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Artigo de método

Transplante de células epiteliais mamárias no Bloco de Gordura Branca Interscapular

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DOI:

10.3791/60401

⸱

4 de março de 2020

 ,  ,  , 
1Department of Pathology and Laboratory Medicine, Medical University of South Carolina, 2Department of Oncology, McArdle Laboratory for Cancer Research, University of Wisconsin-Madison School of Medicine and Public Health

Neste artigo

Resumo

Este artigo descreve um método de transplante para enxertar células epiteliais mamárias doadoras na almofada de gordura branca interscapular de animais receptores. Este método pode ser usado para examinar os efeitos do hospedeiro e/ou doador no desenvolvimento do epitélio mamário e elimina a necessidade de pré-compensação, estendendo assim a utilidade desta técnica.

Resumo

Já na década de 1970, pesquisadores transplantaram com sucesso células epiteliais mamárias na almofada de gordura branca interscapular de ratos. Enxerto de epitélio mamário usando técnicas de transplante aproveita o ambiente hormonal fornecido pelo hospedeiro adolescente roedor. Esses estudos são idealmente adequados para explorar o impacto de várias manipulações biológicas no desenvolvimento da glândula mamária e dissecam muitos aspectos da biologia da glândula mamária. Uma característica comum, mas limitante, é que as células epiteliais transplantadas são fortemente influenciadas pelo estroma circundante e superadas pelo epitélio endógeno; para utilizar tecido mamário nativo, a almofada de gordura branca abdominais deve ser liberada para remover o epitélio mamário hospedeiro antes do transplante. Um grande obstáculo ao usar o organismo modelo de rato é que limpar a árvore mamária em desenvolvimento em ratos pós-desacidos não é eficiente. Quando transplantadas em almofadas de gordura sem glândulas, as células epiteliais doadora podem repovoar o bloco de gordura de hospedeiro limpo e formar uma glândula mamária funcional. O bloco de gordura interscapular é um local alternativo para esses enxertos. Uma grande vantagem é que ele carece de estruturas ductais, mas fornece o estroma normal necessário para promover o crescimento epitelial e é facilmente acessível no rato. Outra grande vantagem dessa técnica é que ela é minimamente invasiva, pois elimina a necessidade de cauterizar e remover a crescente árvore mamária endógena. Além disso, a almofada de gordura interscapular contém um vaso sanguíneo medial que pode ser usado para separar locais para enxerto. Como as glândulas endógenas permanecem intactas, essa técnica também pode ser usada para estudos comparando a glândula mamária endógena à glândula transplantada. Este artigo descreve o método de transplante de células epiteliais mamárias na almofada de gordura branca interscapular de ratos.

Introdução

O desenvolvimento da glândula mamária pós-natal e a morfogênese ductal são processos em grande parte influenciados pela sinalização hormonal no início da puberdade. Em camundongos e ratos, comumente utilizados organismos modelo saem da biologia da glândula mamária, esse processo começa por volta de 3 semanas de idade, onde a rápida proliferação e diferenciação resultam na formação do parenchyma maduro. A glândula mamária madura pode passar por inúmeras rodadas de expansão e involução, uma propriedade que está investigação desde o início do séculoXX. No contexto de hiperproliferação e desenvolvimento do câncer, foramdesenvolvidastécnicas de transplante de glândulas mamárias na década de 1950 , e reforçadas pela metodologia quantitativa contribuída por Gould et al. em 19772,3,4. O refinamento da técnica de transplante em roedores tem contribuído para grandes avanços na compreensão da biologia da glândula mamária normal que ainda são amplamente utilizados para estudar o efeito de vários tratamentos e manipulação genética em estados normais de desenvolvimento de glândulas mamárias e doenças.

Muitas hipóteses foram geradas e posteriormente testadas usando transplante de glândula mamária, descrita pela primeira vez por DeOme et al. em 19591. Experimentos ao longo de várias décadas mostraram a propensão do tecido ductal excida das glândulas mamárias doadoras para repovoar todo o bloco de gordura5,6,7 e indicou que um componente crítico do desenvolvimento da glândula mamária reside nessas estruturas epiteliais. Estudos posteriores em camundongos mostraram que uma única célula-tronco mamária pode repovoar um bloco de gordura limpo e contribuiu para a descoberta de um único progenitor comum de células epiteliais mamárias basais e luminal8,9,10. De acordo com essas conclusões, foi sugerido que o transplante aumenta o pool de células com potencial multilineage-repopulando como resultado da plasticidade, permitindo que as células enxertadas cresçam uma glândula mamária funcional7,10,11,12,13. É importante ressaltar que o uso de técnicas de transplante em roedores supera as limitações das anormalidades induzidas pela cultura celular14 e muitas vezes fornece resultados em apenas uma questão de semanas.

