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Artigo de método

Um método de imagem semi-alta-fonte e um kit de ferramentas de visualização de dados para analisar o desenvolvimento embrionário de C. elegans

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DOI:

10.3791/60362

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29 de outubro de 2019

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1Ludwig Institute for Cancer Research, San Diego, 2Department of Cellular and Molecular Medicine, University of California, San Diego, 3Recursion Pharmaceuticals, 4Biomedical Sciences Graduate Program, University of California, San Diego, 5Cell Biology Section, National Institute of Dental and Craniofacial Research, National Institutes of Health, 6Department of Biology, San Diego State University, 7Developmental and Stem Cell Biology Graduate Program, University of California, San Francisco

Neste artigo

Resumo

Este trabalho descreve um protocolo semi-alta de supressão que permite imagens simultâneas de lapso de tempo 3D de embriaênese embrionária em embriões de 80-100 C. elegans em uma única corrida noturna. Além disso, as ferramentas de processamento e visualização de imagens são incluídas para simplificar a análise de dados. A combinação destes métodos com tensões personalizadas do repórter permite a monitoração detalhada do embryogenesis.

Resumo

C. elegans é o principal sistema para a análise sistemática da especificação do destino celular e eventos morfogenéticos durante o desenvolvimento embrionário. Um desafio é que a embriogênese se desdobra dinamicamente durante um período de cerca de 13 h; este prazo de meio dia restringiu o âmbito das experiências, limitando o número de embriões que podem ser imageados. Aqui, descrevemos um protocolo de meia-alta de supressão que permite a imagem simultânea de lapso de tempo 3D de desenvolvimento em 80-100 embriões em resolução de tempo moderado, de até 14 condições diferentes, em uma única corrida noturna. O protocolo é simples e pode ser implementado por qualquer laboratório com acesso a um microscópio com capacidade de visita de ponto. A utilidade deste protocolo é demonstrada usando-o para imagem duas cepas personalizadas expressando marcadores fluorescentes otimizados para visualizar aspectos-chave da especificação da camada germinativa e morgênese. Para analisar os dados, um programa personalizado que cultiva embriões individuais fora de um campo de visão mais amplo em todos os canais, z-passos e pontos de tempo e salva as seqüências para cada embrião em uma pilha de tiff separada foi construído. O programa, que inclui uma interface gráfica de usuário (GUI) amigável, simplifica o processamento de dados isolando, pré-processamento e orientando uniformemente embriões individuais em preparação para visualização ou análise automatizada. Também é fornecido uma macro ImageJ que compila dados de embriões individuais em um arquivo multi-painel que exibe projeção de fluorescência de intensidade máxima e imagens de campo brilhante para cada embrião em cada ponto de tempo. Os protocolos e ferramentas aqui descritos foram validados usando-os para caracterizar o desenvolvimento embrionário após a queda de 40 genes de desenvolvimento previamente descritos; esta análise visualizou fenótipos de desenvolvimento previamente anotados e revelou novos. Em resumo, este trabalho detalha um método de imagem semi-alta-desperação juntamente com um programa de corte e ferramenta de visualização ImageJ que, quando combinado com cepas expressando marcadores fluorescentes informativos, acelera muito os experimentos para analisar desenvolvimento embrionário.

Introdução

O embrião C. elegans é um importante sistema modelo para biologia celular mecanicista e análise da especificação do destino celular e eventos morfogenéticos que impulsionam o desenvolvimento embrionário1,2,3,4 ,5,6,7,8,9. Até o momento, grande parte da caracterização de eventos de nível celular e especificação do destino celular no embrião foi alcançada usando experimentos de imagem de resolução de imagem de resolução única (ou seja, aquisição a cada 10 a 100 s) de embriões expressando marcadores fluorescentes. Embora bem adequado para eventos na ordem de segundos a dezenas de minutos, essa abordagem torna-se tecnicamente limitante para a caracterização de processos mais longos, na ordem de horas a dias. O desenvolvimento embrionário desde a primeira clivagem até o fim do alongamento leva cerca de 10 h. Nesta escala de tempo, semi-alta-geração de métodos que permitiriam simultaneamente menor resolução de tempo de imagem (ou seja, aquisição em intervalos de tempo de 5-20 minutos) de coortes maiores de embriões, de diferentes condições, abriria uma nova gama de experimentos; por exemplo, permitindo esforços sistemáticos de triagem em larga escala e a análise de um número suficiente de embriões para comparações das consequências das perturbações moleculares.

