Sistema centrífuga de contrafluxo automatizado para processamento de células em pequena escala

Resumo

A automação é fundamental para aumentar o dimensionamento e o gerenciamento de custos na fabricação de células. Este manuscrito descreve o uso de um dispositivo de processamento de células centrífugas de contrafluxo para automatizar as etapas de troca de buffer e concentração de células para o bioprocessamento em pequena escala.

Resumo

A comercialização bem-sucedida de terapias gênicas e celulares requer processos de fabricação que sejam econômicos e escaláveis. A troca de buffers e a concentração de produtos são componentes essenciais para a maioria dos processos de fabricação. No entanto, nos estágios iniciais do desenvolvimento do produto, essas etapas são muitas vezes executadas manualmente. A centrífuga manual sem saída para a troca de buffers é trabalhosa, cara e não escalável. Um sistema automatizado fechado pode efetivamente eliminar essa etapa trabalhosa, mas a implementação pode ser desafiadora. Aqui, descrevemos um dispositivo de processamento de células recém-desenvolvido que é adequado para processamento de células de pequena a média escala e visa preencher a lacuna entre processamento manual e automação em larga escala. Este protocolo pode ser facilmente aplicado a vários tipos e processos celulares, modificando a taxa de fluxo e a velocidade de centrífuga. Nosso protocolo demonstrou a recuperação elevada da pilha com uns tempos de processamento mais curtos em comparação ao processo manual. As células recuperadas do processo automatizado também mantiveram suas taxas de proliferação. O dispositivo pode ser aplicado como um componente modular em um processo de fabricação fechado para acomodar etapas tais como a troca do amortecedor, a formulação da pilha, e a criopreservação.

Introdução

A paisagem da medicina moderna transformou-se rapidamente através de desenvolvimentos recentes em terapias genéticas e celulares (GCT). Como um dos campos que mais cresce na pesquisa translacional, o setor gct também enfrenta desafios únicos e sem precedentes. Além de resultados clínicos robustos, processos de fabricação eficientes e econômicos são essenciais para o sucesso comercial da GCT, que é particularmente difícil de alcançar na fabricação de pequena escala^1. O custo do tempo, do trabalho e das garantias de qualidade são ampliados quando cada lote de células produz apenas algumas doses para um paciente em vez de centenas ou milhares. Ao ....

Protocolo

1. Preparação de reagentes e células para troca de buffer

1. Prepare amortecedores (ver Tabela de Materiais)em uma capa de fluxo laminar classe 2. Usando uma seringa e montagem de agulhas, retire 50 mL de solução saline de um saco shinhol de 500 mL. Substitua isso por 50 mL de 20% albumina soro humano (HSA) para fazer 2% HSA em soro fisiológico, que servirá como o tampão de lavagem.
2. Retire as células dos vasos de cultura e realizar uma contagem celular para determinar a quantidade de células iniciais e viabilidade por exclusão trypan azul. Carregue as células em um saco de transferência.
   NOTA: Neste protocolo as células Jurkat fora....

Resultados

Neste protocolo, usamos células Jurkat e MSCs como exemplos representativos para demonstrar o processo automatizado de troca de buffers. Durante o processo, as células Jurkat e os MSCs compartilharam as mesmas etapas de processamento com diferenças na força centrífuga e na velocidade da bomba que controlam a taxa de fluxo(Tabela 1). A Figura 2 mostra imagens representativas capturadas pela câmera de como o leito celular fluido pode aparecer durante o processo de troca de buf.......

Discussão

O protocolo automatizado de troca de buffer descrito é simples e amigável. No entanto, existem alguns passos-chave neste protocolo que são críticos e exigem especial atenção. Em nossa experiência, ao processar células maiores, como MSCs (diâmetro médio de 10 a 15 μm), cada corrida deve incluir pelo menos 1 x 10⁷ células para alcançar a recuperação ideal de células(Figura 4B). O processamento de células menores, como as células Jurkat (média de ~ 10 μm de diâmetro).......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Seringas Luer lock de 20 ml	BD	302830
20% de albumina sérica humana (HSA)	CSL Behring	AUST R 46283
4- (Dimetilamino) benzaldeído	Sigma-Aldrich	156477-25g
500ml IV saco de solução salina	Fresenius Kabi	K690521
Antibiótico-Antimicótico	Thermo Fisher Scientific	15240112
Contador de células automatizado (Condessa)	Thermo Fisher Scientific	N/A
Lâminas de câmara de contagem de células	Thermo Fisher Scientific	C10228
Coquetel de estimulação celular (500x)	Thermo Fisher Scientific	00-4970-93
Bolsas de transferência de células	Terumo	T1BBT060CBB
CellTiter AQueous One Solution Cell Proliferation Assay (MTS)	Centrífuga Promega	G3582
	Eppendorf	5810R
DMEM: Mídia F12	Thermo Fisher Scientific	11320082
EnVision Leitor de placas	Perkin Elmer	N/A
Soro fetal bovino (FBS)	Kit Thermo Fisher Scientific	10099141
Interleucina Humana 2 (IL2)	Perkin Elmer	Al221C
Acessórios Luer (fêmea)	CPC	LF41
PC laptop ou tablet PC ASUS		N/A
Leitor de placas (SpectraMax i3)	Dispositivo molecular	N/A
IFN humano recombinante-&gama;	PeproTech	300-02
Dispositivo de processamento de células de centrífuga de contrafluxo Rotea	Scinogy	N/A
Kit de processamento descartável Rotea	Scinogy	N/A
RPMI mídia	Thermo Fisher Scientific	11875119
Tesoura cirúrgica	ProSciTech	420SS
Ácido tricloroacético	Sigma-Aldrich	T6399-250g
Trypan Blue mancha	Thermo Fisher Scientific	T10282
Enzima de digestão de tripsina (Enzima TrypLE Express)	Thermo Fisher Scientific	12604013