Embora o procedimento tenha sido originalmente descrito no contexto de lesões pré-neoplásticas em camundongos, logo foi expandido para ratos e utilizado em conjunto com o tratamento cancerígeno para estabelecer a multiplicidade como medida de suscetibilidade do câncer15,mas a popularidade das técnicas de transplante tem acompanhado o desenvolvimento de ferramentas genéticas para cada espécie. Embora estudos de camundongos que incorporem o transplante tenham contribuído com muitos achados translacionais, o parenchyma da glândula mamária ratana se assemelha ao humano mais de perto16,17 e oferece vantagens distintas para estudar o câncer de mama receptor-positivo (ER+) de estrogênio. Os tumores mamários são indutíveis em ambas as espécies, mas diferem em termos de sensibilidade hormonal e perfis de expressão genética. A principal diferença é que os tumores mamários de ratos expressam e dependem da função dos receptores hormonais ovarianos e pituitários, ou seja, estrogênio e progesterona (PR), semelhante ao subtipo luminal-A do câncer de mama humano. De fato, o transplante de células epiteliais mamárias, como descrito neste protocolo, tem sido usado para estudar variantes genéticas envolvidas no câncer de mama e determinar a autonomia celular dos efeitos sobre as células epiteliais mamárias18.

Além da biologia tumoral, o epitélio ductal da glândula mamária normal exibe um nível mais alto de ramificação e é ladeado por uma camada mais grossa de estromatário do que o rato. A importância do estroma está bem documentada nos estudos de transplante epitelial mamária. O epitélio mamário deve interagir com estroma gorduroso, e idealmente seu próprio mesenchyme, para se submeter à sua morfogênese característica19,20. O tecido de enxerto em uma glândula mamária receptora fornece um ambiente ideal; no entanto, a presença de epitélio endógeno pode interferir nos resultados. A pré-limpeza da glândula mamária do epitélio endógeno é comumente realizada em ensaios de transplante de camundongos e requer excisão cirúrgica de tecido mamário endógeno e/ou remoção do mamilo1,21,22. Embora possível, a pré-compensação do epitélio mamário em ratos pós-desagrecidos não é tão amplamente realizada, principalmente devido à ineficácia de limpar a crescente árvore mamária em ratos pós-desagrecidos. Uma vez demonstrado que regiões de tecido adiposo em outros lugares do corpo poderiam apoiar o crescimento do epitélio mamário transplantado21,23,24, o processo de pré-limpeza pode ser facilmente evitado em ratos enxertando tecido no bloco de gordura branca interscapular.

O método de transplante descrito neste artigo envolve a injeção de organoides de glândula mamária enzimática (fragmentos de epitélio ductal mamário e outros tipos de células capazes de morfogênese) ou células monodispersas na almofada de gordura interscapular em cepas de ratos de laboratório, isogênicos ou congênicos de ratos de laboratório2. Como a almofada de gordura interscapular é normalmente desprovida de tecido mamário, fornece um ambiente adequado para múltiplos locais de transplante sem a necessidade de pré-limpar o epitélio endógeno. Como resultado, as glândulas mamárias endógenas e abdominais do animal hospedeiro não estão sujeitas à manipulação cirúrgica, desenvolver-se normalmente e não podem interferir na interpretação dos resultados. Além disso, as glândulas mamárias intactas podem ser usadas para comparação para avaliar os efeitos do hospedeiro versus doador no desenvolvimento de epitélio mamário e tumorigênese18,25. Embora a repopulação da glândula mamária de uma única célula-tronco esteja disponível para ratos, ela ainda não foi desenvolvida para ratos, principalmente devido à falta de disponibilidade de anticorpos para selecionar para células-tronco mamárias de ratos25,26,27. Apesar disso, o transplante de células epiteliais mamárias monodispersas para quantificar o potencial de repopulação pode ser realizado com sucesso, e essas células se desenvolverão normalmente quando enxertadas na estrutura apropriada2,3,4. Embora os organoides sejam bons para muitos propósitos, as células monodispersas são necessárias para aplicações quantitativas, por exemplo, para determinar o número de células epiteliais mamárias necessárias para a iniciação do câncer após o tratamento ionizante de radiação28 ou para comparar características do fluxo citometricamente selecionados populações epiteliais epiteliais29.