Aqui, descrevemos um método de semi-alta-alta-entrada para monitorar c. elegans embrigenesis que permite a imagem de desenvolvimento simultânea de lapso de tempo 3D em 80-100 embriões, de até 14 condições diferentes, em uma única corrida noturna. O protocolo é simples de implementar e pode ser realizado por qualquer laboratório com acesso a um microscópio com capacidades de visita de ponto. Os principais passos deste protocolo são descritos na Figura 1. Em suma, os embriões são dissecados de adultos gravid expressando marcadores fluorescentes de interesse e transferir embriões jovens (estágio de 2-8 células) para poços de uma placa de 384 poços para imagem. Neste formato, o tamanho relativamente pequeno do poço canaliza embriões em uma área estreita, que facilite a identificação dos campos que contêm embriões múltiplos para a imagem latente do time-lapse. Para manter o desenvolvimento aproximadamente síncrono em toda a coorte de embriões, dissecções são realizadas em meios de comunicação refrigerados e a placa é mantida no gelo, o que impede o desenvolvimento significativo durante a janela de tempo de dissecação de uma hora de duração. A placa é transferida para o microscópio e embriões são filmados em uma sala com temperatura controlada durante a noite, em intervalos de tempo de 20 minutos, usando uma imersão de óleo 60x 1,35 NA lente, para coletar a gama z completa em 2 passos μm. Cinquenta campos, cada um contendo entre 1-5 embriões, são imagemdos em uma única corrida durante a noite. Dependendo do experimento desejado, a resolução de tempo pode ser aumentada (por exemplo, imagens em intervalos de 5 a 10 minutos) diminuindo proporcionalmente o número de campos de imagem.

Com este protocolo, mesmo uma única corrida noturna gera uma quantidade significativa de dados (80-100 embriões espalhados por 50 campos) e experimentos maiores podem rapidamente se tornar incontroláveis no que diz respeito à análise de dados. Para facilitar o processamento, visualização e racionalização da análise desses dados, um programa foi construído para cortar e orientar embriões e realizar etapas de pré-processamento (opcional) e uma macro ImageJ que compila os dados para simplificar a visualização. Esses programas podem ser usados para processar imagens coletadas usando abordagens convencionais, pois são independentes do método de imagem, exigindo apenas um único plano de campo brilhante. O primeiro programa leva em um campo 4D contendo vários embriões (opção GUI ou código-fonte embryoCrop.py) ou múltiplos campos 4D contendo vários embriões (screenCrop.py), planta embriões firmemente e os orienta em uma configuração anterior-posterior. Esses programas também dão aos usuários a opção de realizar subtração em segundo plano, correção de deriva e correção de atenuação. Os arquivos resultantes são uniformemente pré-processados, pilhas de tiff bem cortadas para cada embrião que são alteráveis à análise de imagem automatizada. Para tornar mais simples ver todos os embriões para cada condição, foi escrita uma macro ImageJ (OpenandCombine_embsV2.ijm), que reúne todos os embriões de uma determinada condição para uma única pilha de tiff e matrizes de imagens de campo brilhante e cor de projeção de intensidade máxima ( RGB) sobrecoloca, lado a lado, para cada embrião. Os métodos foram validados usando-os para caracterizar o desenvolvimento embrionário após a queda de 40 genes de desenvolvimento previamente descritos em um par de cepas personalizadas expressando marcadores fluorescentes otimizados para visualizar aspectos-chave da camada germinal especificação e morgênese10,11. Juntos, o protocolo de imagem embrionário semi-alta e as ferramentas de processamento de imagem permitirão experimentos de maior número amostral e esforços de triagem em larga escala destinados a entender os processos de desenvolvimento. Além disso, essas cepas também fornecerão um meio eficiente para examinar os efeitos das perturbações moleculares na embriogênese.

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Protocolo

1. Preparando c. elegans embriões para imagens semi-alta-throughput

Nota: O objetivo desta parcela do protocolo é carregar uma população de embriões c. elegans semisincronizados (estágio de 2 a 8 células), dissecados de cepas de marcadores adequadas (Figura 2),em uma placa de 384 poços com fundo de vidro para imagem. Outros formatos de placa também podem funcionar, mas as 384 placas de poço são preferidas porque o pequeno tamanho do poço restringe a propagação de embriões a uma área relativamente pequena, o que facilita a identificação de campos contendo vários embriões para imagens de lapso de tempo. Sincronizar aproximadamente os embriões garante que o curso completo de desenvolvimento seja capturado para cada um dos embriões em um campo.

