Artigo de método

Microscopia de tração integrada com Microfluidics para migração coletiva Chemotactic

DOI:

10.3791/60415

⸱

13 de outubro de 2019

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Sciences, Korea University, 2Department of Mechanical Engineering, Korea Advanced Institute of Science and Technology, 3Department of Environmental Health, Harvard T.H. Chan School of Public Health

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Migração de células coletivas em desenvolvimento, cicatrização de feridas e metástase oncológica é muitas vezes guiada pelos gradientes de fatores de crescimento ou moléculas de sinalização. Descrito aqui é um sistema experimental que combina microscopia de tração com um sistema microfluídico e uma demonstração de como quantificar a mecânica da migração coletiva gradiente bioquímico.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

As células alteram os padrões de migração em resposta a estímulos químicos, incluindo os gradientes dos estímulos. A migração celular na direção de um gradiente químico, conhecida como quimiotaxia, desempenha um papel importante no desenvolvimento, na resposta imune, na cicatrização de feridas e na metástase do câncer. Enquanto a quimiotaxia modula a migração de células simples, bem como coleções de células in vivo, in vitro pesquisa centra-se em quimiotaxis de uma única célula, em parte devido à falta de ferramentas experimentais adequadas. Para preencher essa lacuna, descrita aqui é um sistema experimental único que combina microfluídica e micropadronização para demonstrar os efeitos de gradientes químicos na migração de células coletivas. Além disso, a microscopia de tração e a microscopia de estresse monocamada são incorporadas ao sistema para caracterizar mudanças na força celular no substrato, bem como entre as células vizinhas. Como prova de conceito, a migração de ilhas circulares micromodeladas de células de rim canino Madin-Darby (MDCK) é testada um gradiente de fator de crescimento de hepatócitos (HGF), um fator de espalhamento conhecido. Encontra-se que as pilhas situadas perto da concentração mais elevada de HGF migram mais rapidamente do que aquelas no lado oposto dentro de uma ilha da pilha. Dentro da mesma ilha, a tração celular é semelhante em ambos os lados, mas o estresse intercelular é muito menor no lado da maior concentração de HGF. Este novo sistema experimental pode proporcionar novas oportunidades para estudar a mecânica da migração quimotáxica por coletivas celulares.

Introdução

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A migração celular em sistemas biológicos é um fenômeno fundamental envolvido na formação de tecidos, na resposta imune e nacicatrização de feridas1,2,3. A migração celular também é um processo importante em algumas doenças como o câncer4. As células geralmente migram como um grupo em vez de individualmente, o que é conhecido como migração de célula coletiva4,5. Para que as células se movam coletivamente, a detecção do microambiente é essencial6. Por exemplo, as células percebem estímulos físico-químicos e respondem alterando a motilidade, interações entre células e células, resultando em migração direcional aolongo de umgradiente químico7,8, 9,10. Baseado nesta conexão, os avanços rápidos foram feitos nas tecnologias Lab-on-a-chip que podem criar microambientes químicos bem controlados tais como o inclinação de um chemoattractant11,12,13 . Quando estes microfluídica Lab-em-um-chip-baseados tiverem sido usados previamente para estudar quimiotaxia do Ensemble celular ou dos esferoides celulares14,15,16,17, têm sido utilizados principalmente no contexto da migração de uma única célula18,19,20,21. Os mecanismos subjacentes a uma resposta coletiva celular a um gradiente químico ainda não são bem compreendidos14,22,23,24,25,26 . Assim, o desenvolvimento de uma plataforma que possibilite o controle espaciotemporal dos fatores solúveis, bem como a observação in situ das células biofísicas ajudarão a desvendar os mecanismos por trás da migração de células coletivas.

Desenvolvido e descrito aqui é um sistema microfluídico multicanalizado que possibilita a geração de um gradiente de concentração de fatores solúveis que modulam a migração de aglomerados de células padronizadas. Neste estudo, o fator de crescimento de hepatócitos (HGF) é escolhido para regular o comportamento migratório das células do rim canino de Madin-Darby (MDCK). HGF é conhecido por atenuar a integridade celular e aumentar a motilidade das células27,28. No sistema microfluídico, a microscopia de tração da transformada de Fourier e a microscopia de tensão monocamada também são incorporadas, o que permite a análise da motilidade, da força contrátil e da tensão intercelular induzida pelas células constituintes em resposta a um HGF Gradiente. Dentro da mesma ilha, as células localizadas perto da maior concentração de HGF migram mais rápido e apresentam níveis de estresse intercelulares inferiores aos do lado com menor concentração de HGF. Os resultados sugerem que este novo sistema experimental é adequado para explorar outras questões em áreas envolvendo migração celular coletiva gradientes químicos de vários fatores solúveis.

