Medir taxas de mutação microbiana com o ensaio de flutuação

Resumo

Aqui, um protocolo é apresentado para realizar um ensaio de flutuação e estimar a taxa de mutação microbiana usando marcadores phenotípicos. Este protocolo permitirá aos pesquisadores analisar mutações em diversos micróbios e ambientes, determinando como o genótipo e o contexto ecológico afetam as taxas de mutação espontânea.

Resumo

Os ensaios de flutuação são amplamente utilizados para estimar as taxas de mutação em micróbios que crescem em ambientes líquidos. Muitas culturas são cada inoculadas com alguns milhares de células, cada uma sensível a um marcador seletivo que pode ser ensaiou fenotipicamente. Essas culturas paralelas crescem por muitas gerações na ausência do marcador phenotípico. Um subconjunto de culturas é usado para estimar o número total de células em risco de mutações (ou seja, o tamanho da população no final do período de crescimento, ou N_t). As culturas restantes são banhadas no ágar seletivo. A distribuição de mutantes resistentes observados entre culturas paralelas é então usada para estimar o número esperado de eventos mutacionais, m,usando um modelo matemático. Dividir m por N_t dá a estimativa da taxa de mutação por locus por geração. O ensaio tem três aspectos críticos: o marcador phenotípico escolhido, o volume escolhido de culturas paralelas e garantir que a superfície no ágar seletivo esteja completamente seca antes da incubação. O ensaio é relativamente barato e só precisa de equipamentos laboratoriais padrão. Também é menos trabalhoso do que abordagens alternativas, como acúmulo de mutação e ensaios unicelulares. O ensaio funciona em organismos que passam por muitas gerações rapidamente e depende de suposições sobre os efeitos da aptidão dos marcadores e morte celular. No entanto, ferramentas recentemente desenvolvidas e estudos teóricos significam que essas questões agora podem ser abordadas analiticamente. O ensaio permite a estimativa da taxa de mutação de diferentes marcadores de pernotiópico em células com diferentes genótipos crescendo isoladamente ou em uma comunidade. Ao realizar vários ensaios em paralelo, os ensaios podem ser usados para estudar como o contexto ambiental de um organismo afeta a taxa de mutação espontânea, que é crucial para a compreensão da resistência antimicrobiana, carcinogênese, envelhecimento e evolução.

Introdução

Em 1901, o botânico holandês Hugo de Vries cunhou o termo mutação^1. Vinte e seis anos depois, quando Hermann Joseph Muller descobriu a ação mutagênica dos raios-X^2,as mutações já eram percebidas como uma das forças motrizes da evolução. Entretanto, a natureza das mutações não era desobstruída. Para responder à questão fundamental de saber se as mutações emergem espontaneamente (ou seja, uma mutação espontânea) ou em resposta à seleção (ou seja, uma mutação induzida), um método era necessário para observar eventos mutacionais. Tal método mediria o número esperado de mutações por divisão celular ou o que já era conhecido como uma taxa de mutação^3,4.

Figura 1: Ilustração esquemática de como executar o ensaio da flutuação com uma tensão microbiana em uma placa profunda do poço de 96. A) Inocular e acclimator células em tubos de 50 mL contendo cinco ambientes diferentes ('vermelho', 'azul', 'verde', 'roxo', e 'laranja' ensaios). (B)Prepare culturas paralelas com um pequeno número de células sensíveis em uma placa de poço de 96 profundidade. O ensaio "vermelho" tem 20 culturas paralelas, enquanto o 'azul', 'verde', 'roxo' e 'laranja' ensaios todos têm 19 culturas paralelas. As posições das culturas paralelas na placa de poço profundo 96 são aleatórias. A randomização pode ser feita com o script LayoutGenerator.R suplementar ou por alguma outra ferramenta. O layout no canto superior direito é o resultado da randomização. Incubaçãoda placa de 96 poços profundos e permitir que as células se dividam e se transformem espontaneamente. Seis culturas de poços profundos A1, B1, C1, E1, F1 e G1 mostram como o número de mutantes flutua: 4, 0, 2, 2, 1 e 4 células vermelhas após a terceira divisão celular, respectivamente. O número de mutantes difere não só por causa do número diferente de mutações espontâneas (0, 1 ou 2, como mostrado pela primeira célula vermelha), mas também porque é importante quando durante um ciclo de cultura uma mutação de resistência emerge espontaneamente (divisão celular 1, 2 ou 3). (D)Após a incubação da placa de poço profundo 96 o número de mutantes é determinado por revestimento 81 culturas paralelas. No layout estes são círculos sem bordas ousadas. Toda a cultura paralela é banhada em um poço de uma placa de 6 poços contendo um ágar seletivo. (E)As 15 culturas restantes são diluídas e banhadas na ágar não seletiva para determinar o número médio de células(N_t). No layout estes são rotulados como Ntwells e têm bordas ousadas. Para cada ensaio N_t é em média mais de três culturas paralelas. Na parte inferior direita é uma placa de Petri contendo uma placa de ágar não-seletiva com 25 CFUs de uma cultura diluída cultivada em um poço profundo D1 (parte de um ensaio "verde"). (F)Após a incubação das placas seletivas de 6 poços o número de mutantes observados foi contado e o número esperado de eventos mutacionais, m,foi estimado usando um estim máximo do likelihoodador. Conhecendotanto o número de mutações, m,quanto o número de células por ensaio, N_t,a taxa de mutação foi estimada como m/N_t. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Salvador Luria e Max Delbrück, em 1943, forneceram uma solução engenhosa para este problema com o ensaio de flutuação⁵ (ver Figura 1). O ensaio começa com múltiplas populações (chamadas culturas paralelas) que são iniciadas com um pequeno número de células microbianas (Figura 1A,B). Após o crescimento em um ambiente benigno e não seletivo (Figura 1C),culturas paralelas são transferidas em placas contendo um marcador seletivo (fagos, antibióticos, etc.), onde apenas células com mutação de resistência sobrevivem e podem produzir uma colônia (Figura 1D). A expectativa principal era que se as mutações da resistência são induzidas, o número de pilhas que carreg uma mutação deve ser distribuído entre populações diferentes com o meio igual à variação. O que Luria e Delbrück encontraram com o ensaio de flutuação é que o número de mutantes flutuou drasticamente e que a variação no número de mutantes entre diferentes populações era consideravelmente maior do que a média. Luria e Delbrück demonstraram assim que as mutações são espontâneas. Eles mostraram que mutações surgem espontaneamente sempre que o DNA é replicado, e o número de mutantes depende de quando a mutação ocorre durante o crescimento da população. Veja a Figura 1C,onde seis populações, cada uma iniciada com uma célula microbiana (em azul), experimentam nenhuma, 1 ou 2 mutações únicas. As populações A1, E1 e F1 experimentaram uma única mutação (primeira célula vermelha), mas como uma única mutação surge espontaneamente em vários momentos durante um ciclo cultural, as populações acabaram com um número muito diferente de mutantes observados (quatro, dois e um, respectivamente). Por outro lado, as populações C1 e G1 acabaram com o mesmo número de mutantes observados como E1 e A1, apesar de experimentar dois eventos mutacionais em vez de um. A flutuação dos mutantes observados entre as populações não só deu o alvo o nome, mas também mostrou que uma freqüência mutante (ou seja, a proporção de células mutantes) é um indicador inadequado da taxa de mutação.