  1. Prepare 5-10 mL de 0,1 mg/mL solução de cloridrato de tetramisole (TMHC) anestésico dissolvido em gelo frio M9 médio (0,45 M Na2HPO4º7H2O, 0,11 M KH2PO4, 0,04 M NaCl, 0,09 NH M4 Cl)para usar durante dissecação e imagem. Esta mídia inclui um anestésico para garantir que a larva eclodida em movimento não interrompa a imagem de embriões em estágios de desenvolvimento anteriores.
    Nota: Se usar as ferramentas de cultivo e visualização para analisar os dados adquiridos usando métodos padrão de montagem de almofadas de agarose, pule para a seção 3 abaixo.
  2. Aliquot 70 μL da solução preparada em poços individuais de uma placa de 384 poços com fundo de vidro com um poço para cada condição; evitar as duas linhas externas da placa para evitar efeitos de borda.
    Nota: É útil mascarar poços circundantes usando folha de placa PCR adesiva (veja exemplo na Figura 1D)isso preserva poços adjacentes para experimentos futuros e facilita a localização de poços apropriados o microscópio de dissecção. Uma vez que a solução é alicitada, mantenha a placa e a solução restante no gelo durante todo a dissecação.
  3. Gerar tubos bucais para a transferência de embriões do slide dedepressão (onde os hermafroditas gravidas são dissecados) para os poços. Puxe pipetas capilares (25 μL tubos calibrados) sobre uma chama e quebrar para gerar uma extremidade cílado fina(Figura 1D). Um pipet é necessário por condição para evitar a contaminação cruzada; descartar pipet após o uso.
  4. Use pinças finas para transferir ~ 10 adultos gravidas um escopo de dissecação em 150 μL da solução TMHC gelada alicitada em um slide de depressão para cada condição. Usando a pinça e um bisturi, dissecar os vermes para liberar os embriões.
  5. Carregue um pipet capilar puxado no acessório do aspirador incluído com os pipets, e o pipet da boca para transferir todos os embriões do 2-8-pilha-estágio em um poço individual da placa preparada(figura 1D). Evite transferir embriões em estágio avançado e detritos de dissecação. Examine um escopo de dissecação e se os agregados dos embriões estão presentes, boca pipet para cima e para baixo ou torneira grupos de embriões com ponta pipet para dispersar.
    Nota: Para evitar a contaminação cruzada, equipamentode dissecação limpa e usar um tubo de boca fresca, enquanto se deslocam entre as condições. Placa da loja no gelo entre dissecções.
  6. Uma vez que os sem-fins de todas as circunstâncias foram dissecados e os embriões coloc em seu poço apropriado, gire a placa de 384 poços para 1 min em 600 x g para estabelecer os embriões.
  7. Limpe o fundo da placa com uma limpeza embebido em etanol para remover qualquer resíduo e coloque a placa em um microscópio confocal equipado com um suporte de placa em um ambiente de temperatura controlada.
    Nota: As etapas que seguem detalham este método usando a configuração do laboratório; por favor, modifique as condições de aquisição para atender às necessidades e equipamentos experimentais. Aqui, uma caixa de scanner confocal equipada com um disco de fiação Nipkow duplo aprimorado por microlente, uma câmera EM-CCD 512 x 512, um auto-XY-Stage de alta precisão (resolução designada 0,1 μm) e controle motorizado de eixo z (resolução designada 0,1 μm). Este sistema é mantido em uma sala de 16 °C, que mantém a temperatura do microscópio entre 21 e 23 °C durante a imagem durante a noite.
  8. Para identificar campos com embriões adequados, realize uma pré-digitalização de cada poço usando um objetivo de 10x 0,4 NA e software de imagem adequado. Os campos mais ideais conterão mais de um embrião em estágio inicial que está no mesmo plano focal que outros embriões e, idealmente, terá contato mínimo entre embriões adjacentes. Marque posições de regiões adequadas.
  9. Para selecionar campos de imagem, mude para o objetivo 60x e ajuste o plano focal em cada ponto de visita para seção adequada dos embriões. 1-4 campos por poço são imagemdos, para um total de 50 campos em 14 poços, e cada campo pode conter entre um e cinco embriões. No geral, 4 a 15 embriões são selecionados de cada condição para imagens de alta resolução.
    Nota: Uma variável-chave nesta etapa é o uso de petróleo suficiente; coloque o petróleo no objetivo, visitando pontos em cada poço para espalhar o óleo ao redor da superfície de todos os poços e, em seguida, aplicar uma gota adicional de óleo para o objetivo antes da seleção de campos.
  10. Imagem dos campos selecionados usando um objetivo de 60x 1.35 NA para adquirir 18 seções z em intervalos de 2 μm a cada 20 min por 10 h. As condições de imagem usando as cepas de repórter de camada germinal e morgênese são as seguintes: brightfield, 90% de potência, 25 ms, 20% de ganho; 488 nm, 100% de potência, 200 ms, 60% ganho; 568 nm, 45% de potência, 150 ms, 60% de ganho.
  11. Depois que a imagem latente está completa, avalie a letalidade embrionária executando uma baixa ampliação (objetivo de 10x 0.4 NA) varredura well well well brightfield ~20-24 h que segue o começo da imagem latente de noite.