Até o momento, o procedimento descrito aqui é o método mais robusto de realização do transplante de glândula mamária no rato com o objetivo geral de estudar o desenvolvimento da glândula mamária e os mecanismos subjacentes ao desenvolvimento do câncer de mama. Muitas vezes, os animais doadores e/ou receptores são expostos a diferentes variáveis antes, durante ou após o transplante epitelial. Exemplos incluem estudos genéticos únicos envolvendo carcinogênese química30, radiação28,31,32, manipulação genética do genoma hospedeiro/doador18, e manipulação hormonal12. Uma grande vantagem da dissociação enzimática descrita neste protocolo é a oportunidade de isolar organoides epiteliais ou células monodispersas para experimentos complementares envolvendo citometria de fluxo, cultura 3D, edição de genes e muito mais. Aplicações futuras desta técnica incluirão manipulação adicional de tecido doador e/ou hospedeiro com engenharia genética. Por exemplo, as células doadoras podem ser geneticamente alteradas ex vivo em qualquer lócus genômico escolhido usando o sistema de edição de genes CRISPR-Cas9. Da mesma forma, os ratos receptores também podem ser geneticamente alterados para estudar a interação entre doadores e fatores genéticos projetados por doadores e receptores.

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Protocolo

Todos os animais foram alojados e mantidos em uma instalação aprovada pela AAALAC, e experimentos descritos neste protocolo foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais do MUSC (IACUC). Os animais para uso em transplante recíproco devem ser uma cepa intérmata ou isogênica, com status congênico preferido ou recuado por pelo menos 6 gerações.

1. Colheita do doador de mammary glândula epitélio

  1. Determine o número de ratos doadores necessários para transplante.
    NOTA: Geralmente, 1 rato doador (4 semanas de idade) pode fornecer células suficientes para transplante em 4 animais receptores. Certas aplicações deste protocolo exigirão um número adicional de células, e pode haver diferenças específicas de tensão no rendimento total.
  2. Rotular todos os suprimentos e garantir colocação acessível para o cirurgião (Tabela 1).
  3. Registre o peso corporal de cada rato doador feminino. Siga as diretrizes institucionais para anestesiar ou eutanásia total do doador. Verifique a profundidade da anestesia pela falta de resposta à pitada do dedo do dedo do dodo do dedo do dodo do dedo.
  4. Mova o animal para o campo cirúrgico estéril. Coloque o animal de costas e pulverize toda a superfície ventral com 70% de etanol.
  5. Faça uma incisão sagital em forma de X, permitindo o acesso às glândulas mamárias torácicas, abdominais e inguinais. Disseque todo o tecido mamário da glândula do doador usando tesouras (Figura 1). Remova todos os linfonodos visíveis.
  6. Extrair o tecido mamário usando fórceps e coloque em um prato rotulado de 60 mm no gelo. Adicione 500 μL de mídia DMEM/F12 sem soro à antena de 60 mm. Ajuste a colocação do tecido da glândula mamária para que fique completamente molhado.
  7. Pique bem o tecido mamário usando tesouras. Para isso, corte o tecido em pedaços de 1-2 mm3 de tamanho(Figura 1C). Mantenha a glândula no gelo até que todo o tecido doador tenha sido colhido (não exceda 60 min).
    NOTA: Pessoal adicional pode cortar glândulas mamárias e preparar ainda mais a solução colagenase enquanto o cirurgião prossegue com extrações teciduais.

2. Extrair tecido cerebral de doadores eutanizados

  1. Cuidadosamente, vire o corpo do animal doador para colocá-lo em uma posição propensa. Seguro com alfinetes. Pulverizar a cabeça e a parte superior das costas com 70% de etanol.
  2. Localize a base do crânio e faça uma incisão os condílios occipital. Insira uma tesoura afiada a pele e corte a pele do crânio, incluindo os lados da cabeça.
  3. Use cortadores ósseos ou tesouras fortes para cortar o crânio ao longo da linha média, do occipital aos ossos frontais. Mantenha a lâmina o mais superficial possível e inclinar para cima para evitar a destruição do tecido cerebral subjacente.
  4. Retire o osso usando rongeurs ou fórceps fortes. Insira a ferramenta lateral no cerebelo para quebrar o osso de ambos os lados, expondo o canal auditivo ósseo. Cortar as conexões com os meninges.
  5. Levante suavemente o cérebro com fórceps curvas e finas. Coloque o cérebro em um pedaço de papel alumínio e grave o peso, e depois transfira imediatamente para um tubo de 15 mL com uma quantidade igual (w:v) de mídia, armazenada no gelo.
    1. Opcionalmente, use fórceps de ponta fina para remover a glândula pituitária (localizada abaixo do cérebro) para uso adicional no procedimento de transplante, se necessário.
  6. Use um homogeneizador mecânico para interromper o tecido. Homogeneize o cérebro por 10-15 s em baixa velocidade. Deixe a mistura sentar no gelo por pelo menos 1 min, e depois homogeneizar novamente. A homogeneização é suficiente quando a mistura final é livre de peças grandes.
  7. Filtre o homogeneee passando por um filtro de 100 μm. Mantenha o filtrado no gelo até o uso (menos de 4 h).