O objetivo geral do ensaio de flutuação é estimar a taxa de mutação espontânea de um genótipo específico de bactérias ou outro organismo unicelular que cresce em um ambiente líquido específico. O ensaio de flutuação continua a ser a ferramenta mais adequada para estudar a dependência ambiental das taxas de mutação microbiana e permite a estimativa rápida e barata da taxa de mutação. Abordagens alternativas à estimativa da taxa de mutação, como sequenciamento de profundidade máxima^6,sequenciamento populacional^7,experimentos de acumulação de mutação^8,ou comparando sequências genômicas de uma prole com as dos pais⁹ são muito mais trabalhosas e, portanto, pouco adequadas para detectar potencialmente dependências ambientais. No entanto, aspectos dinâmicos da geração e reparo de uma mutação são em grande parte inacessíveis a um ensaio de flutuação ou a qualquer um dos métodos de atribuir uma taxa de mutação listada acima. Para estudar como o número de mutações muda no tempo, espaço ou entre células individuais dentro de uma população, são necessárias abordagens de células únicas^11,12, o que, além de ser mais trabalhoso do que ensaios de flutuação, requer habilidades e equipamentos altamente especializados.

Na prática, um ensaio de flutuação é contar as células ganhando um marcador phenotípico devido a uma mutação que ocorre em um ambiente sem seleção para esse marcador. A meta-análise de centenas de ensaios publicados¹⁰ mostra que pelo menos 39 marcadores pofogóricos diferentes têm sido usados desde o início do ensaio em 1943. O ensaio de flutuação pode ser usado para comparar médias e dependência ambiental das taxas de mutação entre cepas laboratoriais, clínicas, não-mutantes e mutadorais que crescem em ambientes permissivos. O ensaio permite a estimativa da taxa de mutação em células com diferentes origens genéticas crescendo em ambientes mínimos ou ricos. O ensaio é adequado não só para as populações que crescem como uma monocultura, mas também pode ser usado para estudar os efeitos das interações célula-célula sobre as taxas de mutação¹¹. Quando a tensão do interesse é cocultured com uma segunda tensão, e um marcador neutro é usado para distinguir as tensões, as taxas da mutação podem ser avaliadas para duas tensões no mesmo tubo ao mesmo tempo.

Os ensaios da flutuação revelaram que a taxa espontânea da mutação depende em cima do genótipo de uma pilha e de seu ambiente¹² e é um traço que próprio evolua^13. Sempre que a taxa de mutação de um genótipo específico muda com o ambiente, é descrita como plasticidade de taxa de mutação¹¹. As taxas de mutação plástica foram mais bem abordadas para mutagênese induzida pelo estresse (SIM)¹⁴. Além disso, usando ensaios de flutuação, tem sido recentemente demonstrado que a densidade a que uma população de células cresce (normalmente uma cultura de lote na capacidade de transporte) está intimamente associada com as taxas de mutação em bactérias e eucariontes unicelulares. A taxa de mutação por genoma por geração diminui em populações densas em até 23 vezes^10,11. Esta plasticidade de taxa de mutação associada à densidade (DAMP) pode depender de um sistema de detecção de quórum¹⁵ e agir independentemente do SIM¹⁶.

