Artigo de método

Modelo de carcinogênese cutânea induzida por produtos químicos usando dimetilbenz[a]Anthracene e 12-O-Tetradecanoyl Phorbol-13-Acetato (DMBA-TPA)

DOI:

10.3791/60445

⸱

19 de dezembro de 2019

 ,  ,  ,  , 
1Faculty of Medicine and Health Technology, Tampere University and Tampere University Hospital, 2Department of Clinical Microbiology, Fimlab Laboratories

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A carcinogênese de pele em dois estágios é induzida por dois produtos químicos aplicados topicamente. Um mutagen 7,12-dimetilbenz [a] antracaneno) provoca mutações nas células epidérmicas e uma aplicação contínua do estimulador de crescimento geral 12-O-tetradecanoyl phorbol-13-acetato acelera a formação de papiloma da pele.

Resumo

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O câncer é uma das doenças humanas mais devastadoras. Modelos experimentais de câncer são importantes para obter informações sobre a complexa interação de diferentes tipos de células e genes na promoção da progressão do tumor e fornecer uma plataforma para testar a eficácia de diferentes abordagens terapêuticas. Um dos modelos experimentais mais utilizados de câncer inflamatório experimental é o modelo de carcinogênese de pele de dois estágios DMBA-TPA. A formação tumoral é induzida neste modelo pela aplicação tópica de dois produtos químicos diferentes, 7,12-dimetilbenz[a]antracaneno (DMBA) e phorbol-13-acetato de 12-O-tetradecanoyl (TPA), que juntos causam formação de papiloma na pele. Como o resultado primário é a formação do papiloma na pele, o modelo é uma maneira ideal, confiável e reproduzível de abordar tanto a iniciação tumoral (sobrevivência livre de tumores) quanto a progressão do tumor (número e tamanho de tumores visíveis). Os efeitos do tratamento DMBA-TPA são transmitidos através de um mecanismo inflamatório, o que torna este modelo especialmente adequado para estudar o papel do sistema imunológico na formação de tumores. No entanto, este modelo é restrito à pele e outras superfícies onde os produtos químicos podem ser aplicados. Um protocolo detalhado é fornecido neste artigo para usar o modelo com sucesso.

Introdução

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O câncer é uma das principais causas de morte no mundo. Portanto, há uma demanda para desenvolver modelos de doenças experimentais confiáveis para obter uma melhor compreensão da doença, bem como para explorar possíveis abordagens terapêuticas. Um dos modelos in vivo experimentais mais comumente usados para estudar o desenvolvimento do câncer de pele é o modelo de carcinogênese de pele de dois estágios quimicamente induzido1,2. O modelo fornece uma ferramenta para estudar a iniciação, a promoção e a progressão do tumor além dos eventos específicos tais como a infiltração da pilha imune e o angiogenesis.

Para usar o modelo de carcinogênese de pele em dois estágios, a pele traseira de camundongos é tratada com dois produtos químicos diferentes que, juntos, induzem a formação do tumor. O modelo é iniciado com uma dose baixa do mutagen, DMBA, seguido pela exposição prolongada ao promotor do tumor, TPA3 (Figura 1). DMBA muta DNA aleatoriamente, formando adutores covalentes com o DNA de células epidérmicas e células-tronco teatinócitos primários4,5,6,7. Algumas dessas mutações aleatórias ocorrem em um proto-oncogene, como Hras1 (mutações em Kras e Nras também são detectadas) e a conversão de proto-oncogenes para oncogenes impulsiona a formação tumoral estímulos adequados. O TPA, por sua vez, é o agente de promoção do crescimento tumoral mais utilizado. Seu alvo molecular é proteína kinase C (PKC)8. O TPA também ativa a sinalização wnt/β-catenina que é crucial para a formação de tumores no modelo9. A exposição repetida e prolongada ao agente promotor leva a uma sinalização celular aprimorada, aumento da produção de fatores de crescimento e uma reação inflamatória local, que são evidentes devido ao aumento da síntese de DNA e infiltração de células inflamatórias na pele tratada.

Os principais mediadores inflamatórios no modelo DMBA-TPA foram identificados10. Interleukin-17A (IL-17A) é conhecido por ser particularmente tumorigenic no modelo DMBA-TPA11,12. Trabalha em sinergia com interleucina 6 (IL-6) e participa do recrutamento de macrófagos e neutrófilos13,14. Além disso, as células TCD4 + e neutrófilos têm se mostrado tumorigenic no modelo DMBA-TPA. Finalmente, macrófagos também podem promover tumorigênese no modelo15,16,17.

