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Developmental Biology

Un método de imágenes de semi-alto rendimiento y un kit de herramientas de visualización de datos para analizar el desarrollo embrionario de C. elegans

Published: October 29, 2019 doi: 10.3791/60362
Automatic Translation
1,2,3, 1,2, 1,2, 1,4,5, 1,6, 1,7, 1,2, 1,2, 1,2
1Ludwig Institute for Cancer Research, San Diego, 2Department of Cellular and Molecular Medicine, University of California, San Diego, 3Recursion Pharmaceuticals, 4Biomedical Sciences Graduate Program, University of California, San Diego, 5Cell Biology Section, National Institute of Dental and Craniofacial Research, National Institutes of Health, 6Department of Biology, San Diego State University, 7Developmental and Stem Cell Biology Graduate Program, University of California, San Francisco

Summary

Este trabajo describe un protocolo de semi-alto rendimiento que permite imágenes simultáneas de lapso de tiempo 3D de embriogénesis en embriones de 80-100 C. elegans en una sola carrera nocturna. Además, se incluyen herramientas de visualización y procesamiento de imágenes para agilizar el análisis de datos. La combinación de estos métodos con cepas de reportero personalizadas permite un seguimiento detallado de la embriogénesis.

Abstract

C. elegans es el sistema principal para el análisis sistemático de la especificación del destino celular y eventos morfogenéticos durante el desarrollo embrionario. Un desafío es que la embriogénesis se desarrolla dinámicamente durante un período de aproximadamente 13 h; esta escala temporal de medio día ha limitado el alcance de los experimentos limitando el número de embriones que se pueden crear imágenes. Aquí, describimos un protocolo de semi-alto rendimiento que permite la toma simultánea de imágenes de lapso de tiempo 3D del desarrollo en 80-100 embriones con resolución de tiempo moderada, de hasta 14 condiciones diferentes, en una sola carrera nocturna. El protocolo es sencillo y puede ser implementado por cualquier laboratorio con acceso a un microscopio con capacidad de visita puntual. La utilidad de este protocolo se demuestra utilizándolo para crear una imagen de dos cepas personalizadas que expresan marcadores fluorescentes optimizados para visualizar aspectos clave de la especificación de la capa germinal y la morfogénesis. Para analizar los datos, se construyó un programa personalizado que recorta embriones individuales de un campo de visión más amplio en todos los canales, pasos z y puntos de tiempo y guarda las secuencias de cada embrión en una pila tiff independiente. El programa, que incluye una interfaz gráfica de usuario (GUI) fácil de usar, agiliza el procesamiento de datos aislando, preprocesando y orientando uniformemente embriones individuales en preparación para la visualización o el análisis automatizado. También se suministra una macro ImageJ que compila datos de embriones individuales en un archivo multipanel que muestra la proyección de fluorescencia de máxima intensidad e imágenes de campo brillante para cada embrión en cada punto de tiempo. Los protocolos y herramientas descritos en este documento fueron validados utilizándolos para caracterizar el desarrollo embrionario tras el derribo de 40 genes de desarrollo descritos anteriormente; este análisis visualizó fenotipos de desarrollo previamente anotados y reveló otros nuevos. En resumen, este trabajo detalla un método de imagen de rendimiento semi-alto junto con un programa de recorte y una herramienta de visualización ImageJ que, cuando se combina con cepas que expresan marcadores fluorescentes informativos, acelera en gran medida los experimentos para analizar desarrollo embrionario.

Introduction

El embrión C. elegans es un importante sistema modelo para la biología celular mecanicista y el análisis de la especificación del destino celular y eventos morfogenéticos que impulsan el desarrollo embrionario1,2,3,4 ,5,6,7,8,9. Hasta la fecha, gran parte de la caracterización de eventos a nivel celular y especificación del destino celular en el embrión se ha logrado utilizando experimentos de imagen uno a uno de resolución temporal relativamente alta (es decir, adquisición cada 10–100 s) de embriones que expresan marcadores fluorescentes. Aunque es muy adecuado para eventos en el orden de segundos a decenas de minutos, este enfoque se convierte técnicamente en limitante para la caracterización de procesos más largos, en el orden de horas a días. El desarrollo embrionario desde el primer escote hasta el final del alargamiento toma alrededor de 10 h. En este tiempo, métodos de semi-alto rendimiento que permitirían imágenes simultáneas de menor resolución de tiempo (es decir, adquisición a intervalos de tiempo de 5-20 min) de cohortes más grandes de embriones, de diferentes condiciones, abrirían una nueva gama de experimentos; por ejemplo, permitir esfuerzos sistemáticos de cribado a gran escala y el análisis del número suficiente de embriones para comparar las consecuencias de las perturbaciones moleculares.

Aquí, describimos un método de semi-alto rendimiento para monitorear la embriogénesis de C. elegans que permite la toma simultánea de imágenes de lapso de tiempo 3D del desarrollo en 80-100 embriones, de hasta 14 condiciones diferentes, en una sola carrera nocturna. El protocolo es fácil de implementar y puede ser llevado a cabo por cualquier laboratorio con acceso a un microscopio con capacidades de visita puntual. Los pasos principales en este protocolo se describen en la Figura 1. En resumen, los embriones se diseccionan de adultos gravídes que expresan marcadores fluorescentes de interés y transfieren embriones jóvenes (etapa de 2-8 células) a pozos de una placa de 384 pocillos para la toma de imágenes. En este formato, el tamaño relativamente pequeño del pozo canaliza los embriones en un área estrecha, lo que facilita la identificación de campos que contienen múltiples embriones para la toma de imágenes de lapso de tiempo. Para mantener un desarrollo más o menos sincrónico en toda la cohorte de embriones, las disecciones se realizan en medios refrigerados y la placa se mantiene en hielo, lo que impide un desarrollo significativo durante la ventana de tiempo de disección de una hora. La placa se transfiere al microscopio y los embriones se filman en una habitación con temperatura controlada durante la noche, a intervalos de tiempo de 20 minutos, utilizando una lente de inmersión en aceite de 60x 1.35 NA, para recoger todo el rango z en pasos de 2 m. Cincuenta campos, cada uno con entre 1-5 embriones, se utilizan en una sola carrera nocturna. Dependiendo del experimento deseado, la resolución de tiempo podría aumentarse (por ejemplo, imágenes a intervalos de 5-10 min) disminuyendo proporcionalmente el número de campos con imágenes.

Con este protocolo, incluso una sola ejecución nocturna genera una cantidad significativa de datos (80-100 embriones repartidos en 50 campos) y experimentos más grandes pueden volverse rápidamente inmanejables con respecto al análisis de datos. Para facilitar el procesamiento, la visualización y el análisis simplificado de estos datos, se creó un programa para recortar y orientar embriones y realizar pasos de preprocesamiento (opcional), y una macro ImageJ que compila los datos para simplificar la visualización. Estos programas se pueden utilizar para procesar imágenes recopiladas utilizando enfoques convencionales, ya que son independientes del método de imagen, que requieren un solo plano de campo brillante. El primer programa toma en un campo 4D que contiene múltiples embriones (opción GUI o código fuente embryoCrop.py) o múltiples campos 4D que contienen múltiples embriones (screenCrop.py), refuerza estrechamente los embriones y los orienta en una configuración anterior-posterior. Estos programas también ofrecen a los usuarios la opción de realizar la resta en segundo plano, la corrección de deriva y la corrección de atenuación. Los archivos resultantes son pilas tiff preprocesadas y estrechamente recortadas para cada embrión que son modificables para el análisis automatizado de imágenes. Para facilitar la visualización de todos los embriones para cada condición, se escribió una macro ImageJ (OpenandCombine_embsV2.ijm), que ensambla todos los embriones de una condición dada en una sola pila tiff y matrices de imágenes de campo brillante y color de proyección de máxima intensidad ( RGB), en paralelo, para cada embrión. Los métodos fueron validados utilizándolos para caracterizar el desarrollo embrionario después de derribar 40 genes de desarrollo descritos anteriormente en un par de cepas personalizadas que expresan marcadores fluorescentes optimizados para visualizar aspectos clave de la capa germinal especificación y morfogénesis10,11. Juntos, el protocolo de imágenes embrionarias de rendimiento semi-alto y las herramientas de procesamiento de imágenes permitirán experimentos de mayor número de muestras y esfuerzos de cribado a gran escala destinados a comprender los procesos de desarrollo. Además, estas cepas también proporcionarán un medio eficaz para examinar los efectos de las perturbaciones moleculares en la embriogénesis.