2. Letalidade embrionária Pontuação

  1. Usando os campos digitalizados de 10x pós-corrida, avalie a letalidade embrionária e defeitos larvais contando vermes eclodinhados e embriões não eclodidos para cada poço.
  2. Pontuar embriões não chocados como letal embrionário. Excluir embriões presos de um a quatro estágios da contagem de letalidade, uma vez que os embriões dissecados jovens às vezes não conseguem completar a formação de casca de ovo (se a meiose II ainda não estiver completa) e os defeitos de permeabilidade podem levar a complicações osmóticas durante os dois primeiros Divisões.
  3. Pontuação parcialmente chocado ou totalmente chocado vermes com morfologia do corpo ou defeitos comportamentais, tais como dumpy ou paralisado, como "larva anormal".

3. Corte automatizado (Figura 3A)

Nota: O software está alojado em dois locais: (1) Zenodo abriga uma versão amigável do software12 que não requer qualquer experiência de programação. (2) O Github contém o código-fonte para o nosso software embryoCropUI.py e screenCrop.py13,que requer proficiência com python. Instruções detalhadas para baixar e operar ambas as versões do programa podem ser encontradas abaixo.

  1. Corte automatizado usando versão executável embryoCropUI (versão amigável)
    1. Para usar o programa embryoCropUI, primeiro baixe o programa de Zenodo(https://zenodo.org/record/3235681#.XPAnn4hKg2w)12.
      1. Baixe a versão do formato MacOS ou Windows do programa (note que a versão MacOS requer MacOS X10.11 ou superior).
      2. Baixe o arquivo de instruções(GUI_Instructions_zenodo_repoV2.docx),que fornece instrução passo a passo para testar e usar o programa embryoCropUI.
      3. Baixe o test_files.zip para testar se o programa está funcionando corretamente na plataforma (ver instruções).
    2. Uma vez baixado, descompactar e navegar para encontrar o embriãoCropUI executável (...\embryoCropUI\_WINDOWS\embryoCropUI\embryoCropUI.exe) ou (...\embryoCropUI\_MacOS\embryoCropUI\embryoCropUI.exe). Clique duas vezes para lançar (ou escolheu o terminal "aberto com" e execute o embryoCropUI executável.
    3. O GUI executável culturas um campo de visão 4D de cada vez. No canto superior esquerdo, selecione o botão aberto para carregar o campo específico para cortar (multi-tiff). Se cortar uma série de tiff, com múltiplas dimensões (ou seja, z, tempo, canal), carregar apenas a primeira imagem da série dentro da pasta (uma série tiff por pasta).
    4. Uma vez que as imagens foram carregadas, especifique as seguintes informações: número de z-fatias, (Z), número de pontos de tempo (T), número de canais (C), o canal que corresponde a DIC ou brightfield (first=1, second=2, etc.).
    5. Selecione processamento adicional para ser executado nas imagens. O programa oferece correção de drift, subtração de fundo e correção de atenuação.
    6. Especifique parâmetros para a correção de subtração e atenuação em segundo plano para orientar os esforços de processamento na solicitação de GUI. Para a Subtrain de fundo, defina o maior tamanho de recurso para refletir o tamanho do sinal significativo; este tamanho da característica não deve ser considerado como fundo e deve ser um valor de número ímpar. Entrada de um valor de 0-1 para correção de atenuação. O valor da Correção de Atenuação reflete a porcentagem da intensidade original que permanece na profundidade mais distante do objeto que está sendo imagem.
      Nota: A correção de subtração e atenuação em segundo plano deve ser executada em conjunto.
    7. Especifique a ordem de coleta de imagens (ou seja, canal-z-time (czt) ou z-channel-time (zct)).
    8. Especifique os mícrons por pixel para as imagens com base na câmera que está sendo usada.
      Nota: O corte de imagem ruim ocorrerá se o tamanho do pixel não for devidamente definido.
    9. Selecione Correr no canto inferior esquerdo. Uma nova subpasta rotulada de "cultura" será criada no mesmo caminho que a pasta não cortada; versões cortadas serão salvas neste local. Dependendo do tamanho do arquivo, a corte deve ser concluída em segundos a minutos.
  2. Corte automatizado usando screenCrop.py (alternativa de versão em lote para embryoCrop GUI descrita acima;Usuários experientes python apenas)10,13