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Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nota: litografia de moldes SU-8 para Estênceis (espessura = 250 μm) e partes de microcanais (espessura = 150 μm), gravura em vidro (profundidade = 100 μm) e fabricação de elenco foram terceirizadas enviando projetos usando software de design assistido por computador para os fabricantes.

1. fabricação do estêncil do polidimetilsiloxano (PDMS) e do Microchannel

  1. Projete o micropadrão do estêncil e do microchannel.
  2. Fabricar ou terceirizar os moldes SU-8 (espessura de ~ 250 μm para stencils e ~ 150 μm para microcanais) em wafers de silício (4 "de diâmetro).
  3. Prepare a mistura de PDMS misturando o elastómetro baixo e o agente de cura em uma relação de 10:1.
    1. Coloque 15 mL do elastômero de base num tubo cónico de 50 mL e adicione 1,5 mL de agente de cura. Prepare dois destes.
    2. Vórtice a mistura PDMS por 5 min. Centrifugue a mistura PDMS a 196 x g durante 1 min para remover as bolhas.
  4. Para fabricar o estêncil de PDMS, derrame ~ 1 mL da mistura de PDMS na bolacha, ao evitar as regiões modeladas SU-8 de modo que o PDMS toque o lado dos pilares SU-8 mas não a parte superior do teste padrão SU-8.
    1. Coloque a bolacha sobre uma superfície plana por mais de 30 min à temperatura ambiente (RT). Cure o PDMS em um forno seco a 80 ° c por mais de 2 h.
    2. Descasque com cuidado o PDMS do molde SU-8 e apare a membrana fina de PDMS usando um perfurador oco de 14 milímetros. Retire a poeira na superfície das peças PDMS usando fita adesiva e autoclave os stencils PDMS.
  5. Para fabricar o microcanal PDMS, despeje ~ 30 mL de mistura PDMS sobre o molde SU-8.
    1. Degas por 30 min em uma câmara de vácuo e curar o PDMS em um forno seco a 80 ° c por mais de 2 h.
    2. Descasque com cuidado o PDMS do molde SU-8 e corte o PDMS a um tamanho de 24 milímetros x 24 milímetros. Em cada bloco de PDMS, crie uma tomada e três entradas usando um perfurador da biópsia de 1 milímetro.

2. preparação de vidro inferior com gel de poliacrilamida (PA)