Aqui, um protocolo detalhado é apresentado para o ensaio de flutuação usado para estudar cepa escherichia coli K-12 ganhando resistência ao antibiótico rifampicin em um ambiente de mídia mínima de glicose. No entanto, este protocolo deve ser visto como um modelo básico que pode ser utilizado para estudar uma grande variedade de micróbios, simplesmente modificando as condições de cultura e marcadores phenotípicos da mutação. O protocolo evoluiu desde a sua criação^{5,17,18,19,20, 21,22,23, 24,25,26,27,29, 29, através} de seu uso em uma ampla gama de micróbios e até mesmo células cancerosas³⁰ e foi modificado para aumentar a taxa de taxas de veio, que foi essencial para testar adequadamente as dependências ambientais das taxas^demutação microbiana^10,11,16. O protocolo aqui descrito não abrange todas as questões metodológicas e analíticas do ensaio de flutuação que já foram bem discutidos na literatura, particularmente os efeitos da aptidão de mutações resistentes³¹, atraso phenotípico³², morte celular³³, ea adequação de vários algoritmos disponíveis para estimar as taxas de mutação^26,34. Isso pode ser importante, por exemplo, quando a dependência ambiental dos efeitos da aptidão pode dar origem a variação errônea na taxa de mutação estima³⁵. No entanto, notamos que as ferramentas analíticas que usamos aqui podem lidar com a variação na aptidão mutante e morte celular. Como abordado nas notas e discussão, também é recomendável que vários marcadores de phenotípico que são improváveis de ter os mesmos efeitos de aptidão ambientalmente dependentes ser considerado. Este protocolo permitirá que as pessoas rotineiramente para analisar as dependências ambientais das taxas de mutação na diversidade de cepas microbianas e ambientes. Assumos mutações em diferentes ambientes ainda não foram completamente testadas e uma vez considerada a densidade populacional, os ensaios de flutuação podem dar uma estimativa mais precisa da taxa de mutação^10. Este protocolo permitirá a realização de mais ensaios de flutuação, como é necessário para a compreensão dos mecanismos subjacentes às taxas de mutação, que por sua vez são vitais para a compreensão da evolução, da carcinogênese, do envelhecimento e da resistência antimicrobiana.

Protocolo

1. Dia 1: Inoculação e Aclimatação das Culturas

1. Inocular 3 mL de caldo de lysogeny líquido (LB, ver Tabela Suplementar 1) com um arranhão de gelo do estoque de glicerol E. coli MG1655 (18% glicerol, -80 °C). Agite a cultura LB em 120 rpm para ~ 7 h a 37 °C.
   Nota: Neste experimento, E. coli K12 MG1655 crescendo em LB é usado, mas este ensaio pode ser realizado com qualquer cepa de E. coli ou qualquer outra espécie microbiana culturable. Temperatura de incubação, tempos de incubação e nível de nutrientes da mídia de crescimento podem estar sujeitos a variação por espécies ou cepas.
2. Diluir a cultura 2.000 vezes usando a solução saline. Adicione 100 μL da solução diluída a três tubos cônicos de polímero de fundo cônico de calota de fenda de 50 mL (50 tubos de mL) com 10 mL de médio mínimo davis líquido (DM, consulte a Tabela Suplementar 1),respectivamente contendo 80 mg/L, 125 mg/L, ou 250 mg/L de glicose. Este é o mesmo meio (ou seja, ambiente) em que a taxa de mutação será estimada. Agite as culturas a 120 rpm durante a noite a 37 °C.
   Nota: A escolha da mídia está sujeita a variação por espécie, tensão ou questão de pesquisa.

2. Dia 2: Geração de Mutantes em Culturas Paralelas

1. Primeiro, preparar os ambientes em que as bactérias serão cultivadas. Prepare sempre 10% a mais do que o necessário (ou seja, vinte e 1 ml de culturas exigem 22 mL). Prepare 22 mL de 1) DM com 80 mg/L de glicose, 2) DM com 125 mg/L de glicose, 3) DM com 250 mg/L de glicose, 4) DM com 80 mg/L de glicose e 5) DM com 250 mg/L de glicose em cinco tubos de 50 mL. Rotulá-los como GLC-80A, GLC-125, GLC-250A, GLC-80B e GLC-250B, respectivamente.
2. Prepare inocula para os ambientes. Certifique-se de que o inóculo para 1 mL do ambiente contém 1.000 a 5.000 células. Faça isso seguindo os passos abaixo.
   1. Medir a densidade óptica (OD) de culturas durante a noite (a partir do passo 1.2) em 600 nm.
   2. Diluir cada cultura durante a noite, a fim de atingir uma densidade final de 1.000-5.000 células por mL de DM com glicose. Em nossas mãos, se o OD medido em 2.2.1 é 0.3, isso significa fazer uma diluição de 100 vezes (em solução soro fisiona) da cultura durante a noite, em seguida, adicionando 11μl desta solução para o ambiente de 22 mL.
3. Prepare culturas paralelas.
   NOTA: Este protocolo é escrito para uma placa de poço de 96 profundidade, realizando cinco ensaios de flutuação (o número máximo razoável em uma placa de 96 poços), usando três ambientes. Com experiência, várias placas de poços profundos podem ser executadas em paralelo.
   1. Crie um layout aleatório de culturas paralelas para uma placa de poço de 96 poços profundos. O script Supplementary R LayoutGenerator.R (veja o layout na Figura 1B)pode ser usado para isso. Posicione cada cultura paralela na placa de poço profunda 96 de acordo com a disposição.
      Nota: Executando o LayoutGenerator.R irá garantir que o primeiro ensaio tem 20 culturas paralelas, e que o segundo, terceiro, quarto e quinto ensaios têm 19 culturas paralelas cada.
   2. Transfira 1 mL de mídia inoculada em cada poço de uma placa de poço de 96 profundidade de acordo com o layout randomizado.
   3. Corrija a tampa da placa de poço profundo com a fita. Não fixe a tampa firmemente, porque o crescimento da cultura é sensível à quantidade de aeração.
   4. Pese a placa inteira com a tampa e a fita e agite a placa em 250 rpm por 24 h em 37 °C. Coloque 2 L de água destilada na incubadora para estabilizar a quantidade de evaporação entre os conjuntos experimentais.
4. Determine o tamanho do inóculo chapeando 10 μL de cada um dos meios inoculados na placa de ágar não seletiva de Tetrazolium (TA) (ver Tabela Suplementar 1). Use um propagador em forma de L estéril até que a superfície do ágar esteja seca. Placas de ágar de incubação TA deslizam para baixo durante a noite a 37 °C.
   Nota: TA ágar é um ágar rico que contém o açúcar L-arabinose e o corante solúvel em água 2,3,5 triphenyltetrazolium cloreto, que é incolor em sua forma oxidada. Quando as bactérias reduzem o tinulado, fica vermelha devido à formação de formazan. Colônias em TA ágar que não pode utilizar L-arabinose são vermelho escuro. Outras cepas, como mg1655, são rosadas. O uso de ágar ta ao invés de agar LB padrão é recomendado porque as colônias bacterianas coloridas são mais fáceis de detectar, o que torna a contagem de colônias mais confiável e mais rápida.
5. Prepare ágar ta seletivo contendo rifampicinem em 6 pratos de poço. Pipeta 5 mL do ágar ta seletiva em cada poço dos 6 pratos de poço. Prepare o antibiótico rifampicin pouco antes de ser adicionado ao ágar TA.
   NOTA: Quando a cicloserina é usada como um marcador, use Davis médio mínimo com 250 mg/L de glicose complementada com ágar e L-arabinose e 2,3,5 triphenyltetrazolium cloreto como ágar seletivo. Ou seja, ta ágar não seleciona apenas as células que são resistentes à cicloserina, porque tryptone e extrato de levedura (ambos os componentes essenciais da ágar TA) contêm o aminoácido D-alanina. Este aminoácido antagoniza o efeito antimicrobiano da cicloserina e permite que todas as células façam uma colônia.
   1. Deixe as placas seletivas e não seletivas restantes no escuro (por exemplo, em uma caixa) à temperatura ambiente.