3. Digestão e processamento de extratos da glândula mamária

  1. Descongele ou aqueça reagentes como indicado (Tabela 1). Siga as etapas apropriadas para recuperar organoides ou células monodispersas.
  2. Prepare 10 mL de mídia de digestão sem soro (sem colagenase) para cada animal doador (Arquivo Suplementar 1).
    NOTA: O volume de mídia de digestão utilizada pode ser ajustado (escalonado para cima ou para baixo) para acomodar o tecido agrupado, se aplicável.
    1. Para organoides pule para 3.3.
    2. Para células monodispersas, prepare a solução fresca de mistura de monodispersão e inativação (Arquivo Suplementar 2, Arquivo Suplementar 3) além da mídia de digestão colagenase sem soro. Vá para a etapa 3.3.
  3. Quando todo o tecido mamário dos doadores tiver sido extraído e picado, adicione a enzima colagenase à mídia de digestão quente (ou temperatura ambiente)(Arquivo Suplementar 1). Misture invertendo.
  4. Passe a mídia de digestão colagenase através de um filtro de 20 μm. Dispense 10 mL de mídia filtrada nos tubos rotulados de 50 mL para digestão.
  5. Use uma nova ponta de pipeta de 1.000 μL para cada amostra e transfira o tecido doador picado de cada prato de 60 mm para o tubo de digestão colagenase. Corte 1 cm de desconto na extremidade de uma ponta de 1.000 μL e coloque-a manualmente no dispositivo antes do uso. Misture suavemente o tecido picado, canalizando para cima e para baixo 1-2 vezes.
    NOTA: Se o tecido é difícil de tubular durante a transferência, use uma pequena quantidade da mídia de digestão colagenase do tubo de 50 mL e, em seguida, transfira-o de volta.
  6. Coloque as amostras na posição horizontal em uma incubadora de tremores e deixe as amostras digerirem 1,5-2 h a 37 °C, 200-220 rpm.
    1. Para organoides pule para 3,7.
    2. Para células monodispersas adicione DNase I (0,2 μg/mL) à mistura para os últimos 10 min da digestão. Incubar como antes, com agitação vigorosa. Vá para a etapa 3.7.
  7. Quando o tecido estiver totalmente digerido, a pelota a suspensão utilizando centrífuga fria (4 °C) por 10 min a 1.200 x g (Figura 1D).
    NOTA: Mantenha os tubos no gelo entre cada passo para aumentar a viabilidade das células.
  8. Certifique-se de que uma pelota tenha se formado e, em seguida, despeje cuidadosamente a camada de supernatant e gordura. Resuspender suavemente a pelota em 10 mL de mídia dmem/f12 fresca.
  9. Gire brevemente em 68 x g por aproximadamente 10 s. O comprimento do giro (mas não a velocidade) pode ser aumentado se não houver uma separação clara das células. Inspecione visualmente a pelota antes de prosseguir (Figura 1D).
  10. Remova cuidadosamente o supernatant, deixando para trás um pequeno volume. Prossiga para o próximo passo, com base em se organoides ou células monodispersas são necessárias.
    NOTA É importante deixar um pequeno volume de mídia no tubo porque a pelota estará muito solta. O volume residual de mídia será diluído através de etapas de lavagem.
    1. Para organoides, adicione mais 10 mL de mídia DMEM/F12 e repita a lavagem/giro. Após a segunda lavagem, resuspenda as células em um volume menor (1-2 mL) de mídia DMEM/F12 para filtragem. Vá para a etapa 3.11.
    2. Para células monodispersas, dissolva-se em 2 mL de HBSS pré-aquecido com 0,025% (w/v) Trypsin e 6,8 mM EDTA. Digerir por 3-5 min a 37 °C. Inativar imediatamente.
      1. Adicione 4 mL de DMEM/F12 com 10% de FBS para parar de inativar a trippsina.