  1. Fabricar ou terceirizar vidros de slides retangulares (24 mm x 24 mm x 1 mm) com um micro-poço retangular (6 mm x 12 mm, 100 μm de profundidade29) por óculos de corte e gravura.
  2. Silanize a superfície de um vidro inferior30.
    1. Prepare uma solução de silano de ligação misturando 200 mL de água deionizada (DIW), 80 μL de ácido acético e 50 μL de 3-(trimetoxisililo) de metacrilato de propilo (TMSPMA) por 1 h.
      PRECAUÇÃO: o TMSPMA é um líquido combustível. Siga as recomendações em fichas de dados de segurança de material. Use apenas em uma capa de fumaça química.
    2. Retire a poeira da superfície do vidro por fita adesiva e autoclave do vidro.
    3. Cubra a superfície gravada do vidro inferior com 100 μL da solução de silano de ligação e deixe o vidro na RT durante 1 h.
    4. Enxague o vidro com DIW 3x e deixe o vidro secar à temperatura do ar ambiente ou soprando ar.
  3. Prepare uma solução de gel para o gel de PA31.
    1. Prepare uma solução fresca de 0,5% (w/v) de persulfato de amônio (APS) dissolvendo 5 mg de APS em 1 mL de DIW.
    2. Prepare a solução de gel PA constituída por 138 μL de solução de acrilamida a 40%, 101 μL de solução de 2% de bis-acrilamida, 5 μL de solução de partículas fluorescentes (0,2 μm) e 655 μL de DIW.
      Atenção: as soluções de acrilamida e bisacrilamida são tóxicas. Use luvas de proteção, roupas e proteção ocular. Proteja a solução do gel do PA que contem partículas fluorescentes da luz.
      Nota: vórtice a solução de cordão fluorescente antes de introduzir pipetagem para obter um número uniforme de grânulos fluorescentes por lote.
    3. Depois de adicionar 100 μL da solução APS e 1 μL de tetrametilenodiamina (TEMED), transfira 10 μL de solução de gel mista para o micro-poço retangular e coloque no topo uma cobertura circular (18 mm).
      Nota: para encher o vidro inferior com gel de PA sem bolhas, coloque solução de gel suficiente na ranhura do vidro inferior, deslize cuidadosamente a lamínula sobre a solução de gel e retire qualquer solução em excesso de gel.
      Cuidado: o gel é curado lentamente por aproximadamente 40 min. O procedimento a seguir para os géis de centrifugação deve ser efectuado o mais rapidamente possível.
    4. Vire a montagem de vidro personalizado, solução de gel, e lamínula, em seguida, centrifugar por 10 min em 96 x g para trazer partículas fluorescentes para a camada superior de gel PA.
    5. Retire a montagem da centrífuga e coloque-a sobre a superfície plana com a lamínula virada para baixo.
      Nota: começando com a etapa 2.3.6, manipule amostras em um gabinete de biossegurança.
    6. Após 30 min, vire o conjunto e coloque-o em uma placa de Petri de 35 mm, encha com 2 mL de DIW, e (usando fórceps) retire suavemente a lamínula deslizando-a para um lado.
      Nota: o gel curado do PA pode ser armazenado em DIW por 1 mês. No entanto, uma vez que o colágeno é revestido no gel PA, ele deve ser usado em um experimento dentro de 1 dia.
  4. Revestimento de colágeno no gel PA.
    1. Dissolver 1 mg/mL de sulfosuccinimidyl 6-(4 '-azido-2 '-nitrophenylamino) hexanoato (sulfo-SANPAH) em warm 50 mM HEPES buffer. Soltar 200 μL da solução na superfície do gel e ativar por luz UV (comprimento de onda de 365 nm) durante 10 min.
      Nota: Proteja o sulfo-SANPAH da luz.
    2. Enxague o gel com 0,1 M [4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazineetanoesulfonic acid; HEPES] buffer 2x e com PBS 1x.
    3. Coat o gel do PA com solução do colagénio (100 μg/mL em PBS, tipo I do colagénio da cauda do rato) em 4 ° c durante a noite. No dia seguinte, lave com PBS 3x.

3. micropatterning de consoles da pilha

  1. Prepare a solução F-127 (tabela de materiais) [2% (p/v) em PBS] e mergulhe o estêncil PDMS autoclavado na solução f-127. Mantenha-o em uma incubadora de 37 ° c por 1 h.
  2. Prepare a solução da pilha (2 x 106 Cell/ml) nos meios de cultura da pilha que consistem em: Dulbecco ' s modificou o meio da águia (DMEM) com o soro bovino fetal de 10% (FBS) e o antibiótico-antimycotic de 1% (AA).
  3. Lave o estêncil de PDMS com PBS 3x e remova o líquido do estêncil de PDMS e do gel do PA. Coloc o estêncil de PDMS no gel do PA e adicione o PBS ao estêncil.
  4. Remova as bolhas nos furos do estêncil de PDMS pipetando delicadamente. Depois de remover bolhas, remova o PBS da superfície do estêncil PDMS.
  5. Após ter põr 200 μL da solução da pilha no estêncil de PDMS, mantenha o gel do PA em uma incubadora para 1 h de modo que as pilhas anexem ao gel do PA.
  6. Lave delicadamente a solução da pilha com meios de cultura da pilha, remova o estêncil de PDMS, e adicione mais meios da cultura de pilha. Verifique a formação de ilhas de células um microscópio.

4. montagem do gel do PA com Microchannel de PDMS

  1. Remova a poeira no Microchannel de PDMS usando a fita adesiva, então autoclave.
  2. Trate a superfície do Microchannel de PDMS com plasma do oxigênio (80 W, 50 quilohertz) para 30 s.
  3. Após ter removido todo o líquido no vidro inferior gel-enchido PA, coloc o Microchannel de PDMS sobre o vidro inferior e põr o conjunto sobre o suporte de vidro feito encomenda.
  4. Preencha o microcanal com meio de cultura celular.
    Cuidado: Certifique-se de remover todas as bolhas presas nos canais, liberando suavemente a mídia morna com uma pipeta. Além disso, ao remover bolhas, certifique-se de não desanexar ilhas de células micromodeladas.