3. Dia 3: Culturas de revestimento em placas seletivas e não seletivas de Ágar

1. Contagem colônia formando unidades (CFU) nas placas de ágar não seletivas e determinar o tamanho do inocula multiplicando CFU por 100. Trata-se de uma razão entre um volume da cultura paralela (1 mL = 1.000 μL) e o volume banhado (10 μL).
   Nota: Se as placas não seletivas forem armazenadas refrigeradas, a CFU pode ser contada mais tarde.
2. Após 24 h de incubação, pesar toda a placa de poço profundo para determinar a quantidade de evaporação. Isto é provável que seja em torno de 10%.
3. Calcule o volume médio de uma cultura paralela após 24 h de incubação(V[24h])em microlitros usando um volume inicial V[0h]= 1.000 μl e o peso da placa convertido em microlitros, onde a densidade do médio de crescimento é medida em mg/μl. Este estudo utiliza uma densidade de 1 mg/μl:
   
4. Transfira as três culturas escolhidas aleatoriamente por ensaio (15 no total, destacadas com um círculo preto no layout na Figura 1B) para tubos de microcentrífuga rotulados. Deixe-os no banco para ser usado mais tarde (ver passo 3.6) para determinar o tamanho final da população (ou N_t).
5. Placa as 81 culturas paralelas restantes da placa profunda do poço no ágar seletivo de TA que contem o rifampicin. Pipeta uma cultura paralela inteira da placa profunda do poço 96 em um poço de uma placa de 6 poços. Certifique-se de que qualquer placa de 6 poços contém culturas paralelas de mais de um ensaio de flutuação.
   1. Retire as tampas das placas seletivas de ágar e deixe descoberto em condições estéreis. Seque todo o líquido na superfície do ágar ta seletivo.
      Nota: O ágar estar completamente seco é fundamental. No entanto, não overdry o ágar TA seletiva, porque não deve ser autorizado a crack.
6. Enquanto as placas seletivas de ágar TA estão secando, o que pode levar até várias horas, determinar N_t das 15 culturas preparadas na etapa 3.4 usando unidades de formação de colônias (CFU).
   1. Determine a UE diluindo as culturas dos tubos de microcentrífuga. Use cinco etapas de diluição de 10 vezes, misturando e vórtice 900 μL de solução saline com 100 μL da cultura em cada etapa. Placa 40 μL da última diluição (com um fator de diluição de 10⁵⁾na agar TA não seletiva e placas de incubação tampa para baixo durante a noite em 37 °C.
      Nota: A série de diluição em 96 placas de poço pode ser realizada com uma pipeta multicanal, o que pode aumentar a velocidade desta etapa.
7. Uma vez que todos os poços em uma placa de 6 poços estão livres do líquido de cultura, coloque a tampa de volta e coloque a placa de 6 poços com a tampa para baixo no banco até que todos os 6 pratos bem estão secos. Uma vez que todos estão secos, incubar a tampa das placas para baixo em 37 °C para 44-48 h.
   Nota: Para outros marcadores (ácido nalidixic, cicloserina, hygromycin B, ou 5-FOA) incubam as placas por 68-72 horas. Certifique-se de que a umidade na incubadora é alta. É fundamental que as placas seletivas de ágar não sequem durante o período de incubação.