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Protocol

1. Preparación de C. elegans Embryos para imágenes de semi-alto rendimiento

NOTA: El objetivo de esta parte del protocolo es cargar una población de embriones C. elegans semi-sincronizados (etapa de 2 a 8 celdas), diseccionados de cepas marcadoras adecuadas(Figura 2),en una placa de 384 pocillos con fondo de vidrio para la toma de imágenes. Otros formatos de placas también podrían funcionar, pero se prefieren las 384 placas de pozo porque el pequeño tamaño del pozo restringe la propagación de embriones a un área relativamente pequeña, lo que facilita la identificación de campos que contienen múltiples embriones para la toma de imágenes de lapso de tiempo. La sincronización aproximada de los embriones garantiza que se capture el curso completo de desarrollo para cada uno de los embriones en un campo.

  1. Preparar 5-10 ml de solución de 0,1 mg/ml de tetramisole clorhidrato (TMHC) anestésico disuelto en medio M9 helado (0,45 M Na2HPO4x 7H2O, 0,11 M KH2PO4, 0,04 M NaCl, 0,09 M NH4Cl) para utilizar durante el tiempo disección e imágenes. Este medio incluye un anestésico para asegurar que la larva eclosionada en movimiento no interrumpa la toma de imágenes de embriones en etapas de desarrollo anteriores.
    NOTA: Si utiliza las herramientas de recorte y visualización para analizar los datos adquiridos mediante métodos de montaje de almohadilla sin agarosa estándar, vaya a la sección 3 a continuación.
  2. Aliquot 70 l de la solución preparada en pozos individuales de una placa de 384 pocillos con fondo de vidrio de 384 pocillos con un pozo para cada condición; evitar las dos filas externas de la placa para evitar efectos de borde.
    NOTA: Es útil enmascarar los pozos circundantes utilizando lámina de placa PCR adhesiva (ver ejemplo en la Figura 1D) esto preserva los pozos adyacentes para futuros experimentos y facilita la localización de los pozos apropiados bajo el microscopio de disección. Una vez que la solución esté alícuota, mantenga la placa y la solución restante en hielo durante la disección.
  3. Generar pipetas bucales para transferir embriones desde la diapositiva de depresión (donde se diseccionan los hermafroditas gravídicas) a los pozos. Tire de pipetas capilares (pipetas calibradas de 25 l) sobre una llama y rompa para generar un extremo cónico fino(Figura 1D). Se necesita un pipeta por condición para evitar la contaminación cruzada; desechar el pipeta después de su uso.
  4. Utilice pinzas finas para transferir 10 adultos gravid bajo un endoscopio de disección en 150 s de la solución de TMHC helada alícotada a un tobogán de depresión para cada condición. Usando las pinzas y un bisturí, diseccionar los gusanos para liberar los embriones.
  5. Cargue un pipeta capilar tirado en el accesorio del aspirador incluido con los pipetas, y la boca pipeta para transferir todos los embriones de 2 a 8 fases celulares en un pozo individual de la placa preparada(Figura 1D). Evite transferir embriones en etapa tardía y restos de disección. Examinar bajo un alcance de disección y si hay agregados de embriones, entubamiento de la boca hacia arriba y hacia abajo o grupos de grifos de embriones con punta de pipeta para dispersar.
    NOTA: Para evitar la contaminación cruzada, limpie los equipos de disección y utilice un nuevo tubáco de la boca mientras se mueve entre condiciones. Almacene la placa en hielo entre disecciones.
  6. Una vez diseccionados los gusanos de todas las condiciones y colocados embriones en su pozo apropiado, gire la placa de 384 pocillos durante 1 min a 600 x g para asentar los embriones.
  7. Limpie la parte inferior de la placa con una toallita empapada en etanol para eliminar cualquier residuo y colocar la placa en un microscopio confocal equipado con un portaplacas en un entorno con temperatura controlada.
    NOTA: Los pasos que siguen detallan este método mediante la configuración de laboratorio; por favor modifique las condiciones de adquisición para adaptarse a las necesidades experimentales y el equipo. Aquí, se utiliza una caja de escáner confocal equipada con un disco giratorio nipkow doble mejorado con microlentes, una cámara EM-CCD de 512 x 512, una etapa automática de alta precisión (resolución designada 0,1 m) y un control motorizado del eje z (resolución designada 0,1 m). Este sistema se mantiene en una habitación de 16 oC, que mantiene la temperatura del microscopio entre 21 y 23 oC durante la toma de imágenes durante la noche.
  8. Para identificar campos con embriones adecuados, realice un pre-escaneo de cada pozo utilizando un objetivo de 10x 0.4 NA y un software de imagen adecuado. Los campos más óptimos contendrán más de un embrión en etapa temprana que esté en el mismo plano focal que otros embriones e idealmente tendráun un contacto mínimo entre embriones adyacentes. Marque las posiciones de las regiones adecuadas.
  9. Para seleccionar campos de imágenes, cambie al objetivo 60x y ajuste el plano focal en cada visita de punto para seccionar adecuadamente los embriones. Se crean una imagen de 1 a 4 campos por pozo, para un total de 50 campos en 14 pozos, y cada campo puede contener entre uno y cinco embriones. En general, se seleccionan de 4 a 15 embriones de cada condición para obtener imágenes de alta resolución.
    NOTA: Una variable clave en este paso es el uso de suficiente aceite; colocar aceite en el objetivo, visitando puntos en cada pozo para esparcir el aceite alrededor de la superficie de todos los pozos y luego aplicar una gota adicional de aceite al objetivo antes de la selección de campos.
  10. Idee los campos seleccionados utilizando un objetivo de 60x 1,35 NA para adquirir secciones de 18 z a intervalos de 2 m cada 20 minutos durante 10 horas. Las condiciones de imagen que utilizan las cepas de reporteros de capa germinal y morfogénesis son las siguientes: campo brillante, 90% de potencia, 25 ms, 20% de ganancia; 488 nm, 100% de potencia, 200 ms, 60% de ganancia; 568 nm, 45% de potencia, 150 ms, 60% de ganancia.
  11. Una vez completada la toma de imágenes, evalúe la letalidad embrionaria realizando un aumento bajo (objetivo de 10x 0,4 NA) exploración de campo brillante de pozo completo de 20 a 24 horas después del inicio de la toma de imágenes durante la noche.