5. sistema microfluídico integrado

  1. Ligue os Tubings.
    1. Prepare os conectores cortando a ponta das agulhas (18 G) e dobrando-a 90 °.
    2. Prepare linhas de tubulação para três entradas e uma tomada.
      1. Para a tubulação da entrada, conecte a agulha aparada e uma linha do mini-volume de 30 cm com uma torneira de três sentidos. Prepare três destes.
      2. Para tubos de saída, conecte a agulha aparada e uma linha de mini volume de 75 cm com uma torneira de três vias. Prepare um desses.
      3. Encha as tubulações com o meio que foi pré-aquecido por 1 h.
        PRECAUÇÃO: Certifique-se de que remove todas as bolhas presas nas linhas da tubagem, liberando suavemente os suportes quentes com uma seringa.
    3. Prepare reservatórios removendo os êmbolos das seringas e conectando as linhas da tubulação de entrada.
    4. Conecte os conectores da agulha de cada linha de tubulação nas três entradas e uma saída do dispositivo microfluídico.
  2. Encha os reservatórios com 3 mL de meio fresco ou meio condicionado cada.
    1. Para o teste de gradiente, encha o reservatório de entrada à esquerda com 20 ng/mL de HGF no meio de cultura celular.
    2. Para a visualização do gradiente de concentração, adicione um corante fluorescente de 200 μg/mL (rodamina B-Dextran, 70 kDa) ao reservatório de entrada esquerdo.
    3. Ligue a linha da tubagem de saída a uma bomba de seringa.
      Nota: o modo de funcionamento da bomba da seringa é "retirada". A taxa de fluxo é mudada de acordo com a capacidade da seringa e da velocidade de funcionamento da bomba da seringa.
  3. Coloque o sistema microfluídico integrado no estágio de um microscópio epifluorescente convencional.
    Cuidado: para gerar um gradiente suave de HGF no canal microfluídico, a vazão deve ser tão lenta quanto 0,1 μL/min. Isto é suficientemente sensível de modo que exija a estabilização para 2 h, e o cuidado deve ser tomado para evitar o distúrbio físico durante o experimento.

6. aquisição de imagens

  1. Tirar imagens a cada 10 min para até 24 h usando um microscópio automatizado alojado em uma incubadora. Em cada timepoint, tome um jogo das imagens usando uma lente objetiva 4x em três canaletas diferentes, incluindo a imagem da fase para visualizar a migração da pilha, a imagem fluorescente verde para visualizar os grânulos fluorescentes incorporados no gel do PA, e a imagem fluorescente vermelha para Visualizar gradiente de concentração de um produto químico.
  2. Depois de tomar imagens de lapso de tempo, inutilizar 0,25% Trypsin-solução de EDTA em microcanais para separar as células do gel de PA. Depois de remover completamente as células do gel, tome uma imagem fluorescente verde para ser usado como uma imagem de referência para microscopia de tração.

7. análise de dados

Nota: um código personalizado para análise de dados foi desenvolvido usando o MATLAB, e detalhes foram descritos em outros lugares32,33,34,35,36.

  1. Para análise de imagem de fase, calcule deslocamentos em duas imagens de fase consecutivas usando a velocimetria de imagem de partícula36.
  2. Para a microscopia de tração de transformada de Fourier, compare cada imagem fluorescente verde com a imagem de referência e calcule os deslocamentos em cada imagem usando a velocimetria de imagem de partícula36. Dos deslocamentos, recupere a tração feita por pilhas no gel do PA usando a microscopia da tração da transformação de Fourier33,34,37.
  3. A partir dos dados de tração, calcule o estresse dentro da monocamada da ilha da célula usando a microscopia de tensão monocamada com base nos métodos de elementos finitos32,34,38.

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Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Para explorar a migração coletiva gradiente químico, foi integrado um sistema microfluídico com microscopia de tração (Figura 1). Para construir o sistema integrado, o gel do poliacrilamida (PA) foi fundido no vidro do costume-corte, e as pilhas de MDCK foram semeadas dentro das Ilhas micromodeladas feitas por um estêncil de PDMS. Para este experimento, foram criadas doze ilhas de células MDCK (quatro fileiras por três colunas, diâmetro de ~ 700 μm). Após células anexadas a géis PA, o estênc...

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Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A migração coletiva das células constituintes é um processo importante durante o desenvolvimento e a regeneração, e a direção migratória é muitas vezes guiada pelo gradiente químico dos fatores de crescimento4,23. Durante a migração coletiva, as células mantêm a interação com células vizinhas e substratos subjacentes. Tais interações mecânicas dão origem a fenômenos emergentes, como durotaxis42, plithotaxis33e kenot...