4. Dia 4: Determinação do Número de Células nas Culturas

1. Conte a CFU nas placas de ágar não seletivas. Estimar o número de células viáveis na cultura multiplicando a CFU com o fator de diluição (10⁵⁾e a razão entre o volume médio calculado V[24h]em microlitros (ver passo 3.3) e volume banhado (40 μl):
   
2. N_t de um genótipo particular que cresce em um ambiente particular é a média destes valores das três culturas.

5. Dia 5: Estimativa da taxa de mutação

1. Conte o número de colônias resistentes ao antibiótico nas placas seletivas de ágar TA (ou seja, o número de células resistentes que surgiram através de mutação espontânea na placa de poço profundo nos dias 2-3). Registre a distribuição entre culturas paralelas do número observado de mutantes para um ensaio específico (por exemplo, 16 ou 17 valores, incluindo zero contagens).
   NOTA: Se as placas seletivas são armazenadas refrigeradas, as colônias resistentes ao antibiótico podem ser contadas mais tarde.
   1. Use cada distribuição para estimar o número de eventos mutacionais, m,usando o flan³⁶do R-pacote.
      Nota: Há também o r-pacote RSalvador com funcionalidade semelhante²⁹.
   2. Salve a distribuição dos mutantes observados para um ensaio em um arquivo de texto como uma única coluna.
2. Use o software Shinyflan (http://shinyflan.its.manchester.ac.uk/) para estimar m como detalhado abaixo.
   1. Na guia Hipótese Teste deixar valores como padrão (ou seja, Unknown Fitness tiquetaqueado, Método de Estimativa = Probabilidade Máxima (ML), Distribuição da Vida Mutante = Exponencial (modelo LD), Parâmetro Winsor = 1.024, Número de mutação e Fitness = 1, Nível de Confiança = 0,95, Número de Classe e Valor Maximal = 100).
   2. Clique em navegar e selecione o arquivo de texto com a distribuição de mutantes observados. Tente primeiro com o arquivo dados complementares.
   3. Depois de carregar o arquivo, clique no Teste de Desempenho. No lado direito o resultado do teste,o um teste ML-Test da amostra (modelo de LD), encontre o número da mutação. Este é m,o número esperado de eventos mutacionais.
   4. o intervalo de confiança de 95 por cento para o número da mutação encontra o limite superior e mais baixo do m.
3. Uma vez que m e N_t (determinado pela CFU) estão disponíveis, estimar a taxa de mutação de um genótipo específico em um determinado ambiente como . Divida os limites superior esquentar e inferior em m por N_t da mesma forma para gerar intervalos de confiança na taxa de mutação (NB isso não leva em conta a incerteza em N_t).
   Nota: Os resultados são apresentados como a taxa de mutação por locus rpoB por geração. A taxa de mutação por par de base é gerada dividindo a taxa de mutação por locus rpoB por 79, que é o nosso conhecimento atual de quantas mutações pontuais dentro de um gene rpoB conferem resistência à rifampicina³⁷. Multiplicar a taxa de mutação por nucleotídeo pelo tamanho do cromossomo(E. coli K-12 MG1655 = 4.639.675 bp), dá a taxa de mutação por genoma.
4. Repita os passos 5,1-5,3 com os quatro ensaios de flutuação restantes.

Resultados

Os resultados foram coletados com o protocolo relatado em quatro semanas diferentes por três investigadores individuais diferentes, onde cada semana uma placa profunda do poço de 96 foi usada para gerar cinco estimativas da taxa da mutação. Ao todo, três placas de poços profundos geraram 15 estimativas de taxa de mutação (± intervalo de confiança de 95%, CI) em E. coli K-12 MG1655 (Figura 2A, conforme usado no protocolo), enquanto uma placa de poço profundo de 96 foi usada para cinco estimativas (± IC de 95%) de E. coli K-12 BW25113 Δmutmutant (Figura 2B). Na Figura 2, a precisão mediana com intervalo interquartile de estimação m é de 17,5% (1,00%−28,9%, n = 20). A precisão é um coeficiente da variação do número esperado de eventos mutacionais(m)calculado como σ_m/m x 100% (onde o σ é calculado como mostrado anteriormente^38). Os dados brutos para o Valor 2 estão disponíveis no Arquivo de Dados Suplementares "Krasovec_etal_JoVE_data.csv". O Arquivo de Dados Suplementares é acompanhado por um script R para gerar a Figura 2. Veja também tabela suplementar 2 para obter mais detalhes sobre cepas bacterianas e tabela complementar 3,onde colunas no arquivo de dados são explicadas. Os pontos de dados adquiridos com rifampicin a ácido nalidixic foram publicados previamente em Krašovec et al.¹⁰ e têm as mesmas iDs aqui como quando publicados primeiramente.

Na Figura 2A, as taxas de mutação MG1655 de três marcadores pednotípicos diferentes, cicloserina, rifampicina e ácido nalidixic são apresentadas. Aqui, as taxas de mutação foram avaliadas em Davis médio mínimo com 80, 125 e 250 mg/L de glicose, como explicado no protocolo. Em um caso 1.000 mg/L de glicose foi usado(Figura 1B). Na prática, qualquer concentração inicial de glicose pode ser usada. Como esperado, as taxas de mutação foram maiores para a resistência à cicloserina, menor para resistência ao ácido nalidixic, e a taxa de resistência à rifampicina foi no meio. Isto está de acordo com os tamanhos de alvo conhecidos para estas três resistências, onde o maior é para o cycloserine e o menor para o ácido nalidixic. A discussão e a Figura 3 dão detalhes sobre como explorar os tamanhos-alvo, volumes de culturas paralelas e nível de nutrientes no ambiente para otimizar a medição das taxas de mutação microbiana com o ensaio de flutuação.

O ensaio de flutuação mostra claramente qual cepa é um mutator constitutivo e que tem taxas normais de mutação. A cepaδ mutT teve uma taxa de mutação aproximadamente 50x maior para resistência ao ácido nalidixic (Figura 2B) como MG1655 (Figura 2A). No entanto, para determinar a taxa de mutação de um genótipo específico em diferentes ambientes, fazer pelo menos cinco réplicas por genótipo por ambiente usando apenas um marcador de pernotípia é recomendado. Para um esboço detalhado dos métodos estatísticos anteriormente utilizados para analisar este tipo de experimento, consulte as informações complementares em Krašovec et al.¹⁰.