      2. Gire as células a 270 x g por 5 min e, em seguida, resuspenda no DMEM/F12 com 10% de FBS novamente. Vá passo 3.11 para filtrar as células.
  11. Filtrar as células usando um filtro de 40 μm de célula strainer colocado em um novo tubo de 50 mL. Pré-molhado o coedor, canalizando 1 mL do mesmo meio base usado para suspender as células e, em seguida, passar a suspensão celular através do filtro usando uma pipeta para coletar fragmentos/organoides ductais.
    NOTA: O rendimento aproximado de epitélio filtrado do tecido da glândula mamária de um único rato doador de 4 semanas de idade é de 1 x 106 células.
    1. Para organoides, descarte o filtrado. Organoides mamários permanecerão dentro da cesta do filtro celular e células menores e indesejadas serão eliminadas. Inverta o filtro celular sobre um novo tubo de 50 mL e enxágue com qualquer volume necessário para coletar as células. Vá para a etapa 3.12.
    2. Para células monodispersas, descarte o filtro celular e mantenha o filtrado porque as células epiteliais mamárias passarão pelo filtro, juntamente com células estrume e imunes menores. Enxágüe o tubo utilizado para a digestão/centrífuga com outro volume de DMEM/F12 com 10% de FBS e passe pelo mesmo filtro de células. Pelotas as células monodispersas por centrífuga em 1.200 x g por 5 min. Procedeu para a etapa 3.12.
      NOTA: As células resuspensas estão prontas para aplicações subsequentes.
  12. Pulso gire a solução e garanta a formação de uma pelota celular antes de seguir para o próximo passo. Pulso girar novamente, se necessário.
  13. Remova cuidadosamente o supernatant. Resuspender a pelota em um pequeno volume (1.000-2.000 μL de DMEM/F12) para concentrar as células para contagem.
  14. Conte células e dilua se necessário. Resuspender o número desejado de células para transplante em 20 μL de mídia DMEM/F12 para cada animal. Mantenha sempre as células no gelo.
    NOTA: As contagens de células doadoras na faixa de 1 x 105 - 1 x 106 células serão necessárias para cada local de enxerto com base no ponto final do estudo. Por exemplo, experimentos de carcinogênese muitas vezes requerem um maior número de células transplantadas, em relação a outras aplicações. O número de células necessárias deve ser experimentalmente determinado para cada cepa. O procedimento descrito neste protocolo utilizou 250.000 células doadoras em 20 μL media por local de enxerto, antes de se misturar com o homogêneo cerebral, conforme descrito na etapa 3.16.
  15. Prepare qualquer alíquota(s) de células necessárias para outros experimentos (por exemplo, isolamento FACS3,26,27,30,33).
    1. Para organoides, prossiga para a etapa 3.16.
    2. Para células monodispersas, quantifique as células viáveis usando a coloração azul Trypan ou metileno e, em seguida, prossiga.
  16. Prepare lotes individuais de material doador para todos os receptores de transplante. Combine volumes iguais da suspensão celular (20 μL) com 50% de homogêneo cerebral (20 μL) para cada local de transplante.
    NOTA: Um total de 40 μL por local será injetado em cada local, mas recomenda-se incluir um volume mínimo de 25% extra para resíduos.
  17. Imediatamente proceder ao transplante ou congelar células para o transplante posteriormente (ponto de parada potencial).
    NOTA: As células congeladas não foram testadas com este protocolo e exigirão otimização antes de gerar uma coorte de animais para experimentos de transplante. É fortemente recomendado transplantar células frescas.

