternativer for å overvinne disse tekniske problemene. For det første, utviklingen av en svært elastisk esophageal implantat som kan etterligne esophageal peristaltikk. For det andre, dyrestudier ved hjelp av hårløse rotter for å hindre hårsvelging. For det tredje kan gallesten påføres samtidig med stillaset for å minimere implantatkollaps og anastomoseskade. I tillegg er anvendelsen av mikrovaskulær anastomose til esophageal stillasimplantasjon viktig for å fullstendig forhindre lekkasje av spytt. Den konvensjonelle suturteknikken ved hjelp av de nakne øynene er ekstremt vanskelig å gjøre vanntett i rottemodeller.
Et pålitelig vaskulært kjøretøy er avgjørende for næringsstoffer, vekstfaktorer og oksygentilførsel i de tidlige stadiene av regenerering. Skjoldbruskkjertelen er vaskulært vev som ligger i nærheten av spiserøret. Vi brukte skjoldbruskkjertelklaffen etter omkrets esophagectomy på grunn av sin enkle tilgjengelighet i rottemodellen. Til slutt foreslår vi ulike prekliniske teknikker for å overvinne vanskelighetene med esophageal rekonstruksjon i rottemodellen. Denne studien presenterer et godt alternativ for å overvinne begrensningene av konvensjonell små dyr esophagus transplantasjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Bioreaktorsystemet designet for denne studien er kommersialisert (modellnummer: ACBF-100).
Acknowledgments
Denne forskningen ble støttet av Korea Health Technology R&D Project gjennom Korea Health Industry Development Institute (KHIDI), finansiert av Helse- og velferdsdepartementet, Republikken Korea (stipendnummer: HI16C0362) og Basic Science Research Program gjennom National Research Foundation of Korea (NRF) finansiert av Kunnskapsdepartementet (2017R1C1B2011132). Bioprøvene og dataene som ble brukt i denne studien ble levert av Biobank of Seoul National University Hospital, medlem av Korea Biobank Network.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Metabolic cage | TEUNGDO BIO & PLANT | JD-C-66 | |
| Zoletil (50 mg/g dose) | Virbac | 1000000188 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| 1 mL Syringe | BD | 309659 | |
| 2% xylazine hydrochloride (Rumpun) | Byely | Q-0615-035 | |
| 4% paraformaldehyde | BIOSOLUTION | BP031 | |
| 4-0 Vicryl | ETHICON | W9443 | |
| 9-0 Vicryl | ETHICON | W2813 | |
| Antibiotic gentamicin (Septopal). | Septopal | 0409-1207-03 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | 5470 | |
| Citrate Buffer, ph6.0, 10X | Sigma | C9999 | |
| DAB PEROXIDASE SUBSTRATE KIT | VECTOR | SK4100 | |
| Desmin | Santa Cruz | sc-23879 | |
| Elastic stain kit | ScyTeK | ETS-1 | |
| Ethanol | Merck | 100983 | |
| Ethanol | Merck | 64-17-5 | |
| Fetal Bovine Serun (FBS) | Gibco | 16000-044 | |
| Glutaraldehyde | Sigma | 354400 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody | ThermoFisher | A-11001 | |
| Heparin cap | Hyupsung Medical | HS-T-05 | |
| hMSC (STEMPRO) / growth medium (MesenPRO RSTM) |
Invitrogen | R7788-110 | |
| Horseradish peroxidase-conjugated kit (Vectastain) | VECTOR | PK7800 | |
| Hydrogen peroxide | JUNSEI | 7722-84-1 | |
| Keratin13 | Novus | NBP1-97797 | |
| LIVE/DEAD Viability Assay Kit | Molecular Probes | L3224 | |
| Matrigel | Corning | 354262 | |
| N,N-dimethylformamide (DMF) | Sigma | 227056 | |
| Nonadherent 24-well tissue culture plates. |
Corning | 3738 | |
| OsO4 | Sigma | O5500 | |
| Petri dish | Eppendorf | 3072115 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | 10010-023 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS), 10X | BIOSOLUTION | BP007a | |
| Polycaprolactone (PCL) polymer | Sigma | 440744 | |
| Polyurethane (PU+A2:A24) polymer | Lubrizol | 2363-80AE | |
| Power Supply | NanoNC | HV100 | |
| ProLong Gold antifade reagent with DAPI | Invitrogen | P36931 | |
| Rumpun | Bayer | Q-0615-035 | |
| Silicone T-tube | Sewoon Medical | 2206-005 | |
| Terramycin Eye Ointment | Pfizer Pharmaceutical Korea | W01890011 | |
| Tiletamine/Zolazepam (Zoletil) | Virbac Laboratories | Q-0042-058 | |
| Trichrome stain kit | ScyTeK | TRM-1 | |
| von Willebrand Factor (vWF) | Santa Cruz | sc 14014 |
References
- Irino, T., et al. Long-term functional outcomes after replacement of the esophagus with gastric, colonic, or jejunal conduits: a systematic literature review. Diseases of the Esophagus. 30 (12), 1-11 (2017).