2. Puntuación de la letalidad embrionaria

  1. Usando los campos escaneados 10x después de la ejecución, evalúe la letalidad embrionaria y los defectos larvariales contando gusanos eclosionados y embriones sin rayar para cada pocal.
  2. Puntuación de embriones sin rayar como letales embrionarios. Excluir del recuento de la letalidad los embriones detenidos de una a cuatro etapas celulares, ya que los embriones diseccionados jóvenes a veces no completan la formación de cáscaras de huevo (si la meiosis II aún no está completa) y los defectos de permeabilidad pueden conducir a complicaciones osmóticas durante los dos primeros Divisiones.
  3. Puntuar gusanos parcialmente eclosionados o completamente eclosionados con morfología corporal o defectos de comportamiento, como volquete o paralizado, como "larva anormal".

3. Recorte automatizado(Figura 3A)

NOTA: El software se aloja en dos ubicaciones: (1) Zenodo alberga una versión fácil de usar del software12 que no requiere ninguna experiencia de programación. (2) Github contiene el código fuente de nuestro embryoCropUI.py y screenCrop.py software13,que requieren competencia con Python. Las instrucciones detalladas para descargar y operar ambas versiones del programa se pueden encontrar a continuación.

  1. Recorte automatizado utilizando la versión ejecutable embryoCropUI (versión fácil de usar)
    1. Para utilizar el programa embryoCropUI, primero descargue el programa de Zenodo (https://zenodo.org/record/3235681#.XPAnn4hKg2w)12.
      1. Descargue la versión de formato MacOS o Windows del programa (tenga en cuenta que la versión de MacOS requiere MacOS X10.11 o superior).
      2. Descargue el archivo de instrucciones (GUI_Instructions_zenodo_repoV2.docx), que proporciona instrucciones paso a paso para probar y utilizar el programa embryoCropUI.
      3. Descargue test_files.zip para comprobar si el programa funciona correctamente en la plataforma (consulte las instrucciones).
    2. Una vez descargado, descomprima y navegue para encontrar el ejecutable embryoCropUI (..... . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Haga doble clic para iniciar (o elija 'abrir con' terminal) y ejecute el ejecutable embryoCropUI.
    3. El ejecutable GUI recorta un campo de visión 4D a la vez. En la esquina superior izquierda, seleccione el botón Abrir para cargar el campo específico que desea recortar (multi-tiff). Si recorta una serie tiff, con varias dimensiones (es decir, z, tiempo, canal), cargue solo la primera imagen de la serie dentro de la carpeta (una serie tiff por carpeta).
    4. Una vez cargadas las imágenes, especifique la siguiente información: número de sectores z, (Z), número de puntos de tiempo (T), número de canales (C), el canal que corresponde a DIC o brightfield (primero 1, segundo 2, etc.).
    5. Seleccione el procesamiento adicional para que se ejecute en las imágenes. El programa ofrece Corrección de deriva, Resta de fondo y Corrección de atenuación.
    6. Especifique los parámetros para la resta en segundo plano y la corrección de atenuación para guiar los esfuerzos de procesamiento en la solicitud de GUI. Para Restar fondo, defina el tamaño de entidad más grande para reflejar el tamaño de la señal significativa; este tamaño de entidad no debe considerarse como fondo y debe ser un valor de número impar. Introduzca un valor de 0-1 para Corrección de atenuación. El valor Corrección de atenuación refleja el porcentaje de intensidad original que permanece en la profundidad más leal del objeto que se está creando imágenes.
      NOTA: La resta de fondo y la corrección de atenuación deben ejecutarse juntas.
    7. Especifique el orden de la colección de imágenes (es decir, el tiempo de canal-z (czt) o el tiempo de canal z (zct)).
    8. Especifique las micras por píxel para las imágenes en función de la cámara que se esté utilizando.
      NOTA: El recorte deficiente de la imagen se producirá si el tamaño del píxel no está definido correctamente.
    9. Seleccione Ejecutar en la esquina inferior izquierda. Se creará una nueva subcarpeta con la etiqueta "recortar" en la misma ruta que la carpeta sin recortar; las versiones recortadas se guardarán en esta ubicación. Dependiendo del tamaño del archivo, el recorte debe completarse en cuestión de segundos a minutos.
  2. Recorte automatizado con screenCrop.py (versión por lotes alternativa a embryoCrop GUI descrita anteriormente;Solo usuarios expertos en Python)10,13
    1. Para utilizar screenCrop.py, la versión de software de Python para recortar conjuntos de datos más grandes en un formato por lotes, clonar o descargar el código fuente de Github (github.com/renatkh/embryo_crop.git).
    2. Lea las instrucciones para configurar un entorno virtual adecuado y siga el sistema de nombres de archivos descrito; ambos se detallan en el archivo README en el repositorio Github: https://github.com/renatkh/embryo_crop/blob/master/README.md.
    3. Una vez que las variables ambientales y las convenciones de nomenclatura se han establecido correctamente, abra parameters.py y screenCrop.py en un editor de elección.
    4. Para modificar los parámetros ajustables sin tocar el código fuente, edite el archivo parameters.py.
      NOTA: también es posible cambiar directamente los parámetros dentro del encabezado de screenCrop.py.
      1. Si utiliza el archivo de configuración parameters.py, cambie la configuración use_configure a True. Si utiliza la edición directa dentro de screenCrop.py, deje la opción use_configure en False.
      2. Busque la siguiente información dentro del archivo parameters.py y realice modificaciones para adaptarse a los parámetros de imagen y la estructura de archivos deseados:
        1. loadFolder (línea 9): Cambie a la unidad en la que se almacenan los archivos (por ejemplo, Z:/, D://, etc.)
        2. fecha (línea 7): cambie a la carpeta que contiene los archivos de la sesión de imágenes. Esto se conoce como 'Nombre de carpeta de experimento' en el archivo de seguimiento CSV (consulte las instrucciones).
        3. trackingFile (línea 11): cambie a la ruta de acceso al archivo CSV en el que se almacena la información del experimento.
        4. z (línea 13): Establezca como el número de planos z.
        5. nT (línea14): Establezca como el número de puntos de tiempo.
        6. nPozos (línea 19): Establecer como el número de pozos utilizados.
        7. pointVisits (línea 20): Establecer como el número máximo de visitas de puntos (por pozo).
        8. En la línea 10 busque la ubicación actualmente ocupada por 'CV1000/' e introduzca la carpeta externa utilizada en la ruta de archivo. Para evitar problemas, utilice la siguiente convención: 'XXXXXXX/'.
        9. En la línea 12, introduzca una ruta de acceso de archivo válida para almacenar datos de relación de aspecto para los datos recortados.
        10. En las líneas 15, 16, 17 y 18 entrada Verdadero/Falso para si las imágenes pasan por el siguiente procesamiento:
          1. Introduzca True o False para la corrección de deriva en la línea 15.
          2. Introduzca True o False para restar fondo en la línea 16. El tamaño de la entidad debe determinarse empíricamente para diferentes deformaciones unitarias de marcador y tamaños de píxel. En la configuración aquí, el tamaño de la entidad se definió como 41 para la cepa Germ-Layer y 201 para la cepa Morphogenesis. La resta de fondo debe realizarse junto con la corrección de la atenuación.
          3. Introduzca True o False para la corrección de atenuación en la línea 17.
          4. Entrada True o False para rotación posterior anterior en la línea 18.
    5. Una vez que se han realizado todos los cambios, el recorte puede comenzar. Para ello, cambie a screenCrop.py y seleccione el icono de reproducción en la barra de herramientas, en el menú desplegable seleccione Ejecutar como > Ejecutar Python.
    6. Como el recorte puede tardar varias horas en completarse para un conjunto de datos grande (50 puntos visitan pasos de 18 z, 3 canales, 31 puntos de tiempo), realizar un seguimiento del progreso del recorte en la ventana de la consola. Una vez completado el recorte, una pequeña ventana mostrará vistas previas de las imágenes recortadas antes de guardarlas. Para cada imagen hay 3 opciones:
      1. Guardar: Pulse barra espaciadora para guardar la imagen si la imagen se recorta correctamente sin que se corten áreas de interés.
      2. X: Pulse X si la imagen parece tener áreas de interés cortadas; la imagen se guardará con una X delante del nombre para separarla de las otras imágenes.
      3. Borrar: Pulse D para eliminar la imagen recortada si la imagen no está recortada correctamente o si el embrión no es satisfactorio.
        NOTA: Las imágenes se guardarán en una subcarpeta denominada "Cropped" en la carpeta de carga (definida en la línea 9 del programa).