4. Procedimento de transplante (ratos receptores de 4 a 5 semanas de idade)

  1. Pesar cada rato receptor e calcular a dose correta de analgésico aprovado que será utilizada no procedimento.
    NOTA: Os pesos corporais podem ser medidos até 24 h antes do procedimento. Siga as diretrizes institucionais para conter ou anestesiar brevemente cada animal durante a barba.
  2. Raspe a área cirúrgica em cada animal usando cortadores elétricos. Identifique a base do crânio e comece pela coluna vertebral. Aproximadamente um terço do caminho para baixo da coluna vertebral, raspe uma área de 3 cm x 2 cm na porção torácica superior da parte traseira.
    NOTA: A barba também pode ser realizada anestesia no dia do transplante, mas deve ser realizada fora do campo estéril. Devolva o rato para sua gaiola até que seja necessário.
  3. Localize todos os suprimentos necessários para transplante (Tabela 1).
  4. Avalie o Sistema de Anestesia Animal Laboratorial antes do uso. Cubra qualquer fluido e substitua quaisquer tanques ou peças necessárias. Certifique-se de que a linha de gás para a câmara de anestesia esteja aberta e todas as linhas periféricas estejam fechadas para que a anestesia e o oxigênio possam fluir livremente para o animal uma vez que ele seja colocado na câmara.
  5. Almofadas de aquecimento quentes para suportar a temperatura corporal dos animais receptores.
  6. Gere o campo estéril que será usado para cirurgia. Disponha os suprimentos conforme descrito na Tabela 1.
  7. Adminisão de analgésicos pré-operatórios a ratos receptores, conforme indicado pelo protocolo de cuidados com animais aprovado institucionalmente.
  8. Lave as seringas Hamilton com mídia estéril DMEM/F12 para evitar a perda de células. Certifique-se de que a agulha está presa ao corpo da seringa, insira a agulha no líquido e desenhe o êmbolo. Preencha o volume máximo. Pressione o êmbolo e expulse o conteúdo em um tubo de coleta de lixo. Repita 3-5 vezes.
  9. Carregue todo o volume de material doador (preparado na etapa 3.16) em uma seringa separada para cada condição (por exemplo, controle, tratado, selvagem, nocaute, etc.). Insira a ponta da agulha no líquido, desenhe o êmbolo e mantenha a agulha a superfície da mistura à medida que o volume no tubo diminui.
    NOTA: Inclua pelo menos 10% de volume extra em cada seringa. Não descarte a mistura restante feche o tubo e mantenha-o no gelo no caso de mais necessidade.
  10. Inverta a seringa depois de ser totalmente carregada e pressione o êmbolo ligeiramente para remover bolhas de ar na ponta da agulha. Vá para o próximo passo quando tudo estiver preparado.
    NOTA: Certifique-se de que a ponta da agulha nunca toque em nenhuma outra superfície, mesmo dentro do campo estéril. É útil descansar o corpo da seringa sobre um pequeno recipiente de gelo para promover a viabilidade das células.
  11. Coloque o animal receptor na câmara de anestesia e ligue a máquina.
  12. Quando o animal estiver totalmente relaxado (não reage ao toque ou movimento suave da câmara), direcione a anestesia para o cone do nariz e transfira o animal para o campo estéril.
    NOTA: Duração prolongada da anestesia não é bem tolerada por ratos. Complete o procedimento para cada animal em 10 min ou menos.
  13. Coloque o animal em uma posição propensa (em seu estômago) para que a parte de trás da cabeça e a coluna superior seja acessível.
    NOTA: Certifique-se de suporte térmico adequado para o animal o tempo todo e avalie regularmente a profundidade da anestesia usando uma pitada firme do dedo do pé.
  14. Opcionalmente, aplique pomada veterinária oftálmica para evitar a secagem dos olhos.
  15. Limpe a área recém-raspada para remover o excesso de cabelo. Use um movimento circular e aplique 70% de etanol (ou outro reagente, por diretrizes institucionais) à pele, seguido de um antisséptico (como o iodo), e repita. Coloque uma cortina de toalha sobre o animal para que apenas a região para a área raspada seja exposta.
  16. Certifique-se de que o animal permanece sem resposta a estímulos profundos com uma pitada firme do dedo do do dodo do dedo do do dodo do dedo do do dodo do dedo e, em seguida, vá para o próximo passo.
  17. Faça uma pequena incisão interscapular (2 cm) usando uma lâmina cirúrgica afiada.
    NOTA: O corte deve ser superficial, pois a almofada de gordura está localizada logo abaixo da pele.
  18. Localize o vaso sanguíneo medial para orientação (Figura 2B).
  19. Levante a pele de um lado da incisão usando fórceps e segure-a longe da almofada de gordura enquanto o transplante é realizado (Figura 2B). Insira a agulha no local do enxerto.
    1. Opcionalmente, mova a ponta da agulha dentro do tecido e crie um pequeno bolso para coletar as células. Use um movimento pequeno e repetitivo. Não remova a agulha.
      NOTA: Esta etapa é recomendada para usuários iniciantes do protocolo. Tenha extrema cautela ao criar um bolso, pois o tecido da almofada de gordura interscapular é muito delicado.
  20. Injete cuidadosamente 40 μL da mistura celular no tecido da almofada de gordura interscapular. Remova a agulha lentamente.
  21. Segure o tecido no lugar e permita que as células transplantadas se contentem com 3-5 s. Use um par adicional de fórceps, se necessário.
  22. Remova a agulha. Repita o procedimento de injeção (etapas 4.18-4.21) no segundo local de transplante.
    NOTA: O epitélio de um grupo de doadores pode ser injetado no mesmo lado da almofada de gordura em cada animal, ou alternando lados para evitar efeitos em lote do domínio manual do cirurgião.
  23. Feche a ferida cirúrgica usando clipes de ferida ou suturas e, em seguida, interrompa a anestesia.
  24. Fornecer analgésico pós-operatório como indicado pelo protocolo aprovado institucionalmente.
  25. Mova imediatamente o animal para uma gaiola de recuperação com o suporte térmico. Monitore sinais de angústia, como sangramento da incisão ou dificuldade para respirar.
    NOTA: O animal deve se recuperar plenamente dentro de 5-10 min. Consulte as diretrizes institucionais para o retorno dos animais à colônia e o monitoramento pós-operatório após os procedimentos de sobrevivência.
  26. Opcionalmente, realize estudos de carcinogênese no local do enxerto, administrando cancerígenos aos ratos receptores de 3 a 4 semanas após o transplante.
    NOTA: Normalmente, a carcinogênese mamária de ratos é realizada usando um tratamento de cancerígeno químico aos 50-57 dias de idade. Este tratamento dita a idade da cirurgia de transplante (que deve ser feita entre 29 e 36 dias de idade) para dar tempo suficiente para as células enxertadas iniciarem o crescimento da glândula mamária.