Durante a fase de promoção, a proliferação celular das células mutadas é reforçada e uma hiperplasia sustentada da epiderme é mantida1. Isso leva ao desenvolvimento do papiloma na pele em 10-20 semanas, após o que os papilomas começam a se converter em tumores malignos, carcinomas de células escamosas (SCCs)2. No entanto, menos de 10% dos papilomas progridem para a malignidade, embora essa porcentagem também dependa do fundo genético dos camundongos2,18. Durante décadas não se sabia que tipo de células foram inicialmente mutadas nos tumores que levaram à malignidade, embora alguns estudos tenham relatado características claramente distintas nos tumores malignos quando comparados aos papilomas benignos19,20. No entanto, estudos recentes têm aumentado muito a nossa compreensão sobre a origem clonal da formação tumoral no modelo DMBA-TPA21. 22. 23.Demonstrou-se que ambas as células epiteliais derivadas da medula óssea e as células-tronco do folículo piloso contribuem para a formação tumoral22. Estudos de rastreamento de linhagem específicos de palco revelaram que os papilomas benignos são de origem monoclonal, mas recrutam novas populações de células epiteliais21,23. No entanto, apenas um dos clones celulares funciona como motorista de carcinogênese; ele contém uma mutação Hras23. A progressão para a formação de carcinoma está associada a uma varredura clonal23.

O DMBA cancerígeno inicia a formação do papiloma e a TPA promove o crescimento tumoral. Assim, a iniciação do tumor pode ser estudada separadamente da promoção interrompendo o experimento antes do período de tratamento do TPA. Como a progressão do tumor é estudada semanalmente, oferece uma grande oportunidade para a análise detalhada do crescimento do tumor ao longo do estudo. Porque os tumores são gerados por produtos químicos externos, uma mutação oncogenic na linha germinal é desnecessária. Assim, estudar os efeitos de um fundo genético (por exemplo, nocaute /transgene vs. tipo selvagem) sobre tumorigênese é simples2. Em suma, o modelo de câncer de pele DMBA/TPA é uma abordagem particularmente útil para estudar o papel do sistema imunológico na progressão do tumor, bem como para a avaliação dos passos de iniciação e promoção do tumor de forma independente ou interdependente.

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Figura 1: Esboço do modelo de carcinogênese de pele induzida por DMBA-TPA. O DMBA cancerígeno é aplicado topicamente para induzir mutações no DNA na fase de iniciação do modelo. O agente promotor de crescimento TPA é administrado 2x por semana para aumentar a proliferação celular durante a fase de promoção, levando ao desenvolvimento de papilomas na pele. Os animais são sacrificados após a resposta do papiloma atingir um platô, geralmente dentro das semanas 15-20, dependendo do fundo genético dos ratos. Uma pequena proporção dos papilomas pode se desenvolver ainda mais em SCCs dentro de 20-50 semanas. Para estudar os primeiros eventos na fase de iniciação e promoção precoce, as amostras podem ser coletadas (por exemplo, logo após a segunda aplicação de TPA). Uma fotografia representativa e hematoxilina e eosina manchada seção transversal de papilomas em uma pele de rato C57BL/6 após 19 semanas de tratamento são mostrados. Barra de escala = 0,1 mm. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior deste valor.

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Protocolo

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O protocolo aqui descrito foi aprovado pelo Comitê Nacional de Ética Animal da Finlândia (número de protocolo ESAVI/23659/2018).