- Flanagan, J. C., et al. Esophagectomy and Gastric Pull-through Procedures: Surgical Techniques, Imaging Features, and Potential Complications. Radiographics. 36 (1), 107-121 (2016).
- Liu, J., Yang, Y., Zheng, C., Dong, R., Zheng, S. Surgical outcomes of different approaches to esophageal replacement in long-gap esophageal atresia: A systematic review. Medicine. (Baltimore). 96 (21), e6942 (2017).
- Luc, G., et al. Decellularized and matured esophageal scaffold for circumferential esophagus replacement: Proof of concept in a pig model. Biomaterials. 175, 1-18 (2018).
- Wang, F., Maeda, Y., Zachar, V., Ansari, T., Emmersen, J. Regeneration of the oesophageal muscle layer from oesophagus acellular matrix scaffold using adipose-derived stem cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 503 (1), 271-277 (2018).
- La Francesca, S., et al. Long-term regeneration and remodeling of the pig esophagus after circumferential resection using a retrievable synthetic scaffold carrying autologous cells. Scientific Reports. 8 (1), 4123 (2018).
- Ponten, J. E., et al. Early severe mediastinal bleeding after esophagectomy: a potentially lethal complication. Journal of Thoracic Disease. 5 (2), E58-E60 (2013).
- Catry, J., et al. Circumferential Esophageal Replacement by a Tissue-engineered Substitute Using Mesenchymal Stem Cells: An Experimental Study in Mini Pigs. Cell Transplant. 26 (12), 1831-1839 (2017).
- Lee, S. J., et al. Characterization and preparation of bio-tubular scaffolds for fabricating artificial vascular grafts by combining electrospinning and a 3D printing system. Physical Chemistry Chemical Physics. 17 (5), 2996-2999 (2015).
- Kim, I. G., et al. Tissue-Engineered Esophagus via Bioreactor Cultivation for Circumferential Esophageal Reconstruction. Tissue Engineering Part A. , (2019).
- Wu, Y., et al. Combinational effects of mechanical forces and substrate surface characteristics on esophageal epithelial differentiation. Journal of Biomedical Materials Research A. 107, 552-560 (2019).
- Jensen, T., et al. Polyurethane scaffolds seeded with autologous cells can regenerate long esophageal gaps: An esophageal atresia treatment model. Journal of Pediatric Surgery. 3468 (18), 30685-30687 (2018).
- Nakase, Y., et al. Intrathoracic esophageal replacement by in situ tissue-engineered esophagus. Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 136 (4), 850-859 (2008).
- Kwiatek, M. A., et al. Mechanical properties of the esophagus in eosinophilic esophagitis. Gastroenterology. 140 (1), 82-90 (2011).
- Anjum, F., et al. Biocomposite nanofiber matrices to support ECM remodeling by human dermal progenitors and enhanced wound closure. Scientific Reports. 7 (1), 10291 (2017).
- Kuppan, P., Sethuraman, S., Krishnan, U. M. PCL and PCL-gelatin nanofibers as esophageal tissue scaffolds: optimization, characterization and cell-matrix interactions. Journal of Biomedical Nanotechnology. 9 (9), 1540-1555 (2013).
