Um método de imagem semi-alta-fonte e um kit de ferramentas de visualização de dados para analisar o desenvolvimento embrionário de C. elegans

Renat  N. Khaliullin; Jeffrey  M. Hendel; Adina Gerson-Gurwitz; Shaohe Wang; Stacy  D. Ochoa; Zhiling Zhao; Arshad Desai; Karen Oegema; Rebecca  A. Green

doi:10.3791/60362

Method Article

Um método de imagem semi-alta-fonte e um kit de ferramentas de visualização de dados para analisar o desenvolvimento embrionário de C. elegans

DOI:

10.3791/60362

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October 29th, 2019

Renat N. Khaliullin¹^,²^,³ , Jeffrey M. Hendel¹^,² , Adina Gerson-Gurwitz¹^,² , Shaohe Wang¹^,⁴^,⁵ , Stacy D. Ochoa¹^,⁶ , Zhiling Zhao¹^,⁷ , Arshad Desai¹^,² , Karen Oegema¹^,² , Rebecca A. Green¹^,²

¹Ludwig Institute for Cancer Research, San Diego, ²Department of Cellular and Molecular Medicine, University of California, San Diego, ³Recursion Pharmaceuticals, ⁴Biomedical Sciences Graduate Program, University of California, San Diego, ⁵Cell Biology Section, National Institute of Dental and Craniofacial Research, National Institutes of Health, ⁶Department of Biology, San Diego State University, ⁷Developmental and Stem Cell Biology Graduate Program, University of California, San Francisco

Summary

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Este trabalho descreve um protocolo semi-alta de supressão que permite imagens simultâneas de lapso de tempo 3D de embriaênese embrionária em embriões de 80-100 C. elegans em uma única corrida noturna. Além disso, as ferramentas de processamento e visualização de imagens são incluídas para simplificar a análise de dados. A combinação destes métodos com tensões personalizadas do repórter permite a monitoração detalhada do embryogenesis.

Abstract

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C. elegans é o principal sistema para a análise sistemática da especificação do destino celular e eventos morfogenéticos durante o desenvolvimento embrionário. Um desafio é que a embriogênese se desdobra dinamicamente durante um período de cerca de 13 h; este prazo de meio dia restringiu o âmbito das experiências, limitando o número de embriões que podem ser imageados. Aqui, descrevemos um protocolo de meia-alta de supressão que permite a imagem simultânea de lapso de tempo 3D de desenvolvimento em 80-100 embriões em resolução de tempo moderado, de até 14 condições diferentes, em uma única corrida noturna. O protocolo é simples e pode ser implementado por qualquer laboratório com acesso a um microscópio com capacidade de visita de ponto. A utilidade deste protocolo é demonstrada usando-o para imagem duas cepas personalizadas expressando marcadores fluorescentes otimizados para visualizar aspectos-chave da especificação da camada germinativa e morgênese. Para analisar os dados, um programa personalizado que cultiva embriões individuais fora de um campo de visão mais amplo em todos os canais, z-passos e pontos de tempo e salva as seqüências para cada embrião em uma pilha de tiff separada foi construído. O programa, que inclui uma interface gráfica de usuário (GUI) amigável, simplifica o processamento de dados isolando, pré-processamento e orientando uniformemente embriões individuais em preparação para visualização ou análise automatizada. Também é fornecido uma macro ImageJ que compila dados de embriões individuais em um arquivo multi-painel que exibe projeção de fluorescência de intensidade máxima e imagens de campo brilhante para cada embrião em cada ponto de tempo. Os protocolos e ferramentas aqui descritos foram validados usando-os para caracterizar o desenvolvimento embrionário após a queda de 40 genes de desenvolvimento previamente descritos; esta análise visualizou fenótipos de desenvolvimento previamente anotados e revelou novos. Em resumo, este trabalho detalha um método de imagem semi-alta-desperação juntamente com um programa de corte e ferramenta de visualização ImageJ que, quando combinado com cepas expressando marcadores fluorescentes informativos, acelera muito os experimentos para analisar desenvolvimento embrionário.

Introduction

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O embrião C. elegans é um importante sistema modelo para biologia celular mecanicista e análise da especificação do destino celular e eventos morfogenéticos que impulsionam o desenvolvimento embrionário^1,^2,^3,⁴ ^,^5,^6,^7,^8,⁹. Até o momento, grande parte da caracterização de eventos de nível celular e especificação do destino celular no embrião foi alcançada usando....

