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Artigo de método

Bioink extracelular derivado da matriz de tecido sipâncreas para a impressão de construções de tecidopanpático 3D Carregadas de células

10.6K vistas

DOI:

10.3791/60434

13 de dezembro de 2019

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

A matriz extracelular descelularizada (dECM) pode fornecer pistas microambientais adequadas para recapitular as funções inerentes dos tecidos-alvo em uma construção projetada. Este artigo elucida os protocolos para a descelularização do tecido pancreático, avaliação do bioink dECM derivado do tecido pancreático e geração de construções de tecidopanpático 3D usando uma técnica de bioimpressão.

Resumo

O transplante de ilhotas pancreáticas é um tratamento promissor para pacientes que sofrem de diabetes tipo 1 acompanhado sofrem de hipoglicemia e complicações secundárias. No entanto, o transplante de ilhotas ainda tem várias limitações, como a baixa viabilidade das ilhotas transplantadas devido ao mau enxenxerto de ilhotas e ambientes hostis. Além disso, as células produtoras de insulina diferenciadas das células-tronco pluripotentes humanas têm capacidade limitada de secretar hormônios suficientes que podem regular o nível de glicose no sangue; Portanto, melhorar a maturação, cultivando células com pistas microambientais adequadas é fortemente necessária. Neste artigo, elucidamos protocolos para a preparação de um biotilétil de matriz extracelular descelular descelular (pdECM) derivado do tecido pancreático para fornecer um microambiente benéfico que pode aumentar a sensibilidade à glicose das ilhotas pancreáticas, seguida pela descrição os processos para a geração de tecidos pancreáticos 3D são construídos por meio de uma técnica de bioimpressão baseada em microextrusão.

Introdução

Recentemente, o transplante de ilhotas pancreáticas tem sido considerado um tratamento promissor para pacientes com diabetes tipo 1. A segurança relativa e a invasidão mínima do procedimento são grandes vantagens deste tratamento1. No entanto, tem várias limitações, como a baixa taxa de sucesso de ilhotas isolante e os efeitos colaterais das drogas imunossupressoras. Além disso, o número de ilhotas enxertadas diminui de forma constante após o transplante devido ao ambiente hostil2. Vários materiais biocompatíveis, como alginato, colágeno, poli (ácido láctico-coglicólico) (PLGA) ou polietilenoglicol (PEG) foram aplicados ....

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Protocolo

Tecidos pancreáticos suínos foram coletados de um matadouro local. Experimentos com animais foram aprovados pelo Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) do Asan Medical Center, Seul, Coréia.

1. Descelularização de tecidos

  1. Prepare as soluções para a descelularização.
    NOTA: 1x fosfato-buffered soro lógico (PBS) usado em todos os preparativos de solução é diluído pela adição de água destilada para 10x PBS.
    1. Para a solução Triton-X 100 de 1%, dissolva 100 mL de 100% de solução Triton-X 100 em 900 mL de 1x PBS usando uma barra de agitação magnética com a agitação a 150 rpm para 6 h. Faça 400 mL de 1% Triton-X 100 ....

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Resultados

Descelularização dos tecidos pancreáticos
Desenvolvemos o processo de preparação de biotilidade pdECM para fornecer microambientes específicos de tecido pancreático para melhorar a funcionalidade das ilhotas em uma construção de tecido bioimpresso 3D (Figura 2A). Após o processo de descelularização, 97,3% do dsDNA foi removido e os componentes representativos da ECM, como colágeno e GAGs, permaneceram em 1278,1% e 96,9% em.......

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Discussão

Este protocolo descreveu o desenvolvimento de bioinks pdECM e a fabricação de construções de tecidopanpático 3D usando técnicas de impressão de células 3D. Para recapitular o microambiente do tecido alvo na construção de tecidos projetados em 3D, a escolha do bioink é fundamental. Em um estudo anterior, validamos que bioinks de dECM específicos do tecido são benéficos para promover a diferenciação de células-tronco e proliferação10. Em comparação com polímeros sintéticos, o dECM pode servir como u.......