4. Visualización (Figura 4)

NOTA: OpenandCombine_embsV2.ijm10,12 es una macro ImageJ que construirá un archivo tiff fácil de ver a partir de todas las imágenes para una tensión y condición específicas. Se requiere la instalación de FIJI/ImageJ14,15. Esta macro se ejecuta de acuerdo con nuestra estructura de archivos; tendrá que ser modificado para trabajar con otras estructuras de archivos. Puede encontrar una guía para la estructura de archivos adecuada y una descripción detallada de las consideraciones importantes al final del archivo GUI_Instructions_zenodo_repoV2.docx en el repositorioZenodo. Lea estas instrucciones completamente antes de crear imágenes para nombrar y estructurar correctamente los archivos para interactuar mejor con esta macro. Como referencia, nuestra estructura de ubicación de archivos tiene este aspecto:
Z:'recortar''Destino', 'Strain', 'Emb', 'Target_Emb', '15' identificador único de dígitos _W'#F'_T', #_Z, #_C.tif
es decir, Z:-recortar-EMBD0001-GLS-Emb1-EMBD0001_Emb1_20140327T135219_W02F1_T01_Z01_C1.tif

  1. Descargue OpenandCombine_embsV2 y GUI_Instructions_zenodo_repoV2.docx desde Zenodo (https://zenodo.org/record/3235681#.XPAnn4hKg2w).
  2. Prepare la siguiente información:
    -La ubicación donde se almacenan las carpetas de imagen (después del recorte).
    -Los nombres de la carpeta de imagen para las condiciones específicas que se van a procesar (es decir, EMBD0002). Esto se conoce como "Objetivo" en el ejemplo anterior
    -Un identificador único alfanumérico de 15 dígitos que es específico de un experimento nocturno determinado: este identificador es el nombre de la carpeta de adquisición de datos (es decir, 20140402T140154) y el identificador único se incrusta en el nombre de archivo tiff individual (EMBD0002_Emb1_ 20140402T140154_W06F2_T01_Z01_C1) por cada embrión que se doy a la imagen de ese día. La macro utiliza este identificador para comprobar si hay embriones adquiridos en la misma fecha y puede ensamblar condiciones repetidas, con fechas separadas, en archivos ImageJ separados.
  3. Abra ImageJ y arrastre y suelte el archivo de macro, OpenandCombine_embsV2.ijm, en la barra ImageJ o abra la macro directamente.
  4. Una vez abierta la macro, localice las líneas 3 y 4. Introduzca la información recopilada (sección 4.2) de acuerdo con los siguientes pasos:
    1. En la línea 3 (RNAL), introduzca el nombre de destino de las imágenes que se van a procesar. Introduzca cada destino en la siguiente estructura newArray("XXXXXXXX/"); incluir citas. Para ejecutar varias condiciones a la vez, separe con una coma y mantenga todos los nombres de destino dentro del paréntesis (es decir, newArray("EMBD0000/","EMBD0001/","EMBD0002/").
    2. En la línea 4 (fecha), introduzca el identificador único alfanumérico de 15 dígitos entre comillas, por ejemplo newArray("20140402T140154").
  5. Pulse Ejecutar en la parte inferior izquierda de la ventana de macro. Aparecerá una ventana, que iniciará un mensaje para navegar a la carpeta externa que contiene las carpetas de imágenes recortadas (especificadas en 4.4.1).
  6. Una vez seleccionada, aparecerá otra ventana, que permitirá la especificación de los parámetros de imagen.
    1. Introduzca el número de canales, el número de sectores Z, el tamaño de fuente del texto utilizado para etiquetar las imágenes compiladas y el color de cada uno de los canales.
    2. Compruebe/desactive el contraste automático en todos los canales.
  7. Una vez especificados todos los parámetros, haga clic en Aceptar en la parte inferior de la ventana. El archivo compuesto comenzará a ensamblarse; esto tomará varios minutos, por condición, para completar.
  8. Una vez completado, revise los archivos que se dejan abiertos si lo desea. Se pueden cerrar sin guardar, ya que la macro ya ha guardado los archivos en una carpeta recién creada que se nombra de la siguiente manera: nombre de carpeta externa (especificado en la solicitud de la sección 4.5) + "-fiji-processed-output" (es decir, Z: recortado-fiji-processed-output-EMBD0002_GLS_20140402T140154.tif).

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Representative Results

Un desafío significativo en la caracterización del efecto de las perturbaciones moleculares en el desarrollo embrionario de C. elegans es que los embriones tardan alrededor de 10 horas en progresar desde la primera escisión hasta el final del alargamiento a 20o16. Un método de semi-alto rendimiento en el que se pueden tomar imágenes simultáneas de grandes cohortes de embriones es útil para eventos en este escala temporal porque permite la toma de imágenes de múltiples condiciones en paralelo con un tamaño de conjunto suficiente para cada condición para permitir análisis cuantitativo(Figura 1A).

Método de imagen de rendimiento semi-alto y cepas multimarcadores
El método de imagen de semi-alto rendimiento descrito aquí (esbozado en la Figura 1B),emplea una placa inferior de vidrio de 384 pocillos; el formato multipozo permite establecer hasta 14 condiciones en paralelo y el pequeño tamaño de los pozos restringe el área de búsqueda, simplificando la identificación de campos que contienen embriones para imágenes de alta resolución. Aquí, se utilizó una caja de escáner confocal, equipada con un disco giratorio Nipkow doble mejorado con microlens, una cámara EM-CCD de 512 x 512, una etapa automática XY de alta precisión (resolución designada 0,1 m) y un control motorizado del eje z (resolución designada 0,1 m). Sin embargo, el protocolo se puede adaptar para cualquier microscopio confocal con capacidades de observación puntual de precisión y un adaptador de etapa que puede acomodar una placa de varios pocillos. Un desafío significativo en el desarrollo de este método fue idear un medio para generar una placa de embriones en la misma etapa de desarrollo para que la totalidad del desarrollo pueda ser capturado para todos los embriones en cada campo. Esto es un desafío porque los embriones dispuestos en la placa de imágenes continuarán desarrollándose mientras se diseccionan muestras posteriores, lo que resulta en un gradiente de puesta en escena a través de los pozos. Para evitar este problema, se seleccionan embriones en etapa temprana (etapa de 2-8 células) y mantienen los medios de disección y la placa de imágenes en hielo; esto detiene la embriogénesis de los embriones diseccionados hasta que todas las condiciones se hayan organizado sin afectar significativamente a la viabilidad embrionaria10. Para limitar el tiempo que los embriones se sentan en hielo a 1 hora, dos investigadores realizan las disecciones simultáneamente, lo que permite la configuración de 14 condiciones diferentes en unos 50 minutos. Después de la disección, la placa se hila a 600 x g durante 1 min para sedimentar los embriones y pozos se escanean previamente con bajo aumento para localizar campos con grupos de embriones adecuados para imágenes de alto aumento; puntos de visita están marcados. Los embriones se filman en una habitación con temperatura controlada durante la noche utilizando una lente de inmersión en aceite de 60x 1.35 NA. Las muestras se configuran en una región de pozo 4 por 4 pozos para que la superficie de la placa que se utiliza en un experimento sea comparable a un cubreobjetos estándar de 22 x 22 mm2, lo que permite el uso de un objetivo de aceite de 60x. La propagación uniforme del petróleo en esta región antes del inicio de la toma de imágenes es fundamental para la adquisición exitosa de imágenes a largo plazo. Los embriones en desarrollo se utilizan en una solución que contiene anestesia; esto asegura que cuando los embriones más viejos dentro de la eclosión del pozo, su movimiento no interrumpa la posición de los embriones más jóvenes adyacentes que están siendo imágenes. Debido a la naturaleza impenetrable de la cáscara de huevo, el anestésico no afecta el movimiento antes de la eclosión. En estas condiciones, los datos de lapso de tiempo 3D se recopilan en 3 canales para un total de 80-100 embriones en un solo experimento nocturno (discutido más abajo).