5. Avaliação do crescimento epitelial

  1. Monitore o ciclo estrus de ratos através de lavagem vaginal diária e examine a citologia em um slide de microscópio. Comece 8-12 dias antes do ponto final do estudo. Sacrifique todos os ratos no mesmo estágio. Este é um passo opcional.
    NOTA: O ciclo de ratos estrus é de 4 a 5 dias. Permitir que o animal passe por 1-2 ciclos completos facilitará a interpretação, pois deslizamentos de lavagem de ciclos anteriores podem ser usados para comparação.
  2. Ratos receptores de transplante de sacrifício de 6 a 8 semanas após o transplante, por orientações institucionais.
    NOTA: O crescimento é geralmente detectável de 3 a 6 semanas após o transplante, mas pode ser necessário tempo adicional.
  3. Coloque o animal em uma posição propensa e limpe o corpo com 70% de etanol. Levante a pele com fórceps e faça uma incisão ao longo da coluna vertebral para expor a almofada de gordura interscapular. Disseque a pele longe do tecido para que a maioria da almofada de gordura seja visível.
  4. Identifique o vaso sanguíneo medial que separa os locais de enxerto na almofada de gordura interscapular. Excir toda a almofada como um único pedaço de tecido ou cortar ao longo do vaso sanguíneo e remover os lados individualmente.
  5. Coloque o tecido em um slide de microscópio carregado positivamente para montagem inteira. Use 2 pares de fórceps contundentes e espalhe suavemente o tecido para restaurar sua conformação original no slide.
    NOTA: Tecido mamário de rato é extremamente delicado. As bordas do tecido podem se enrolar si mesma. Manuseie sempre com cuidado e segure-se no lugar até que o tecido adere ao escorregador (alguns segundos).
  6. Montar pelo menos uma das glândulas mamárias endógenas abdominais (com linfonodos para orientação) para comparação.
  7. Coloque os slides em 70% de etanol por 7-10 dias para desengordar o tecido. Reponha o etanol quantas vezes for necessário para garantir que o tecido não seque.
  8. Prepare a mancha de carmina e processe os slides quando o tecido estiver suficientemente opaco. Deixe a mancha esfriar antes do uso (Arquivo Suplementar 4).
    NOTA: A mancha pode ser preparada até um dia antes das etapas de fixação e reidratação. A solução pode ser armazenada a 4 °C e tem potencial limitado de reutilização.
  9. Conserte o tecido colocando os slides em 25% de ácido acético glacial : 75% de etanol por 60 min.
    1. Reidrate o tecido através de uma série de 3 lava-lhes em uma série de diminuição da concentração de etanol: 70% de etanol para 15 min, 50% de etanol para 5 min e dH2O por 5 min.
  10. Mancha com carmina alum por 4-8 dias. Verifique a parte de trás dos slides todos os dias para determinar se a mancha penetrou totalmente no tecido. Vá para o próximo passo quando a mancha estiver completa.
    NOTA: A coloração é completa quando as partes mais grossas da glândula têm uma tonalidade roxa e não aparecem mais brancas.
  11. Destain e desidratar o tecido transferindo os slides através de uma série de concentração crescente de etanol: 70% de etanol para 30 min, 95% de etanol para 30 min e 100% de etanol por 30 min.
  12. Coloque slides desidratados em xileno por mais de 3 dias para limpar o tecido. Transfira para o petróleo mineral para armazenamento a longo prazo.
  13. Depois que os slides forem limpos, use microscopia de luz de baixa potência ou fotografia digital de alta resolução para adquirir imagens dos slides para análise. Certifique-se de que os parâmetros de aquisição de imagem sejam consistentes para todos os slides.
    NOTA: O crescimento epitelial deve ser claramente distinguível.
  14. Trate a presença do crescimento como resultado binário.
  15. Calcule o número médio de células epiteliais transplantadas que produziram ≥1 mammary outgrowth em 50% dos locais de enxerto usando as imagens adquiridas. Quantificação outras características físicas, conforme necessário.

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Resultados

Doadores e receptores mammary glândulas
As etapas para isolar e preparar células epiteliais mamárias de ratos para transplante são mostradas na Figura 1A. Com 4 semanas de idade, a glândula mamária endógena do rato doador começou a amadurecer e o epitélio pode ser visualizado em slides inteiros montados manchados com carmina alum(Figura 1B). Um rat...

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Discussão

Este protocolo descreve uma técnica de transplante de células epiteliais mamáriaotimizada para trabalhar com ratos. Organoides epiteliais mamários isolados de ratos doadores (3-5 semanas de idade) são enxertados na almofada de gordura branca interscapular de ratos receptores (também de 3 a 5 semanas de idade). Os resultados podem ser interpretados apenas 4-6 semanas depois, usando microscopia leve para examinar o tecido enxertado; no entanto, a quantidade ideal de tempo entre transplante e sacrifício deve ser determinada...