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Agradecimentos

Esta pesquisa foi apoiada pelo programa de Desenvolvimento de Biotecnologia e Tecnologia Médica da National Research Foundation (NRF) financiado pelo governo coreano (MSIT) (2017M3A9C6032067) e "ICT Consilience Creative Program" (IITP-2019-2011-1-00783) e "ICT Consilience Creative Program" (IITP-2019-2011-1-00783) supervisionado pelo IITP (Institute for Information & Communications Technology Planning & Evaluation).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Armários de Segurança BiológicaCRYSTEPURICUBE 1200
Deep FreezerThermo Scientific Forma957
Agitador orbital digitalDAIHAN ScientificDH.
Forno secoDAIHAN ScientificWON-155
LiofilizadorLABCONCO7670540
GeladeiraSANSUNGCRFD-1141
RaladorABM1415605793
Microscópios invertidosLeicaDMi1
MicrocentrífugaCRYSTEPURISPIN 17R
Leitor de microplacasThermo Fisher ScientificMultiskan GO
Mini centrífugaDAIHAN ScientificCF-5
Agitadores de placa multi-aquecimentoDAIHAN ScientificSMHS-6
NanodropThermo Fisher ScientificND-LITE-PR
medidor de bancada de pHThermo Fisher ScientificSTARA2110
RheometerTA InstrumentDiscovery HR-2
DAIHAN ScientificVM-10
Cirurgical Instruments
Tesoura de operaçãoHiroseHC.13-122
FórcepsCoreia Ace ScientificHC.203-30
Materiais
Tubo de microcentrífuga de 1,7 mLAxygenMCT-175-C
frasco de vidro de 10 mlScilabSL. VI1243
40 µ filtro de célula mFalcon352340
Copo de 5 LDong Sung ScienceSDS 2400
Tubo cornical de 50 mLFalcon352070
Copo de 500 mLKorea Ace ScientificKA.23-08
Filtro de vácuo de 500 mL Corning431118
Recipiente de plástico de 500 mLLOCK& LOCKINL301
96well placaFalcon353072
Folha de alumínioDAEKYO
KimwipeKimtech
Barra magnéticaCoréia Ace ScientificBA.37110-0003
Almofariz e pilãoDAIHAN ScientificSC. MG100
Pipetador multicanalEppendorf4982000314
Placa de PetriSPL10100
Tiras indicadoras de pH1095350001Sigma-Aldrich
DAIHAN Scientific
Decellularization
10x pbsHycloneSH30258.01
4.7% Ácido peracéticoOmegafarm
70% etanolSAMCHUN CHEMICALSE0220 SAM
Água
IPASAMCHUN CHEMICALSsamchun I0348
Triton-X 100BiosesangT1020
Ensaio bioquímico
1,9-Dimetil-Metileno Azul cloreto de zinco sal duploSigma-Aldrich341088
10 N NaOHBiosesangS2018
Cloramina TSigma-Aldrich857319
Sulfato de condroitina ASigma-AldrichC4384
Ácido cítricoSupelco46933
Cisteína-HClSigma-AldrichC1276
Ácido acético glacialMerok100063
GlicinaSigma-Aldrich410225
HClSigma-AldrichH1758
Na2-EDTASigma-AldrichE5134
NaClSAMCHUN CHEMICALSS2097
PapaínaSigma-Aldrichp4762
P-DABSigma-AldrichD2004
Ácido perclóricoSigma-Aldrich311421
Acetato de sódioSigma-AldrichS5636
Hidróxido de sódioSupelcoSX0607N
Fosfato de sódio (monobásico)Sigma-AldrichRDD007
ToluenoSigma-Aldrich244511
Bioink
Charicterized FBSHycloneSH30084.03
Penicilina-EstreptomicinaThermo Fisher Scientific15140122
PepsinaSigma-AldrichP7215
Rosa bengalaSigma-Aldrich198250
RPMI-1640 meioThermo Fisher Scientific11875093
solução Trypan BlueSigma-AldrichT8154
WSO04010Misturador de vórtice Malha de filtro de peneira destilada

Referências

  1. Shapiro, A. J., Pokrywczynska, M., Ricordi, C. Clinical pancreatic islet transplantation. Nature Reviews Endocrinology. 13 (5), 268(2017).
  2. Venturini, M., et al. Technique, complications, and therapeu....

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Reimpressões e permissões

Etiquetas

ECM Derivada de Tecido Pancre ticoMatriz Extracelular DescelularizadaPrepara o de Bio tintaT cnica de Bioimpress o 3DEncapsulamento de IlhotasComposi o Espec fica do TecidoImpress o Baseada em Extrus oCaracteriza o Reol gicaTransi o Sol GelAvalia o da Sensibilidade Glicose