Figura 2: Figura representativa das taxas de mutação estimadas pelo ensaio de flutuação nas populações de Escherichia coli. (A)A taxa de mutação determinada pelo protocolo relatado no tipo selvagem MG1655 (círculos). A figura mostra as taxas de mutação na presença de rifampicin (círculos azuis claros), ácido nalidixic (círculos vermelhos), e resistência da cicloserina (círculos azuis escuros). Para o ácido nalidixic, os volumes maiores da cultura de 10 mL foram usados (veja a lima suplementar dos dados). Os dados para rifampicin e ácido nalidixic são replotados da figura 2a em Krašovec eoutros^10. (B) A taxa de mutação para a resistência ao ácido nalidixic no mutanteKeio ³⁹ Δ (triângulos vermelhos). Observe a escala logarítica no eixo de taxa de mutação. Barras de erro = intervalos de confiança de 95% calculados conforme explicado no protocolo. Os dados são retraçados a partir da Figura 4a em Krašovec et al.¹⁰. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Figura 3: Um fluxograma para solução de problemas no ensaio de flutuação. O fluxograma deve ser seguido a partir do topo, abordando as três questões nos diamantes amarelos, por sua vez, ajustando o protocolo de acordo com o conteúdo das caixas verdes resultantes, e implementando o protocolo, conforme indicado nas ovais vermelhas. Veja os três primeiros parágrafos da discussão para obter mais detalhes sobre como solucionar problemas. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Tabela Complementar 1: Fórmulas para a mídia utilizadano protocolo. Clique aqui para ver esta tabela (Clique certo para baixar).

Tabela suplementar 2: Tensões bacterianas. Clique aqui para ver esta tabela (Clique certo para baixar).

Tabela complementar 3: Descrição detalhada das colunas no arquivo de dados brutos Krasovec_etal_JoVE_data.csv. Clique aqui para ver esta tabela (Clique certo para baixar).

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Discussão

Qualquer estimativa de uma taxa de mutação precisa maximizar a precisão alcançada para garantir a repetibilidade e reprodutibilidade dentro e entre os estudos³⁴. Para um ensaio de flutuação, há três considerações críticas. Os dois primeiros foram definidos no protocolo dado, mas vai precisar de solução de problemas (ver Figura 3)se o protocolo é adaptado para trabalhar com diferentes cepas ou ambientes. Primeiro é escolher o marcador phenotípico apropriado. Para as bactérias, recomenda-se estimar taxas em um dos dois marcadores loci, rpoB ou gyrA, conferindo resistência aos antibióticos rifampicin a ácido nalidixic, respectivamente. O tamanho alvo de mutações à resistência aos antibióticos nestes dois loci é diferente. Existem 79 e 20 mutações únicas que conferem resistência à rifampicina³⁷ e ácido nalidixic^40, respectivamente. Na prática, isso significa que, em média, os mutantes resistentes à rifampicina são observados com mais frequência. Assim, a primeira pergunta (Q1 na Figura 3) que precisa ser respondida é se a cepa é ou não um mutator. Quando os mutadores constitutivos são estudados, onde muitas colônias mutantes observadas são esperadas, é melhor usar um marcador com um tamanho de alvo menor (por exemplo, ácido nalidixic). Veja a Figura 2B,onde as taxas de mutação do mutador constitutivo E. coli K-12 BW25113 ΔmutT foram estimadas usando ácido nalidixic como marcador. Ao trabalhar com cepas bacterianas não mutantes que têm um tipo selvagem (ou seja, normal) taxa de mutação, rifampicin é uma escolha melhor (ver Figura 2A). Se por algum motivo mais mutantes observados são necessários, um marcador relevante é a resistência a uma cicloserina. Para este marcador, mutações de resistência podem surgir em mais de dez genes^41,o que significa que o tamanho do alvo é ainda maior do que para a rifampicina. Ao estudar levedura e arqueia, recomenda-se estimar as taxas de mutação em proteínas ribossômicas 25S e URA3, conferindo resistência à hitalmicina B e 5 fluoro-ácido orotic (5-FOA), respectivamente.

A segunda consideração crítica é o volume de culturas paralelas. Qual volume usar depende do número real de mutantes observados. O número esperado de mutantes observados é afetado pelo tamanho alvo do marcador pofonípico escolhido, da capacidade da cepa de reparar e evitar mutações (a taxa média de mutação) e a capacidade de carga do meio ambiente, que é afetada tanto pela mídia utilizada quanto pelo volume de cultura. Se nenhuma cultura paralela contem colônias mutantes resistentes à rifampicina, então a cicloserina deve ser usada ou o número de células banhadas deve ser aumentado. Isto pode ser conseguido adicionando mais glicose a um meio mínimo ou cultivando pilhas em um ambiente mais rico (ou completo). No entanto, em muitos casos, tal aumento na densidade populacional está associado a uma redução na taxa de mutação, resultando em aumento limitado, se houver, no número de colônias mutantes observadas¹⁰. Se aumentar os nutrientes não é uma solução, então aumentar o número de células, aumentando o volume de cada cultura paralela é uma opção. Quando o ambiente inclui sais mínimos com açúcar como única fonte de carbono e energia (ou seja, a resposta ao segundo trimestre na Figura 3 é "médio mínimo"), então volumes entre 0,5 e 1,5 mL devem ser usados. Se o ambiente é rico, então os volumes de culturas paralelas devem estar entre 0,35-1 mL. A última pergunta diz respeito ao número médio de colônias resistentes. Se muito poucas colônias mutantes forem observadas (ou seja, a resposta ao 3º trimestre na Figura 3 é 0) e o ambiente não deve ser modificado, então o volume de culturas paralelas deve ser aumentado ou o antibiótico com um tamanho alvo maior (por exemplo, cicloserina) deve ser usado. Por outro lado, se muitas colônias mutantes forem observadas em todas as placas seletivas (mais de ~150 por placa, ver a Figura 3),então o número de células banhadas deve ser diminuído, o que geralmente significa usar um volume menor ou mudar para um antibiótico com um tamanho alvo menor (por exemplo, ácido nalíptico).