    1. Para usar screenCrop.py, a versão de software Python para o corte de conjuntos de dados maiores em um formato de lote, clone ou baixar o código fonte do Github (github.com/renatkh/embryo_crop.git).
    2. Leia as instruções para configurar um ambiente virtual adequado e siga o sistema de nomeação de arquivos descrito; ambos são detalhados no arquivo README no repositório Github: https://github.com/renatkh/embryo_crop/blob/master/README.md.
    3. Uma vez que as variáveis ambientais e as convenções nomeando foram estabelecidas corretamente, parameters.py abertas e screenCrop.py em um editor da escolha.
    4. Para modificar parâmetros ajustáveis sem tocar no código fonte, edite o arquivo parameters.py.
      NOTA: também é possível alterar diretamente os parâmetros dentro do cabeçalho de screenCrop.py.
      1. Se usar o arquivo de configuração parameters.py, altere a configuração use_configure para True. Se usar a edição direta dentro de screenCrop.py, deixe a configuração use_configure no False.
      2. Localizar as seguintes informações dentro do arquivo parameters.py e fazer modificações para atender parâmetros de imagem desejados e estrutura de arquivos:
        1. loadFolder (linha 9): Alteração na unidade em que os arquivos são armazenados (por exemplo, Z:/, D://, etc.)
        2. data (linha 7): Alterar para a pasta contendo arquivos para a sessão de imagem. Isto é referido como "Nome da pasta de experimento" no arquivo de rastreamento CSV (ver instruções).
        3. trackingFile (linha 11): Alterar o caminho para o arquivo CSV em que as informações do experimento são armazenadas.
        4. z (linha 13): Definido como o número de aviões z.
        5. nT (line14): Definido como o número de pontos de tempo.
        6. nWells (linha 19): Definido como o número de poços utilizados.
        7. pointVisits (linha 20): Definido como o número máximo de visitas ponto (por poço).
        8. Na linha 10 encontrar o local atualmente ocupado por 'CV1000/' e entrada da pasta externa utilizada no caminho do arquivo. Para evitar problemas, use a seguinte convenção: 'XXXXXXX/'.
        9. Na Linha 12, insere um caminho válido de arquivo para armazenar dados de relação de aspecto para dados cortados.
        10. Nas linhas 15, 16, 17 e 18 entradas Verdadeiras/Falsas para saber se as imagens passam pelo seguinte processamento:
          1. Entrada verdadeira ou falsa para correção de deriva na Linha 15.
          2. Entrada verdadeira ou falsa para subtrair fundo na linha 16. O tamanho do recurso deve ser empiricamente determinado para diferentes cepas de marcadores e tamanhos de pixels. Na configuração aqui, o tamanho da característica foi definido como 41 para a tensão da Germ-Camada e 201 para a tensão do Morphogenesis. Subtrair de fundo deve ser feito em conjunto com a correção de atenuação.
          3. Entrada verdadeira ou falsa para correção de atenuação na Linha 17.
          4. Entrada verdadeira ou falsa para rotação posterior anterior na Linha 18.
    5. Uma vez que todas as mudanças foram feitas, a recorte pode começar. Para fazer isso, mude para screenCrop.py e selecione o ícone de jogo na barra de ferramentas, no menu suspenso selecione Run As > Python Run.
    6. Como o corte pode levar várias horas para ser concluído para um grande conjunto de dados (50 pontos visita 18 z passos, 3 canais, 31 pontos de tempo), acompanhar o progresso do corte na janela do console. Uma vez que o corte é concluído, uma pequena janela irá mostrar previews das imagens cortadas antes de salvar. Para cada imagem existem 3 opções:
      1. Salvar: Press Space Bar para salvar a imagem se a imagem é cortada corretamente, sem áreas de interesse a ser cortado.
      2. X: X: X: X: Pressione X se a imagem parece ter áreas de interesse cortadas; a imagem será salva com um X na frente do nome para separá-lo das outras imagens.
      3. Excluir: Pressione D para excluir a imagem cortada se a imagem não for cortada corretamente ou o embrião não for satisfatório.
        NOTA: As imagens serão salvas para uma subpasta chamada "Cortada" na Pasta de Carga (definida na Linha 9 do programa).