1. Animais experimentais, reagentes e equipamentos

  1. Use idade e camundongos com sexo. Comece o estudo em 7-9 semanas de idade, porque a pele na maioria dos ratos está em telogênio (a fase de descanso) em torno dessa idade2.
  2. Observe o comportamento dos animais durante o estudo e se eles lutam, o que muitas vezes acontece com os machos, abrigá-los separadamente. As lutas podem causar cortes na pele, que promovem a formação do tumor. Os ratos fêmeas são preferidos devido a seu comportamento menos agressivo. O tamanho típico do grupo experimental varia entre 8-20 animais por grupo24,25,26,27.
    NOTA:Cálculos de energia com base na variação biológica observada em estudos anteriores ajudam a escolher um tamanho de grupo suficientemente grande. As cepas utilizadas como exemplos neste artigo incluem Balb/c e C57BL/6. No entanto, muitas outras cepas de camundongos, como SENCAR e FVB têm sido usadas com o modelo DMBA-TPA, bem como os ratos Wistar e Sprague-Dawley2,28,29. É necessária uma licença do comité nacional ou local do trabalho animal antes do início do estudo. Além de considerações gerais de bem-estar, os desfechos específicos do modelo são tipicamente carcinoma de células escamosas (CCS) e uma infecção da pele. Arranhões na pele devido à coceira após a aplicação dos produtos químicos tumorigenic na acetona é típico, mas caso contrário, os animais não devem mostrar sinais de desconforto. Pesando regularmente (por exemplo, 2x por mês) ajuda a avaliar o bem-estar dos animais.
  3. Use o DMBA e o TPA, ambos diluídos em acetona. A concentração de trabalho do DMBA é de 250 g/L. Uma dose para um animal é de 50 μg de DMBA em 200 μL de acetona. A concentração de tpa é de 125 g/l e a concentração de tratamento 25 g/L. Uma dose de TPA para um animal é de 5 μg em 200 μL de acetona.
    CUIDADO:DMBA é prejudicial se engolido e pode causar câncer. Acetona evapora rapidamente e é inflamável. Pode causar tonturas e irritar os olhos. Use uma máscara de respiração e/ou trabalhe um fluxo de vácuo. Troque luvas depois de manusear qualquer um desses produtos químicos. As gaiolas individualmente ventiladas impedem a propagação dos produtos químicos durante a carcaça dos ratos. Após a aplicação, recolher as pontas pipette usado para lidar com o DMBA e dispor como resíduos perigosos.
    NOTA:O DMBA deve ser protegido da luz. O TPA diluído é armazenado em -20 °C, protegido preferencialmente da luz.
  4. Procure o seguinte equipamento: uma escala, uma máquina de barbear comum para a pele, pipetas e pontas de tamanho apropriado, uma régua comum, uma câmera digital, um bloco de notas e uma caneta ou um computador para gravar os papilomas, um sistema de anestesia inalada ou um contidor do mouse com uma abertura no topo de trás, e um sistema de narcose de dióxido de carbono para sacrificar ratos.

2. Indução e Promoção do Papiloma da Pele

  1. Raspe a pele traseira e pese o animal. Mais tarde, raspar a pele sempre que necessário, mas não no momento da exposição química.
    NOTA:Tenha cuidado ao fazer a barba ao redor dos papilomas e evitar fazer qualquer corte na pele. Pese cada animal a cada 2 semanas para notar qualquer perda de peso potencial.
  2. Aplique 50 μg de DMBA em 200 μL de acetona topicamente na área raspada usando uma pipeta 48 h após raspar a pele. Se necessário, contenha o animal usando anestesia de inalação de luz ou um contidor de camundongos.
  3. Após 7 dias, dê a primeira dose de TPA. Aplique 5 μg de TPA em 200 μL de acetona topicamente com uma pipeta 2x por semana, de preferência segunda e quinta-feira ou terça-feira e sexta-feira.
  4. Conte, registre e fotografe os papomas todas as semanas. Uma massa palpável superior a 1 mm de diâmetro é considerada um papiloma se permanecer mais de 1 semana. Marque cada papiloma individual em um mapa e liste seu tamanho a cada semana. Armazenar fotografias digitais.

3. Sacrifício animal e coleção da amostra

  1. Continue o tratamento até que a resposta do tumor atinja um platô. Geralmente, espera-se que a carga do papiloma aumente de 10 a 20 semanas após a iniciação, dependendo da cepa do camundongo usada. O planalto é esperado em 15-20 semanas. Uma pequena proporção dos papilomas (menos de 3%) pode evoluir para SCCs dentro de 20-50 semanas2.
  2. Sacrifique os animais 24 h após a última aplicação tpa. Use narcose de dióxido de carbono com luxação cervical ou outro método adequado.
  3. Dependendo da questão da pesquisa, recolher material amostral adequado dos animais30,31.
    1. Por exemplo, recolher amostras de sangue antes do sacrifício e separar o plasma.
    2. Corte pedaços da pele para a coloração de imunohistoquímica (IHC) (por exemplo, hematoxilina e eosina, proliferando ou inflamatórias).
    3. Use socos de biópsia para coletar pedaços de pele com tecido de papiloma ou pele não papiloma (tratada) para expressão gênica (por exemplo, qPCR) e/ou análises de proteínas (por exemplo, mancha ocidental ou ELISA).
    4. Colete um pedaço dos gânglios linfáticos de drenagem do baço e da pele para análise de citometria de fluxo se for desejada uma análise mais detalhada das populações de células imunes. Você também pode separar camadas epidérmicas e dérmicas para análises adicionais.

4. Estatísticas

  1. Desenhe uma curva de sobrevivência Kaplan-Meier do tempo livre de papiloma e use o teste de log-rank Mantel-Cox para a sobrevivência. Desenhe uma curva linear do número de papilomas por semana. Como se trata de dados de contagem, use um modelo de regressão não linear. Consulte um estatístico, se necessário.