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Divulgações

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Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de pesquisa da Coréia (NRF) subvenção financiada pelo governo coreano (MSIP) (não. NRF-2017R1E1A1A01075103), Korea University Grant e o programa BK 21 Plus. Também foi apoiado pelos institutos nacionais de saúde (U01CA202123, PO1HL120839, T32HL007118, R01EY019696).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
0,25% de tripsina-EDTA (1X)Gibco25200-056
Solução tampão HEPES 1 MGibco15630-056
Punção de biópsia de 1 mmIntegra Miltex33-31AA-P/25
Placas de Petri de 100 mmSPL10100 100mm de diâmetro, 15 mm de altura
14 mm de punção ocaILJIN124-0571
18 mm Ø LamínulaMarienfeld-Superior111580Circular 18 mm, espessura nº 1 (0,13 a 0,16 mm)
Solução de bisacrilamida a 2%Bio-Rad1610142Use luvas de proteção, roupas e proteção para os olhos.
3-(Trimetoxissilil)metacrilato de propila (TMSPMA)Sigma-Aldrich440159-500ML
torneira de 3 viasHyupsungHS-T-61NCUIDADO: não use se tiver sido aberto anteriormente. não reesterilizar ou reutilizar
linha de volume mínimo de 30 cm (para pediátrica)HyupsungHS-MV-30CUIDADO: não use se tiver sido aberto anteriormente. não reesterilizar ou reutilizar
placa de cultura de células de 35 mmCorning
Solução de Acrilamida a 40%Bio-Rad1610140Use luvas, roupas e proteção para os olhos.
Linha de volume mínimo de 75 cm (para pediatria)HyupsungHS-MV-75CUIDADO: não use se tiver sido aberto anteriormente. não reesterilizar ou reutilizar
ácido acéticoJ.T. BakerJT9508-03
Persulfato de amônio (APS)Bio-Rad1610700
Antibiótico-AntimicóticoGibco15240-062
Chip de vidro inferiorMicroFIT24 x 24 x 1 mm, feito sob medida, ranhura retangular (6 x 12 mm, profundidade: 100 μ m)
Colágeno tipo I, cauda de ratoCorning354236
Suporte de vidro personalizadoHan-Gug Mecatrônicafeito
Meio de águia modificado de Dulbecco (DMEM)WelgeneLM 001-11
salina tamponada com fosfato de Dulbecco (PBS)BiowestL0615-500sem magnésio,
cálcio Soro bovino fetal (FBS)Gibco26140-179
FluoSpheres microesferas modificadas com aminaInvitrogenF87640.2 µ m, fluorescente amarelo-esverdeado (505/515)
Fator de crescimento de hepatócitos (HGF)Sigma-AldrichH1404-5UGrecombinante,
sistema de imagem de células vivas em estágio JuLINanoEnTek Emestágio X-Y-Z automatizado e imagem de imagem fluorenviada Compatível com incubadora (37 ° C e 5% CO2)
Madin-Darby Canine Kidney (MDCK)tipo II
Sistema de plasma de oxigênioFemto ScienceCUTE-MPR
Pluronic F-127Sigma-AldrichP2443-250G
Rodamina B isotiocianato– dextranoSigma-AldrichR9379-100MG70 kDa, usado para estimar a distribuição espaço-temporal de HGF no canal microfluídico
Agulha hipodérmica estéril 18 GKOVAXApare a ponta da agulha e dobre-a 90 graus para conectar as portas de entrada/saída com linha de volume
Fita adesiva3M/Scotch810D33 m x 19 mm
SU-8 moldes mestresMicroFIT4" de diâmetro,
sulfosuccinimidil 6-(4'-azido-2'-nitrofenilamino)hexanoato (Sulfo-SANPAH)Thermo Scientific22589Conservar a -20°C. Conservar protegido da humidade e da luz.
Kit de Elastômero Sylgard 184Dow CorningPDMS
Bomba de seringaChemyx Inc.modelo fusion 720retirar fluido
SeringasKOVAX1, 3, 5, 10 ou 50 cc para uso reservatório de entrada ou bomba de seringa de saída
tetrametiletilenodiamina (TEMED)Bio-Rad1610800Use luvas de proteção, roupas e proteção para os olhos.
Lâmpada ultravioleta (UV)UVPLLC 95-0248-02comprimento de onda de 365 nm
430165sob medida Solução humano

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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