4. Visualização (Figura 4)

NOTA: OpenandCombine_embsV2.ijm10,12 é uma macro ImageJ que irá construir um arquivo de tiff fácil de ver de todas as imagens para uma estirpe e condição específicas. Instalação de FIJI / ImageJ14,15 é necessário. Esta macro é executado de acordo com a nossa estrutura de arquivo; ele terá de ser modificado para trabalhar com outras estruturas de arquivo. Um guia para a estrutura de arquivo adequada e descrição detalhada de considerações importantes podem ser encontrados no final do arquivo GUI_Instructions_zenodo_repoV2.docx no repositório Zenodo. Por favor, leia essas instruções completamente antes de imagem para nomear corretamente e estruturar arquivos para interagir melhor com esta macro. Para referência, nossa estrutura de localização de arquivos se parece com esta:
Z:\cropped\Target\Strain\Emb#\Target_Emb#_15 Digit Unique Identifier _W##F#_T##_Z##_C#.tif
i.e. Z:\cropped\EMBD0001\GLS\Emb1\EMBD0001_Emb1_20140327T135219_W02F1_T01_C1.tif

  1. Baixe OpenandCombine_embsV2 e GUI_Instructions_zenodo_repoV2.docx da Zenodo (https://zenodo.org/record/3235681#.XPAnn4hKg2w).
  2. Prepare as seguintes informações:
    -O local onde as pastas de imagem são armazenadas (após o corte).
    -O nome da pasta de imagem (s) para a condição específica (s) a ser processado (ou seja, EMBD0002). Isto é referido como "Alvo" no exemplo acima
    -Um identificador exclusivo alfa-numérico de 15 dígitos que é específico para um determinado experimento durante a noite - este identificador é o nome da pasta de aquisição de dados (ou seja, 20140402T140154) e o identificador exclusivo está incorporado no nome de arquivo tiff individual (EMBD0002_Emb1_ 20140402T140154_W06F2_T01_Z01_C1) para cada embrião imageado naquele dia. A macro usa esse identificador para verificar se há embriões adquiridos na mesma data e pode montar condições repetidas, com datas separadas, em arquivos separados do ImageJ.
  3. Open ImageJ, e arrastar-e-soltar o arquivo macro, OpenandCombine_embsV2.ijm, para a barra ImageJ, ou abrir a macro diretamente.
  4. Uma vez que o macro está aberto, localizar as linhas 3 e 4. Entrada as informações recolhidas em (seção 4.2) de acordo com as seguintes etapas:
    1. Na Linha 3 (RNAL), insere o nome alvo para que as imagens sejam processadas. Entrada de cada alvo na estrutura a seguir newArray ("XXXXXXXX/"); incluir citações. Para executar várias condições ao mesmo tempo, separe com uma ma e mantenha todos os nomes-alvo dentro do parêntese (ou seja, newArray ("EMBD0000/", "EMBD0001/","EMBD0002 /"
    2. Na Linha 4 (data), insume o identificador exclusivo alfa-numérico de 15 dígitos em citações, por exemplo newArray ("20140402T140154").
  5. Press Run na parte inferior esquerda da janela macro. Uma janela aparecerá, que lançará um alerta para navegar até a pasta externa contendo as pastas de imagem cortadas (especificadas em 4.4.1).
  6. Uma vez selecionada, outra janela aparecerá, o que permitirá especificação de parâmetros de imagem.
    1. Digite o número de canais, o número de fatias Z, o tamanho da fonte para o texto usado na rotulagem das imagens compiladas, e a cor para cada um dos canais.
    2. Verifique o auto/off contrastando em todos os canais.
  7. Uma vez que todos os parâmetros foram especificados, clique OK na parte inferior da janela. O arquivo composto começará a montar; isso levará vários minutos, por condição, para ser concluído.
  8. Uma vez concluídos, revise os arquivos que são deixados em aberto, se desejar. Eles podem ser fechados sem salvar, como o macro já salvou os arquivos para uma pasta recém-criada, que é nomeado da seguinte maneira: nome da pasta exterior (especificado no prompt da seção 4.5) + "-fiji-processado-saída" (ou seja, Z:\ cropped-fiji-processado-saída\EMBD0002_GLS_20140402T140154.tif).