El desarrollo embrionario de C. elegans se produce en dos fases. En primer lugar, 10 rondas de división celular acopladas a la especificación de destino celular generan las tres capas de gérmenes (ectodermo, mesodermo y endoderm) durante un período de 6 horas17. En las siguientes 7 h, los eventos morfogenéticos impulsan la formación de tejidos diferenciados8,16. Para capturar estos dos aspectos del desarrollo, construimos un par de cepas personalizadas, las cepas Germ Layer y Morphogenesis10 (Figura 2A),y utilizamos el protocolo de rendimiento semi-alto para tomar imágenes de embriones de ambas cepas. La cepa De capa germinal expresa proteínas fluorescentes codificadas por transgenes que marcan núcleos en el ectodermo, mesodermo y endodermo en rojo, amarillo y verde. Esta cepa contiene tres transgenes reportero: (1) un transgén que expresa PHA-4::GFP que marca núcleos en el intestino y la faringe (endoderm verde)10,18,19, (2) un transgén que expresa un transgén que expresa un mCherry-histone fusión en la epidermis y en el número 1/3 de las neuronas (ectodermo rojo; Figura 2A) y (3) un transgén que expresa simultáneamente las histonas etiquetadas con mCherry y GFP en el músculo de la pared corporal (mesodermo amarillo). La cepa Morphogenesis tiene dos transgenes que expresan: (1) un marcador de unión epitelial verde (DLG-1::GFP) en la epidermis, y (2) un marcador de membrana plasmática con etiqueta mCherry, en el número 1/3 de las neuronas (Promotor Pcnd-1; Figura 2A). Para mejorar la eficacia del ARNi, ambas cepas también fueron diseñadas para contener un par de mutaciones sensibilizantes de ARAi (nre-1(hd20) lin-15b(hd126)20. Estos fueron construidos con el objetivo de realizar una pantalla a gran escala basada en el ARNi de los genes de 2.000 cénticos necesarios para el desarrollo embrionario. Sin embargo, este par de cepas también constituirá una plataforma estandarizada ampliamente útil para evaluar defectos de desarrollo en mutantes, y para análisis más detallados de las funciones de las diferentes proteínas en el desarrollo.

Para la recopilación de datos en este formato de rendimiento semi-alto, con estas cepas, se recogen las series z de campo verde, rojo y de campo brillante (intervalos de 18 x 2m2), cada 20 min, durante un período de 10 h en una habitación de temperatura controlada de 16 oC; esto mantiene el microscopio entre 21-23 oC durante la carrera. El intervalo de tiempo de 20 minutos nos permite crear 50 campos de embriones (visitas puntuales) por experimento. Los usuarios pueden adaptar las adquisiciones a intervalos más cortos con menos visitas de puntos, o intervalos más largos con más visitas de puntos para adaptarse mejor a sus objetivos experimentales. Para estas cepas, los primeros puntos de tiempo de desarrollo no se muestran porque los reporteros específicos del tejido que conducen la expresión del marcador no comienzan a expresarse hasta la gastralación media a tardía. Durante esta fase temprana, los pozos se escanearon con bajo aumento (10x) y se seleccionaron campos para imágenes de alto aumento. Se recomienda seleccionar campos que contengan más de un embrión en etapa temprana, pero evitar los campos donde los embriones se superponen parcialmente, están demasiado concurridos o se encuentran en el extremo del pozo. Después de la toma de imágenes 60x durante la noche, se realiza una exploración de pozo entero de bajo aumento (10x) para determinar si los embriones eclosionan con apariencia normal (WT), eclosionan con anomalías visibles (anormales larvales) o son letales embrionarios para cada condición evaluada ( Figura 1B). Este paso sirve como una alternativa fácil a la instalación de placas en paralelo para evaluar la letalidad en una población más grande; todo el pozo 10x post-escaneo proporciona datos de letalidad embrionaria en 50-80 embriones por condición. El uso de esta medida para comparar los datos de letalidad embrionaria de la población para los controles entre corridas es un control útil que garantiza la coherencia con respecto a la salud de las cepas y las condiciones ambientales y los pasos de procesamiento. Cuando se muestran en combinación, las dos cepas de reportero personalizadas proporcionan lecturas informativas para la mayoría de los principales eventos de desarrollo, incluyendo especificación del destino celular, intercalación dorsal, recinto epidérmico, alargamiento y neurogénesis (representante las imágenes de control se muestran en la Figura 2B, véase también Wang et al.10).

Procesamiento de datos: cultivo y orientación automatizados de embriones
Con nuestro protocolo de imágenes, cada campo de imágenes de alta resolución contiene entre 1 y 5 embriones; estos embriones están orientados aleatoriamente y con frecuencia se colocan inmediatamente adyacentes entre sí. Los datos recopilados mediante técnicas convencionales de montaje embrionario sufren de los mismos desafíos. Para preparar los datos para su posterior visualización y análisis, se necesita una manipulación práctica considerable para recortar y orientar las secuencias embrionarias, así como para preprocesarlas para restar fondo, corregir la deriva y compensar la atenuación de la señal con profundidad. Para agilizar este proceso, se creó un programa de recorte de embriones personalizado que aísla y orienta cada embrión del campo más amplio(Figura 1C, Figura 3). Este programa ha sido empaquetado como un programa fácil de usar e independiente con interfaz gráfica de usuario (GUI, compatible con datos de la mayoría de las plataformas de imágenes) que puede tomar en una secuencia de lapso de tiempo 3D de un campo de embriones, y procesarlo en series tiff individuales para cada embrión en el campo(Figura 3B, disponible en https://zenodo.org/record/3235681#.XPAnn4hKg2w)10,12. El código fuente de Python para la GUI (embryoCropUI.py) y una versión por lotes de este programa (screenCrop.py) también están disponibles para usuarios experimentados de Python en GitHub (https://github.com/renatkh/embryo_crop.git)10,13. La funcionalidad principal de este programa es localizar, recortar y orientar el embrión a lo largo del eje anterior-posterior. Simultáneamente, la resta de fondo, la corrección de atenuación y la corrección de deriva se pueden realizar en el conjunto de datos mediante la configuración ajustable opcional.