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Divulgações

Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

Este trabalho foi financiado pelo Fundo de Apoio ao Câncer do Hollings Cancer Center Grant P30 CA138313 financiamento de pesquisa piloto dos Institutos Nacionais de Saúde (https://www.nih.gov/),e recursos do Departamento de Patologia e Medicina Laboratorial da Universidade Médica da Carolina do Sul. Gostaríamos de agradecer marijne Smiths por gravar as declarações da entrevista.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
0,2 µ Filtros de seringa MFisher Scientific09-715Gmeio de digestão de colagenase com filtragem estéril
1.5 - 2.0 mL tubos de microcentrífuga (estéreis)Fisher Scientific05-408-129contendo células ressuspensas e/ou mistura de homogeneizado cerebral
100 µ Filtros de células MCorning431752homogeneizado cerebral filtrante
Seringas estanques a gás de 100 uL com agulhas de calibre 25Hamilton81001 e 90525Para injetar mistura de enxerto em animais receptores (1 por genótipo/condição do doador)
pontas de pipeta de 1000 uL + pipeta-decélulas/misturas/tecido
Tubo de polipropileno de 15 mLFalcon (Corning)352196armazenamento de mistura homogeneizada cerebral, ou célula: mistura homogeneizada para transplante
40 µ Filtros de células MCorning431750organoides filtrantes após a lavagem do pellet celular
Tubos de polipropileno de 50 mLFisher Scientific05-539-6para digestão de colagenase de tecido de glândula mamária doadora
Placas de 60 mmThermo Scientific130181para picar tecido
Sulfato de potássio de alúmenSigma-Aldrich243361/237086coloração de glândula mamária montagem inteira slides
Vaporizador de anestesia para uso veterinário-siga o protocolo institucional
Beta-dine ou iodo-
Tubo de cultura de vidro borossilicato para homogeneizaçãoFisher Scientific14-961-26para homogeneização do cérebro (use tubo apropriado para homogeneizador)
CarmimSigma-AldrichC6152 / 1022coloração glândula mamária lâminas de montagem inteira
Aparelho de contagem de células-
Gaiolas de animais limpas para recuperação-siga o protocolo institucional
Colagenase Tipo 3Worthington Biochemical Corp.LS004183digestão enzimática de tecido de glândula mamária picado de ratos doadores
água deionizada-para soluções químicas
DMEM / F12GIBCO11320033para picar tecido, meios de digestão de colagenase e ressuspensão de misturas de células epiteliais
EDTA-mistura de monodispersão
Etanol, 200 ProvaDecon Labs2705/2701fixador de lâmina de montagem inteira mamária, lavagens de corrediça de montagem inteira mamária, limpeza de locais de incisão cirúrgica (diluída) Soro
fetal (FBS)deinativaçãoHyclone
-
Ácido acético glacialFisher ScientificA38-212uso para fixador de lâmina de montagem inteira mamária (ácido acético glacial 1: 4 em 100% etanol)
HBSSGIBCO-mistura de monodispersão
Almofadas de aquecimento--siga o protocolo institucional
Baldes de gelo (x2)--
Incubadora com rotação orbital--deve ser capaz de manter 37&graus; C, agitando a 220-225 RPM (para digestão de colagenase do tecido mamário)
Anestesia com isoflurano-siga o protocolo institucional
Microscópio óptico ou câmera digital-visualizando todo o epitélio mamário montado e / ou adquirindo imagens
Homogeneizador mecânicoFisher Scientific-TissueMiserou modelos alternativos
Óleo mineral, puroSigma-Aldrich / ACROS Organics8042-47-5armazenamento de longo prazo de montagens inteiras de glândula mamária limpa
Tanques de oxigênio para vaporizadorde-siga o protocolo institucional
Toalhas de papel ou lenços de tarefas delicadas-
Lâminas de microscópio carregadas positivamente Montagensinteiras de tecido de glândula mamáriaThermo ScientificP4981-001
Pós-operatório analgésico-Protocolo institucional
Medidasde peso corporal da
Barbeador-cortadores elétricos ou outros
frascos de coloração-mínimo de 1 por lavagem química, tamanho apropriado para o número de lâminas, vidro preferido
Cortinas de campo estéreisIMCO4410-IMCusado durante o
transplante Tesouras e fórceps estéreis x3 (autoclavados)--ferramentas cirúrgicas de autoclave usadas para doadores e receptores
Seringas: 5 mL (ou mais)--para filtração estéril de meios de digestão de colagenase
Mistura de monodispersãotripsinaWorthington
Receptáculo de coleta de resíduos para líquidos (derramado ou aspirado)- -
Aplicador de clipe de ferida, clipes e ferramenta de remoçãoFerramentas de Fine Science12020-00Fechando a incisão na pele sobre a almofada branca interescapular
XylenesFisher ScientificX3S-4limpando a glândula mamária inteira desliza após a coloração
transferência bovino Gaze de solução de anestesia balança de animais, dosagem adequada de analgésicosde

Referências

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