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Protocol

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1. Preparando c. elegans embriões para imagens semi-alta-throughput

Nota: O objetivo desta parcela do protocolo é carregar uma população de embriões c. elegans semisincronizados (estágio de 2 a 8 células), dissecados de cepas de marcadores adequadas (Figura 2),em uma placa de 384 poços com fundo de vidro para imagem. Outros formatos de placa também podem funcionar, mas as 384 placas de poço são preferidas porque o pequeno tamanho do poço restringe a propagação de embriões a uma área relativamente pequena, o que facilita a identificação de campos contendo vários embriões para ima....

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Results

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Um desafio significativo em caracterizar o efeito de perturbações moleculares no desenvolvimento embrionário de C. elegans é que toma aproximadamente 10 h para que os embriões progridam da primeira clivagem ao fim do alongamento em 20°^16. Um método de meia-alta-entrada em que grandes coortes de embriões podem ser simultaneamente imagem é útil para eventos nesta escala de tempo, pois permite imagens de múltiplas condições em paralelo com um tamanho de conjunto suficiente para cada condição.......

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Discussion

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Este trabalho descreve um conjunto de ferramentas e métodos que foram desenvolvidos para permitir esforços em maior escala para perfilar a função dos genes no desenvolvimento embrionário em C. elegans. Nosso método de meia-alta-geração permite a imagem latente 3D do time-lapse do desenvolvimento embrionário na definição de 20 minutos para 80-100 embriões em uma única experiência. Embora este protocolo possa ser adaptado para uso com qualquer cepa de marcador desejada(s), este trabalho demonstra o potencial do mé.......

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Acknowledgements

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A S.D.O. foi apoiada pelo National Institute of General Medical Sciences-sponsored University of California San Diego Institutional Research and Academic Career Development Award (NIH/IRACDA K12 GM068524). A.D. e K.O. foram apoiados pelo Instituto Ludwig de Pesquisa do Câncer, que também lhes forneceu financiamento de pesquisa usado para apoiar este trabalho. Estamos gratos a Andrew Chisholm por seu conselho nas fases iniciais deste projeto, Ronald Biggs por contribuições para este projeto após a fase inicial de desenvolvimento do método, e Dave Jenkins e Andy Shiau para apoio e acesso à Descoberta de Pequenas Moléculas sistema de imagem de alto conteúdo do grupo.

....

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Materials

List of materials used in this article
Name	Company	Catalog Number
Conjunto de Tubo Aspirador	Drummond Scientific	2-000-000
(25 mL)	Software Cell Voyager Drummond Scientific	2-000-025
	Yokogawa Electric Corp	CV1000
(15 mL)	Microscópio CV1000 da USA Scientific	1475-0501
Yokogawa Electric Corp		Lâmina de depressão CV1000
(3 poços)	Erie Scientific	1520-006
	Centrífuga Eppendorf Nikon	SMZ-645
5810R	Eppendorf	5811 07336
ImageJ / FIJI	Open Source	https://imagej.net/Fiji
M9 Buffer	Lab Preparado	https://openwetware.org/wiki/M9_salts
Tubo de Microcentrífuga (1.5 mL)	USA Scientific	1615-5500
Microseal F-foil Seal	Bio-Rad	MSF1001
NGM Plates	Preparado em Laboratório	http://www.wormbook.org/chapters/www_strainmaintain/strainmaintain.html#d0e214
Bisturi #15	Bard Parker	REF 371615
Sensoplate Plus, 384 Well, F-bottom, Greiner com Fundo de Vidro	Bio-One	781855
Cloridrato de Tetramisol	Sigma Aldirch	T1512-10G
Pinças, Dumont #3	Ciências de Microscopia Eletrônica	0109-3-PO
U-PlanApo objetiva (10&vezes; 0.4 NA)	Olympus	1-U2B823
U-PlanApo objetiva (60&vezes; 1.35 NA)	Olympus	1-U2B832

Pipeta Calibrada Incluído com Tubo Cônico Microscópio de dissecação

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Armenti, S. T., Nance, J. Adherens junctions in C. elegans embryonic morphogenesis. Sub-Cellular Biochemistry. 60, 279-299 (2012).
Chisholm, A. D., Hsiao, T. I. The Caenorhabditis elegans epidermis as a model ....

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