En resumen, el software automatizado de recorte detecta iterativamente embriones individuales en una máscara binaria obtenida a partir de las imágenes de campo brillante y recorta secuencialmente los embriones de todos los canales y orienta las imágenes a lo largo del eje anterior-posterior(Figura 3 B, descrito por primera vez en Wang et al.10). Antes del recorte, el software corrige la deriva, resta fondo y realiza la corrección de atenuación de profundidad en cada canal de fluorescencia (opcional). Para obtener la máscara binaria, el software aplica la detección de bordes Canny21 a las imágenes de campo brillante, realiza la proyección de máxima intensidad de los tres planos centrales y rellena pequeños agujeros. El algoritmo detecta embriones individuales ajustando un óvalo Cassini a una sección del contorno de la máscara binaria (véase la figura 3B, 3C). Después de alinear el óvalo a lo largo de su eje principal, el software mide la intensidad de la fluorescencia roja en cada mitad del embrión aislado y gira el embrión de tal manera que la intensidad roja está orientada hacia la izquierda, lo que pone el embrión anterior a la izquierda para ambos cepas de reportero utilizadas en este trabajo(Figura 3D). El pilotaje de este software reveló que la mayoría de los embriones fueron recortados eficientemente según lo previsto. Los problemas de diagnóstico por imágenes menores, como la deriva de embriones, la pérdida temporal del plano focal (debido a burbujas en el aceite) o los campos concurridos de embriones no suelen interrumpir el cultivo exitoso. Sin embargo, para los campos en los que había grandes grupos de embriones (que se superponían un poco en z), los embriones que estaban significativamente inclinados dentro del plano de imagen (en Z), la pérdida de plano focal a largo plazo, o los embriones que estaban parcialmente cortados, el cultivo exitoso no siempre fue Logrado. Estos problemas se pueden eludir fácilmente mediante una mejor selección de campos durante la fase de adquisición de datos. En general, los datos de preprocesamiento recopilados con este método de semi-alto rendimiento o utilizando métodos de montaje convencionales son un primer paso útil para visualizar y analizar conjuntos de datos embrionarios.

Validación de métodos de recopilación y procesamiento de datos de imágenes: visualizar el desarrollo embrionario tras el derribo de 40 genes descritos anteriormente
Para validar este método de recolección de imágenes de semi-alto rendimiento y el régimen de recorte personalizado, se realizó una pequeña pantalla RNAi en las cepas personalizadas, dirigidas contra 40 genes con funciones descritas anteriormente en la especificación del destino celular y la morfogénesis ( descrito por Wang, Ochoa, Khaliullin y sus colegas10,11). Para ello, se generó dsRNA contra cada objetivo, se inyectaron animales L4 de cada cepa, esperaron 20-24 h, y luego se diseccionaron e imágenon embriones utilizando el protocolo descrito anteriormente (para el conjunto de datos completo10,11). Lograr fenotipos de desarrollo por ARNi requiere inhibición de la expresión génica materna y cigoática. Los genes del desarrollo pueden expresarse maternalmente, con los productos proteicos resultantes cargados en los embriones, o expresados cigotáticamente en el embrión, o, en muchos casos, ambos10,22,23. El tiempo entre la inyección y la filmación de embriones es la variable crítica para atacar eficazmente las poblaciones expresadas maternal y ciéticamente; el tiempo determina tanto la cantidad de dsRNA inyectado que se carga en el embrión para prevenir la expresión cigotética24 como el grado de agotamiento de la proteína materna. Después de la inyección de dsRNA, el ARNm materno correspondiente al gen objetivo se degrada y no se recupera en un intervalo de tiempo relevante. El agotamiento de proteínas preexistente requiere la producción de embriones, que expulsa la proteína materna de los tejidos germinales cargándola en la formación de embriones. 20-24 h a 20oC es el menor tiempo de incubación que permite un agotamiento materno constante; el agotamiento materno mejora en momentos posteriores (es decir, 36-42 h después de la inyección). La cantidad de dsRNA inyectado que se carga en el embrión determina cuán efectiva será la prevención de la expresión génica cigotica. La cantidad de ARN cargado alcanza un máximo de 5-10 h después de la inyección, cuando los embriones con material inyectado se fertilizan primero, disminuyendo a partir de entonces. En nuestra experiencia, 24 h después de la inyección es un punto de tiempo óptimo, en el que el agotamiento de la proteína materna y la inhibición de la expresión génica cigota son eficaces. El análisis de fenotipos en las cepas de reporteros personalizados utilizadas en este trabajo, a través del conjunto de 40 genes de prueba, mostró que nuestro protocolo combinado produjo fenotipos de firma distintos y altamente reproducibles en un amplio espectro de genes involucrados en el destino celular especificación y morfogénesis (véase Wang et al.10); el conjunto de datos completo está disponible11). Como ejemplo de estos datos, las imágenes fijas de cuatro embriones diferentes para el control, pha-4(RNAi), pal-1(RNAi)y mex-3(RNAi) en la cepa del reportero de capa germinal se muestran en la Figura 4A. Para una discusión más completa de los fenotipos observados en la pantalla de ARNi de 40 genes, véase Wang etal.

Macro ImageJ: Recopilación y visualización de todos los datos para una condición determinada
La visualización de un gran número de embriones a partir de pilas de tiff individuales puede ser tediosa y llevar mucho tiempo para trabajar. De nuestro esfuerzo inicial, >400 embriones individuales fueron aislados usando el programa de cultivo automatizado personalizado descrito anteriormente. Para acelerar el análisis de primer paso, construimos una macro ImageJ, que genera una matriz de todos los embriones que se imaginan para una condición de ARN determinada en un fondo de cepa determinado(Figura 4B). Para cada embrión de la matriz, una imagen de campo brillante y una imagen de proyección de intensidad máxima se presentan en paralelo, para cada punto de tiempo, para generar un archivo de película compuesto. Aunque esta macro se ha escrito para funcionar con nuestra estructura de archivos, se puede editar para adaptarse a la estructura de archivos del usuario. Para obtener mejores resultados, sin embargo, los usuarios deben seguir las convenciones de nomenclatura y estructura de archivos establecidas en el protocolo (consulte archivos Léame de Zenodo o Github para obtener más detalles sobre las convenciones de nomenclatura de la aplicación Python e ImageJ). Para ver todos los datos procesados de ImageJ y obtener un análisis más detallado de los fenotipos observados para el conjunto de pruebas de 40 genes, consulte los datos depositados en la base de datos Dryad10,11. Este formato de visualización ImageJ permite una evaluación rápida del fenotipo general y su penetración, y facilita la marca de problemas de calidad de datos, como la presencia de escombros o la pérdida de plano focal. En general, la combinación del método de adquisición de datos de semi-alto rendimiento, el programa de recorte y la herramienta de visualización ImageJ, combinado con cepas de reporteros personalizadas, facilita en gran medida los esfuerzos a mayor escala para estudiar el desarrollo embrionario.