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Resultados

Um desafio significativo em caracterizar o efeito de perturbações moleculares no desenvolvimento embrionário de C. elegans é que toma aproximadamente 10 h para que os embriões progridam da primeira clivagem ao fim do alongamento em 20°16. Um método de meia-alta-entrada em que grandes coortes de embriões podem ser simultaneamente imagem é útil para eventos nesta escala de tempo, pois permite imagens de múltiplas condições em paralelo com um tamanho de conjunto suficiente para cada condição...

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Discussão

Este trabalho descreve um conjunto de ferramentas e métodos que foram desenvolvidos para permitir esforços em maior escala para perfilar a função dos genes no desenvolvimento embrionário em C. elegans. Nosso método de meia-alta-geração permite a imagem latente 3D do time-lapse do desenvolvimento embrionário na definição de 20 minutos para 80-100 embriões em uma única experiência. Embora este protocolo possa ser adaptado para uso com qualquer cepa de marcador desejada(s), este trabalho demonstra o potencial do mé...

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Agradecimentos

A S.D.O. foi apoiada pelo National Institute of General Medical Sciences-sponsored University of California San Diego Institutional Research and Academic Career Development Award (NIH/IRACDA K12 GM068524). A.D. e K.O. foram apoiados pelo Instituto Ludwig de Pesquisa do Câncer, que também lhes forneceu financiamento de pesquisa usado para apoiar este trabalho. Estamos gratos a Andrew Chisholm por seu conselho nas fases iniciais deste projeto, Ronald Biggs por contribuições para este projeto após a fase inicial de desenvolvimento do método, e Dave Jenkins e Andy Shiau para apoio e acesso à Descoberta de Pequenas Moléculas sistema de imagem de alto conteúdo do grupo.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Conjunto de Tubo AspiradorDrummond Scientific2-000-000
(25 mL)Software Cell Voyager Drummond Scientific2-000-025
Yokogawa Electric CorpCV1000
(15 mL)Microscópio CV1000 da USA Scientific1475-0501
Yokogawa Electric CorpLâmina de depressão CV1000
(3 poços)Erie Scientific1520-006
Centrífuga Eppendorf NikonSMZ-645
5810REppendorf5811 07336
ImageJ / FIJIOpen Sourcehttps://imagej.net/Fiji
M9 BufferLab Preparadohttps://openwetware.org/wiki/M9_salts
Tubo de Microcentrífuga (1.5 mL)USA Scientific1615-5500
Microseal F-foil SealBio-RadMSF1001
NGM PlatesPreparado em Laboratóriohttp://www.wormbook.org/chapters/www_strainmaintain/strainmaintain.html#d0e214
Bisturi #15Bard ParkerREF 371615
Sensoplate Plus, 384 Well, F-bottom, Greiner com Fundo de VidroBio-One781855
Cloridrato de TetramisolSigma AldirchT1512-10G
Pinças, Dumont #3Ciências de Microscopia Eletrônica0109-3-PO
U-PlanApo objetiva (10&vezes; 0.4 NA)Olympus1-U2B823
U-PlanApo objetiva (60&vezes; 1.35 NA)Olympus1-U2B832
Pipeta Calibrada Incluído com Tubo Cônico Microscópio de dissecação

Referências

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