Uma vez que o volume é escolhido, é melhor que todas as culturas paralelas em uma placa de poço profundo 96 têm o mesmo volume. Isso permite uma determinação mais precisa do volume real de culturas paralelas do peso da placa. Quando as taxas de mutação de um genótipo específico são comparadas entre diferentes ambientes, é novamente melhor usar o mesmo volume de culturas paralelas em todos os ambientes. Se o ácido nalidixic é usado estimando o tipo selvagem (isto é, normal) taxas de mutação ou algum outro marcador pednotypic é usado que tem um tamanho de alvo ainda menor do que o ácido nalidixic, o volume deve ser aumentado ainda mais. Uma opção é fazer culturas paralelas em tubos de 50 mL com volumes de até 15 mL. Por exemplo, 10 culturas paralelas mL foram preparadas em tubos de 50 mL ao estimar a taxa de mutação E. coli K-12 MG1655 para ácido nalidixic (ver Figura 2A). As culturas paralelas de 10 mL foram então banhadas no ágar ta seletivo e despejadas em grandes placas de 150 mm em vez de placas de Petri padrão de 90 mm. A desvantagem de preparar culturas paralelas em tubos de 50 mL é que a taxa de rendimento é consideravelmente menor em comparação com as taxas de mutação em uma placa de poço de 96 profundidade. Uma solução é diminuir o número de culturas paralelas. No entanto, isso afetará a precisão para a estimativa de m, que depende do número esperado de eventos mutacionais e do número de culturas paralelas²⁶. A obtenção de uma distribuição de mutantes observados com culturas paralelas de 14 a 17 (como foi feito na Figura 2),é um bom equilíbrio entre uma taxa de transferência sólida e um nível de precisão aceitável^{de 26} de 20%. Um nível médio de precisão de 17,5% é semelhante à precisão mediana com uma faixa interquartil de 16,4% (5,7%−38,9%, n = 580) calculada a partir de um conjunto de dados muito maior¹⁰. Assim, recomenda-se que, ao preparar culturas paralelas em 96 placas de poços profundos ou 50 tubos mL, a distribuição de mutantes observados seja obtida com pelo menos 14 culturas paralelas. Quando as taxas de mutação são estimadas em diferentes ambientes, recomenda-se testar os níveis de precisão fazendo um experimento multiplacal, onde todas as 96 culturas paralelas em uma placa são cultivadas no mesmo ambiente. Além disso, ao preparar culturas paralelas, é fundamental que a inocula contenha um baixo número de células, pois reduz as chances de quaisquer células resistentes estarem presentes no inóculo. Mutantes resistentes pré-existentes não são desejados no inóculo, porque eles vão aumentar em números e criar um gramado em placas seletivas e estimativa da taxa de mutação não será possível. Por exemplo, na maioria das populações não-mutantes de E. coli, a taxa de mutação para a resistência à rifampicina está na ordem de ~10-8 . Assim, para evitar inocular a cultura com um mutante resistente pré-existente, deve-se inocular com menos de 10⁸ células (por exemplo, 10³a 10⁴ células). O passo crítico final é garantir que, antes que placas seletivas de ágar sejam incubadas, a superfície na ágar seletiva está completamente seca. Os espalhadores não podem ser usados se as placas de 6 poços forem usadas e o volume inicial de uma cultura paralela for de 1 mL, por exemplo. As placas devem ser deixadas descobertas em condições estéreis para deixar o líquido de superfície secar. O tempo que isso leva pode ser altamente variável, dependente de condições ambientais e da condição das placas. Desta vez deve ser minimizado, mas pode ser de até várias horas.

O ensaio de flutuação tem restrições inerentes. Ele diz marcadores phenotipicos de mutação apenas em um pequeno subconjunto do genoma. O ensaio exige assim as grandes populações que atravessam um número suficiente de gerações observar bastante mutações para estimar uma taxa de todo. Isto significa que os ensaios de flutuação só podem ser usados em organismos que são capazes de passar por um grande número de gerações rapidamente, como bactérias, levedura de padeiro⁴², ou células de mamíferos de cultura líquida³⁰. Além disso, mutações são eventos raros que ocorrem nas circunstâncias bioquímicas específicas de uma determinada célula. O fato de que os ensaios de flutuação olhar através de grandes populações de células ao longo do tempo significa que essas circunstâncias podem diferir substancialmente. Usando este ensaio, é assim difícil estudar a progressão das taxas de mutação de uma população particular da fase da retardação à fase exponencial adiantada e atrasada e finalmente a uma fase estacionária. Qualquer diferenciação das taxas de mutação entre as células únicas dentro da população está completamente oculta do ensaio de flutuação. A dinâmica da mutação unicelular pode ser estudada com um rastreamento de molécula única da proteína de reparo de DNA MutS⁴³ ou contando focos de proteínas MutL acumuladas⁴⁴. Os recentes avanços no sequenciamento de alta taxa de taxas de alta taxa também tornaram possível estimar diretamente as taxas de mutação dos trios pais-descendentes^9,45 e pedigrees multigeração⁴⁶. Tais avanços metodológicos estão começando a permitir a contagem direta de mutações que ocorrem dentro de uma única geração. No entanto, essa abordagem direta precisa de tecnologias caras e de última geração, como microscopia de fluorescência, microfluídica ou sequenciamento de genoma inteiro. Por outro lado, o ensaio de flutuação é relativamente barato e apenas equipamentos laboratoriais padrão são necessários. Fazer mais ensaios de flutuação também facilitará a geração de novas hipóteses que podem ser testadas com abordagens unicelulares mais diretas.