Figure 1
Figura 1. Descripción general del método de creación de imágenes de alto contenido, el procedimiento de procesamiento de datos y las herramientas esenciales. (A) Una comparación de las características del método estándar basado en almohadillas de agarosa para el montaje de embriones C. elegans con el enfoque de imágenes multipozo de semi-alto rendimiento descrito aquí. (B) Visión general del método de semi-alto rendimiento para el seguimiento del desarrollo embrionario. Consulte el texto para obtener más información. (C) Visión general de las herramientas de procesamiento y visualización de datos, que se pueden utilizar en los datos adquiridos mediante un procedimiento de montaje convencional basado en almohadillas de agarosa o el método basado en placas multipozoderlos de rendimiento semi-alto descrito en este documento. Una sola secuencia de embriones de lapso de tiempo de 3 canales de un campo (izquierda) o múltiples campos de 3 canales y 4 dimensiones de datos de embriones (derecha) se puede procesar utilizando el programa de recorte personalizado, que es compatible con los datos capturados en la mayoría de las plataformas de imágenes. La versión gráfica de la interfaz gráfica de usuario (GUI) del programa es fácil de usar y no requiere ninguna experiencia en programación. La aplicación screenCrop.py requiere experiencia en Python, pero ha agregado capacidades, es decir, que puede recortar en formato por lotes. La salida de este paso está estrechamente recortada, pilas de tiff de embrión orientados hacia el anterior-posterior. Para visualizar todos los datos de una sola condición, se creó una macro ImageJ que compila pilas de tiff recortadas y rotadas para mostrar una imagen de campo brillante y una proyección de intensidad máxima para cada embrión en cada punto de tiempo. (D) Panel muestra las herramientas esenciales necesarias para la disección y configuración del formato de imagen de semi-alto rendimiento. Algunos componentes de la figura se reproducen con el permiso de Wang et al.10. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2. Cepas personalizadas generadas para imágenes de alto contenido de la embriogénesis de C. elegans. (A) Los esquemas ilustran los transgenes utilizados para construir las cepas de capa germinal (arriba) y morfogénesis (abajo). (B) Los paneles de proyección de intensidad máxima muestran el curso de tiempo de desarrollo en las cepas Morphogenesis (arriba) y Germ Layer (abajo). Se muestra la vista ventral, como se muestra en los esquemas (izquierda). El tiempo es relativo a la etapa de coma (t a 0), que es fácilmente identificable en ambas cepas. Barra de escala a 10 m. Figura reproducida con permiso de Wang et al.10. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3. El programa de recorte personalizado aísla y orienta los embriones individuales de los campos de imágenes. (A) Schematic ilustra las características del programa de recorte de embriones personalizado y destaca las dos opciones para acceder a este programa: una interfaz GUI fácil de usar, que no requiere experiencia en programación y está disponible en Zenodo (izquierda) y una versión de recorte por lotes del programa, que requiere experiencia de Python y está disponible en Github (derecha). (B) Gráfico resume el algoritmo de recorte automatizado: una máscara binaria se genera a partir de imágenes de campo brillante de 8 bits y los embriones individuales se detectan, recortan y orientan a lo largo del eje anterior-posterior. La barra de escala es de 10 m.(C) Schematics detalla el procedimiento utilizado para detectar iterativamente embriones en la máscara binaria. (D) Schematic ilustra el método utilizado para orientar embriones a lo largo del eje anterior-posterior. Paneles B-D reproducidos con permiso de Wang et al.10. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4. La macro ImageJ personalizada permite la visualización de datos de cribado de RNAi mediante la generación de archivos compuestos para cada condición. (A) Se muestran los embriones para tres condiciones de ARNi de ejemplo del conjunto de pruebas de 40 genes (véase Wang et al.10,11 para el conjunto de datos completo) que resaltan los fenotipos de firma distintos que se obtienen para cada uno reacondicion y la reproducibilidad de los fenotipos dentro de cada condición. Panel fue adaptado con permiso de Wang et al.10. (B) Panel ilustra cómo la macro ImageJ personalizada (OpenandCombine_embsV2.ijm) matriz embriones de una condición RNAi dada en un archivo ImageJ compuesto que matriz el campo brillante y proyecciones de intensidad máxima para cada embrión en cada punto de tiempo. Aunque solo se resalta un ejemplo, esta macro puede compilar los datos para muchas condiciones de ARNi a la vez. La macro ImageJ está disponible en Zenodo12. Barra de escala a 10 m. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Este trabajo describe un conjunto de herramientas y métodos que se desarrollaron para permitir esfuerzos a mayor escala para perfilar la función de los genes en el desarrollo embrionario en C. elegans. Nuestro método de semi-alto rendimiento permite imágenes de lapso de tiempo 3D del desarrollo embrionario a una resolución de 20 minutos para 80-100 embriones en un solo experimento. Si bien este protocolo se puede adaptar para su uso con cualquier cepa de marcador deseada, este trabajo demuestra el potencial del método utilizando dos cepas personalizadas desarrolladas para monitorear eventos durante la embriogénesis: (1) una cepa de reportero de capa germinal, en la que el tejido específico los promotores impulsan la expresión de histonas fluorescentes para marcar los núcleos de endoderm, mesoderm y ectoderm, y (2) una cepa de reportero de morfogénesis, que utiliza promotores epidérmicos y neuronales para impulsar la expresión de marcadores fluorescentes en las uniones celulares y la membrana plasmática. Al tomar imágenes de las dos cepas, las consecuencias de las perturbaciones moleculares en la especificación del destino celular y los eventos morfogenéticos pueden capturarse con notable detalle. Para hacer frente a los desafíos que presenta la cantidad de datos generados por este método, se desarrollaron herramientas personalizadas con el fin de agilizar el procesamiento y la visualización de datos. La primera herramienta refuerza embriones individuales de un campo de embriones en secuencias de lapso de tiempo 3D, al mismo tiempo que rota los embriones a una orientación anterior-posterior estándar y realiza la resta de fondo, la corrección de la deriva y la corrección de la atenuación. Este programa fue empaquetado como una INTERFAz gráfica de usuario fácil de usar (https://zenodo.org/record/3235681#.XPAnn4hKg2w) y el código fuente y una versión de procesamiento por lotes más avanzada del programa para usuarios expertos en Python (github.com/renatkh/embryo_crop.git) se proporciona10,12,13. Por último, para visualizar estos datos procesados en un formato significativo, se ideó una macro ImageJ; esto permite al usuario visualizar todos los embriones de una condición de ARNi dada en una película multipanelada, que muestra un campo brillante y la máxima proyección de intensidad para cada embrión en cada punto de tiempo. Juntos, las cepas, el protocolo y las herramientas de procesamiento de datos, hacen esfuerzos para estudiar la embriogénesis de C. elegans a gran escala, un esfuerzo más factible.