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Resultados

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O principal resultado é o tempo de sobrevivência (ou seja, livre de papiloma) entre o tratamento ou os grupos genótipo. O resultado secundário é o número de papilomas por semana em cada grupo(Figura 2). Os resultados esperados são uma diferença estatisticamente significativa no tempo livre do papiloma e no número de papiillomas entre os grupos experimentais (dois ou mais). Recomenda-se contar o número de papilomas e desenhar uma curva durante a fase de promoção (TPA) para ter uma idéia das d...

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Discussão

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O câncer de pele induzido pelo DMBA-TPA é um dos modelos de câncer mais usados porque é altamente reproduzível e fornece informações sobre a progressão do tumor da iniciação à malignidade. A medida-chave do resultado, a formação do papiloma, é facilmente e confiável quantitativa. O modelo aborda a iniciação tumoral (sobrevivência livre de tumores) quanto a progressão (números e tamanhos tumorais) simultaneamente. O modelo é adequado para estudar diferentes compostos, como potenciais terapêuticas, e os efeitos de genes in...

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Divulgações

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Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

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Este trabalho foi financiado pela Academia da Finlândia (subvenções 25013080481 e 25013142041 (I.J.), 286377 e 295814 (M.P.), 287907 (T.J.)), Päivikki e Fundação Sakari Sohlberg (Pm,, T.J.), Fundação Médica Finlandesa (T.P.), A Pesquisa Estatal Competitiva Financiamento da Área de Responsabilidade Especializada do Hospital Universitário de Tampere (concessão 9V049 e 9X044 (M.P.), 9X011 e 9V010 (T.J.)), O Financiamento De Investigação Estatal Competitivo da Área de Responsabilidade Especializada dos Laboratórios Fimlab (subvenção X51409 (I.J.)), Tays Fundação de Apoio (I.J., M.P., T.J.), Fundação Tampere Tuberculosis (I.J., M.P., T.J.), a Fundação Cultural Finlandesa (M.V.), a Fundação Paulo (T.P.), a Sociedade de Câncer da Finlândia (M.P.) e a Fundação Emil Aaltonen (T.P.).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
1000 ul RPT XL Ponta de Filtro Graduada (Estéril), RecargaStarlabS1182-1730-C
300 ul RTP Ponta de Filtro Graduada (estéril), RecargaStarlabS1180-9710-C
7,12-Dimetilbenz[a]antraceno (DMBA)SigmaD3254-100MGNocivo se ingerido e pode causar câncer. Armazene protegido da luz.
AcetonaSigma1000141011Evapora rapidamente e é inflamável.
Attane vet 1000 mg/gPiramal Critical Care LimitedIsoflurano líquido para inalação
Clipper a pilhas IsisAlbert Kerlb GmbHGT421Para raspar o pêlo
CONTRAfluran-RestgasfilterZeoSys GmbHPara anestesia
Linex Nature N1030 Régua 30 cmGrampos Business Advantage60383Para medir papilomas
Câmara de CO2 Média 300 x 200 x 200mm - RedVetTech Solutions LtdAN045ARPara sacrifício
MekasoftMekalasi23008Tampa da mesa
Ratos (Balb/c JRj)Janvier labs Outras cepastambém possíveis
Ratos (C57BL/6JRj)Janvier labs Outras cepastambém possíveis
Panasonic Lumix DMC-FS5 Câmera DigitalPanasonic
ParaformaldeídoMerck30525-89-4Para amostras de histologia
Phorbol 12-miristato 13-acetato também conhecido como 12-Otetradecanoilforbol-13-acetato (TPA)EnzoBML-PE160-0001
Balança de precisão PLJ-C / PLJ-GKERN & SOHN GmbHPLJ 600-3CM
Pré-Ajuste CO2 System-2 Chamber-S/S HabitaçãoVetTech Solutions LtdAN044BXPara sacrifício
RNAlaterQiagen76104Para amostras de ácido nucleico
Pipeta Tacta 100-1000 ulSartoriusLH-729070
Pipeta Tacta 20-200 ulSartoriusLH-729060
UNO Enchimento de Chave AnestésicaScintica instrumentação inc.Para anestesia
UNO Máscara Facial para MouseScintica instrumentação inc.Para anestesia
UNO FM2200 Medidor de vazãoScintica instrumentação inc.Para anestesia
Unidade de Exaustão de Gás UNOScintica instrumentation inc.Para anestesia
UNO Induction BoxScintica instrumentation inc.Para anestesia
UNO200VAP VaporizadorScintica instrumentation inc.Para anestesia

Referências

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