Geração de organóides endometriais primários humanos multicelulares

Resumo

Um protocolo para gerar os organóides endometrial preliminares humanos que consistem em pilhas epithelial e stromal e retêm características do tecido endometrial nativo é apresentado. Este protocolo descreve métodos da aquisição uterine do tecido ao processamento histologic de organoids endometrial.

Resumo

O endométrio humano é um dos tecidos mais responsivos hormonalmente no corpo e é essencial para o estabelecimento da gravidez. Este tecido também pode tornar-se doente e causar morbidade e até mesmo a morte. Os sistemas modelo para estudar a biologia endometrial humana foram limitados aos sistemas in vitro da cultura de únicos tipos da pilha. Além disso, as células epiteliais, um dos principais tipos de células do endométrio, não se propagam bem ou mantêm suas características fisiológicas na cultura e, portanto, nossa compreensão da biologia endometrial permanece limitada. Nós geramos, pela primeira vez, os organóides endometrial que consistem em pilhas epithelial e stromal do endométrio humano. Estes organóides não exigem nenhuns materiais exógenos do andaime e organizam-se especificamente de modo que as pilhas epithelial engloquem a estrutura spheroid-like e se tornem polarizada com as pilhas stromal no centro que produzem e secretam o colagénio. Os receptores de estrogênio, progesterona e andrógeno são expressos nas células epiteliais e estromais e tratamento com níveis fisiológicos de estrogênio e testosterona promovem a organização dos organóides. Este novo modelo de sistema pode ser usado para estudar a biologia endometrial normal e doença de maneiras que não eram possíveis antes.

Introdução

O endométrio humano alinha a cavidade uterine e sere como o primeiro contato para o embrião durante a implantação. O endométrio é composto de células epiteliais luminais e glandulares, fibroblastos estromais favoráveis, células endoteliais e células imunes. Juntos, esses tipos de células compõem o tecido endometrial, que é um dos tecidos mais responsivos aos hormônios esteróides sexuais¹. As mudanças que ocorrem durante cada ciclo menstrual são impressionantes. O crescimento e a remodelação apropriados do endométrio são exigidos para permitir que a implantação do embrião ocorra. A resposta aberrante ao estrogênio e progesterona pode resultar em....

Protocolo

Amostras endometriais foram coletadas de mulheres na pré-menopausa submetidas à histerectomia de rotina para condições uterinas benignas no hospital das mulheres da Universidade do noroeste, de acordo com protocolo aprovado pelo Conselho de revisão institucional. O consentimento por escrito foi obtido de todas as mulheres incluídas no estudo.

1. preparação de moldes de agarose

1. Antes do início da célula de isolamento, elenco e equilibrar 1,5% agarose micro moldes (tabela de materiais) para abrigar os organóides de acordo com as instruções do fabricante.

2. geração de Organoides endom....

Resultados

Um esquema do protocolo é representado na Figura 1. O tecido uterine foi obtido da cirurgia depois que foi examinado por patologistas. O forro endometrial foi separado do miométrio raspando e o tecido endometrial foi digerido enzimaticamente às pilhas como esboçado no protocolo. As pilhas epithelial e stromal foram adicionadas em micropoços nos moldes do agarose. Após 7 dias na cultura, os organóides foram tratados com o e e o T por uns 7 − 14 dias adicionais.

Par.......

Discussão

Nós geramos os organóides endometrial humanos compreendidos das pilhas epithelial e stromal do endométrio sem o uso de materiais exógenos do andaime. Embora já tenha sido demonstrado que as células epiteliais do endométrio primário podem formar organóides^{6,7, essas}células foram encaixadas em uma matriz gelatinosa de proteínas secretadas por células de sarcoma de camundongo (ver tabela de materiais) para ajudar forma spheroid-como estruturas. Além.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Agarose HS, grau de biologia molecular	Denville Scientific	CA3510-6
Moldes de agarose	Sigma-Aldrich	Z764043	(https://www.microtissues.com/)
Cloreto de amônio (NH4< / sub>Cl)	Amresco	0621
β-Estradiol	Sigma-Aldrich	E2257
Colagenase, Tipo II, pó	Thermo Fisher Scientific	17101015
Dispase	Corning	354235
DNase I	Sigma-Aldrich	D4513
EDTA	Fisher Scientific	BP120-1
Eosin Stain	VWR	95057-848
Receptor de estrogênio (SP1), anticorpo monoclonal de coelho	Thermo Fisher Scientific	RM-9101-S
Fluoroshield com DAPI, meio de montagem histológica	Sigma-Aldrich	F6057
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)	Corning	21-022-CV	1x sem cálcio, magnésio e fenol vermelho
Solução de mancha de hematoxilina	Thermo Fisher Scientific	3530-32	Formulação Harris modificada,
solução de heparina	STEMCELL Technologies	07980	adicionado ao meio MammoCult
Solução estoque de hidrocortisona	STEMCELL Technologies	07925	adicionado ao meio MammoCult
Meio organoide - Mammocult	STEMCELL Technologies	05620	suplementado com 2 µ L/mL de heparina e 5 µ L/mL de hidrocortisona
Paraformaldeído, solução a 16%	Microscopia Eletrônica Sciences	15710
Penicilina-Estreptomicina	Thermo Fisher Scientific	15140122
Solução salina tamponada com fosfato, pH 7,4	Sigma-Aldrich	P3813
, PgR 1294, não conjugado, sobrenadante de cultura	Agilent Technologies	M356801-2
matriz proteica - Matrigel	BD Biosciences	356231
Anticorpo anti-E-caderina de camundongo purificado	BD Biociences	610181	Clone 36
Anticorpo anti-vimentina recombinante [EPR3776]	Abcam	ab92547
	Zymo Research	R2060
Bicarbonato de sódio (NaHCO3)	Sigma-Aldrich	S6014
Testosterona	Sigma-Aldrich	86500
Mancha Tricrômica	Abcam	ab150686
Filme de cera - Parafilm	VWR	52858-000

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