Aunque es sencillo de implementar en general, el método de adquisición de rendimiento semi-alto descrito aquí requiere atención a algunos detalles críticos, que se describen a continuación. En primer lugar, los usuarios deben tener acceso a un microscopio confocal con capacidad de visita puntual de precisión que se puede equipar con un soporte de placa de varios pocillos. La consideración más crítica para este protocolo es que el microscopio se mantenga en una sala de temperatura controlada. Mientras que muchos microscopios tienen la capacidad de calentar, la mayoría no puede enfriarse de forma fiable, por lo que la temperatura ambiental tiene que adaptarse para mantener una temperatura constante y amigable con C. elegans. Para lograrlo, la sala de imágenes se mantiene a 16oC. El área de la muestra del instrumento se calienta hasta 21-23 oC durante la toma de imágenes. Las fluctuaciones en la temperatura ambiente pueden afectar el tiempo de desarrollo y alterar sutilmente la precisión del plano focal durante la visita al punto y deben evitarse tanto como sea posible. Tenga en cuenta que correr a temperaturas superiores a 23 oC puede dar lugar a un considerable aumento de la letalidad embrionaria para condiciones de control y no es aconsejable. Otra consideración clave es la selección y dispersión de embriones durante la disección. Se debe tener cuidado de evitar la transferencia de embriones mayores a los pozos de imágenes, ya que, al incubar, los animales tienden a descuidar los embriones adyacentes; la incidencia de esto se ve disminuyeda por la inclusión de anestesia en los medios de comunicación. La dispersión de embriones, para evitar grandes grupos de embriones, también es una variable crítica. La acumulación tiende a ocurrir cuando los embriones se transfieren a los pozos en pipetas capilares que están demasiado delgadamente extraídas, o cuando los embriones no están suficientemente dispersos durante la disección. Otra consideración es que la selección de puntos y el ajuste del plano focal lleva tiempo. La placa no se mantiene en hielo durante este proceso, por lo que los embriones comienzan a desarrollarse inmediatamente. Para las deformaciones de marcador estimos en este estudio, hay una ventana de aproximadamente 90 minutos después de que la placa se retira del hielo para lograr el escaneo de la placa y la selección de puntos antes de que los marcadores comiencen a expresarse. Este es el tiempo suficiente para configurar nuestro instrumento con estas cepas, pero otros microscopios y cepas pueden ofrecer desafíos de tiempo adicionales que requerirán solución de problemas. Por último, el método que describimos emplea un objetivo de aceite de 60x para recoger pilas z de 50 campos a intervalos de tiempo de 20 minutos. Como resaltamos, la resolución temporal se puede aumentar disminuyendo el número de campos de la imagen. Por ejemplo, se pueden crear 10 campos con una resolución de tiempo de 4 minutos. Una segunda alternativa para aumentar la resolución temporal es utilizar un aumento más bajo, objetivo de apertura numérica alta; en este caso, el campo de visión más grande permite la toma de imágenes de un gran número de embriones con una resolución de tiempo más alta con sólo una reducción moderada en la resolución espacial.

Para permitir el procesamiento y la visualización de datos a mayor escala, creamos herramientas personalizadas y las hemos hecho disponibles gratuitamente. La herramienta más útil es la INTERFAz gráfica de usuario de recorte personalizada, que no requiere experiencia en programación para operar. La GUI se puede utilizar para recortar y orientar embriones en todas las etapas de desarrollo y es compatible con todos los marcadores, por lo que es útil no sólo para los biólogos del desarrollo, sino también para los investigadores que estudian los procesos en el embrión temprano. Debido a que la salida de la GUI es precisamente recortada, orientada, escalada, datos corregidos a la deriva, los datos se pueden canalizar fácilmente en una canalización de análisis automatizado, haciendo que esta herramienta sea útil para el análisis de datos pasados y futuros; si se utilizan las deformaciones unitarias adecuadas, los archivos de datos resultantes se pueden utilizar como entrada para los regímenes de análisis automatizado existentes, como las herramientas de alineación de embriogénesis25. Para utilizar el programa, es importante que los usuarios sean conscientes de que el algoritmo de recorte requiere que se recopile una imagen de campo brillante o DIC para cada paso y punto de tiempo. Además, los usuarios deben tener en cuenta que el algoritmo de orientación anterior-posterior está estructurado en función de la distribución de la señal roja en el reportero de capa germinal y las cepas de informe de morfogénesis, que se muestran en este trabajo. Por lo tanto, la precisión de la orientación AP en otras deformaciones de marcador tendrá que evaluarse caso por caso. La GUI ha sido probada con datos recopilados en tres plataformas de imágenes confocales diferentes y es compatible en todos los ámbitos para pilas multi-tiff y series tiff. Además de la versión fácil de usar, el código fuente para la GUI y una versión por lotes de este programa también se ha puesto a disposición, con la salvedad de que se requiere experiencia de programación, y las estructuras de archivos y las convenciones de nomenclatura tendrán que ser seguidas. Por último, se construyó una macro de procesamiento ImageJ para tomar pilas de imágenes sin procesar para todos los embriones, en cada condición de ARNi, y compilar una matriz informativa para mostrar todos los embriones para esa condición en el campo brillante y la proyección de intensidad máxima de fluorescencia en cada punto de tiempo. Esta herramienta se puede adaptar a las especificaciones del usuario y es una macro útil para facilitar la exploración de datos y la evaluación del control de calidad.

Juntos, el método de filmación de semi-alto rendimiento junto con las herramientas de recorte de embriones y procesamiento de imágenes descritas en este documento facilitarán el análisis del desarrollo embrionario de C. elegans utilizando una variedad de mutantes, perturbaciones y cepas de marcadores. En nuestro propio laboratorio, actualmente está en marcha una pantalla a gran escala que emplea estos métodos para filmar embriones a partir de las dos cepas de ingeniería personalizada descritas aquí después de derribar los 2.000 genes necesarios para el desarrollo. Por último, los datos de este esfuerzo servirán como un recurso adicional para mejorar los esfuerzos para entender la especificación del destino celular y los eventos morfogenéticos durante la embriogénesis.

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Disclosures

Ninguno

Acknowledgments

S.D.O. fue apoyado por el Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales patrocinado por la Universidad de California San Diego Institucional De investigación y el Premio de Desarrollo Académico de Carrera (NIH/IRACDA K12 GM068524). A.D. y K.O. contaron con el apoyo del Instituto Ludwig para la Investigación del Cáncer, que también les proporcionó fondos de investigación utilizados para apoyar este trabajo. Estamos agradecidos a Andrew Chisholm por su consejo en las primeras fases de este proyecto, Ronald Biggs por las contribuciones a este proyecto después de la fase inicial de desarrollo del método, y Dave Jenkins y Andy Shiau por el apoyo y el acceso a la molécula de descubrimiento pequeño sistema de imágenes de alto contenido del grupo.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Aspirator Tube Assembly Drummond Scientific 2-000-000
Calibrated Pipette (25 mL) Drummond Scientific 2-000-025
Cell Voyager Software Yokogawa Electric Corp Included with CV1000
Conical Tube (15 mL) USA Scientific 1475-0501
CV1000 Microscope Yokogawa Electric Corp CV1000
Depression slide (3-well) Erie Scientific 1520-006
Dissection Microscope Nikon SMZ-645
Eppendorf Centrifuge 5810R Eppendorf 5811 07336
ImageJ/FIJI Open Source https://imagej.net/Fiji
M9 Buffer Lab Prepared https://openwetware.org/wiki/M9_salts
Microcentrifuge Tube (1.5 mL) USA Scientific 1615-5500
Microseal F-foil Seal Bio-Rad MSF1001
NGM Plates Lab Prepared http://www.wormbook.org/chapters/www_strainmaintain/strainmaintain.html#d0e214
Scalpel #15 Bard Parker REF 371615
Sensoplate Plus, 384 Well, F-bottom, Glass Bottom Greiner Bio-One 781855
Tetramisole Hydrochloride Sigma Aldirch T1512-10G
Tweezers, Dumont #3 Electron Microscopy Sciences 0109-3-PO
U-PlanApo objective (10× 0.4 NA) Olympus 1-U2B823
U-PlanApo objective (60× 1.35 NA) Olympus 1-U2B832

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Biología del desarrollo Número 152 C. elegans,embrión imágenes de alto contenido embriogénesis procesamiento de imágenes visualización de datos desarrollo desarrollo embrionario semi-alto rendimiento
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