Há um interesse de longa data no estudo de mutações, de modo que o ensaio de flutuação provavelmente continuará a ser um método amplamente utilizado. O número de citações do artigo seminal de Luria e Delbrück⁵ nos últimos 4 anos (2015-2018) estão entre os cinco primeiros para citações deste artigo. No entanto, devido a uma grande quantidade de trabalho manual preciso necessário para realizar adequadamente um ensaio de flutuação, a maioria dos estudos apenas realizar um punhado de ensaios de flutuação. Isto, entretanto, é insuficiente revelar as dependências ambientais da taxa da mutação. Ao simplificar os ensaios de flutuação usando placas multiwell, como explicado neste artigo, a taxa de pagamento máxima atual possível é de 11 placas de poços profundos (55 ensaios de flutuação) em paralelo, conforme descrito aqui. Executar dois conjuntos de ensaios de flutuação escalonados por um dia em paralelo, permite a realização de até 110 ensaios por semana. Outra mudança de etapa na entrada ainda pode ser possível automatizando várias etapas dos ensaios de flutuação do protocolo puramente manual dado. Além disso, para estudar as dependências ambientais da taxa de mutação, a densidade populacional precisa ser levada em conta. Resultados anteriores¹⁰ mostram que, quando fatores conhecidos que afetam a taxa de mutação são contabilizados, o controle da densidade populacional pode reduzir a variação nas estimativas da taxa de mutação em mais de 90%. Para controlar a densidade, recomendamos que o T_N (usado para estimar a taxa de mutação) seja determinado independentemente do método usado para determinar a densidade populacional. Em bactérias, N_t pode ser determinado pela CFU e densidade, por exemplo, com um ensaio de luminescência à base de ATP¹⁰.

A alta produtividade e a densidade de controle são essenciais ao estudar como o contexto ecológico de um organismo afeta a taxa de mutação espontânea. Conhecer a existência da plasticidade da taxa de mutação é importante, mas compreender suas causas e efeitos são desafios-chave que precisam ser atendidos para que a plasticidade da taxa de mutação seja incorporada em um contexto biológico mais amplo. O ensaio de flutuação é uma grande ferramenta que pode ser usada para testar muitas hipóteses, porque os resultados são obtidos rapidamente, e os ensaios são baratos em relação a outros métodos. O cenário está configurado, por exemplo, para estudar as dependências ambientais da taxa de mutação em comunidades bacterianas e microbiomas. Adaptar o ensaio de flutuação às coculturas pode testar a hipótese de que as cepas influenciam as taxas de mutação uns dos outros através de pequenas moléculas. Fazer milhares de ensaios de flutuação com coculturas pode determinar se as cepas variam tanto em sua capacidade de modificar as taxas de mutação uns dos outros e em sua susceptibilidade de ter sua taxa de mutação modificada por outros. Talvez a variação entre as tensões na susceptibilidade à manipulação da taxa de mutação seja atribuível à variação genética específica. Isso pode transformar nossas opiniões sobre como a evolução funciona em comunidades complexas, não menos importante em exemplos de grande importância, como a forma como a resistência antimicrobiana emerge.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Tubos de microcentrífuga de 1,5 mL	Starlab International GmbH	S1615-5550
Cloreto de 2,3,5-trifeniltetrazólio	Sigma-Aldrich	T8877-10g
Placas de 6 poços	Greiner Bio-One	REF 657102
90 mm Placas de Petri Tripla Ventilada	ThermoFisher Scientific	REF 120189
96 placa de poço profundo (Masterblock 2 mL)	Greiner Bio-One	REF 780270
Sulfato de amônio	Fisher Chemical	A / 6440/53
Bacto Agar	Becton, Dickinson and Company	REF 214010
Extrato de levedura Bacto	Becton, Dickinson and Company	REF 212750
Cycloserine	Sigma-Aldrich	1158005-250MG	Apenas para testar um marcador fenotípico alternativo
D-Glucose anidro	Fisher Chemical	G/0500/61
Tubo de Centrífuga de 50 mL	Corning	REF 430828
L-(+)-Arabinose	Sigma-Aldrich	A3256-500g
Sulfato de magnésio heptahidratado	Fisher Chemical	M/1050/53
Ácido nalidíxico	Sigma-Aldrich	N8878-5G	Apenas para testar uma alternativa marcador fenotípico
Fosfato de potássio dibásico trihidratado	Sigma-Aldrich	P5504-500g
Fosfato de potássio monobásico	Sigma-Aldrich	P0662-500g
Rifampicina	EMD Millipore Corp, EUA	557303-1GM
Cloreto de sódio	Fisher Chemical	S / 3160/60
Espectrofotômetro	Jenway	6320D
Cloridrato de tiamina	Sigma-Aldrich	T4625-25g
Citrato trissódico di-hidratado	Sigma-Aldrich	S1804-500g
Triptona	Fisher Chemical	1278-7099