Um ensaio de carga bacteriana molecular de tuberculose (TB-MBLA)

Resumo

Descrevemos um teste de ensaio de carga bacteriana molecular de tuberculose realizado após a inativação do calor da escória. A inativação do calor torna as amostras de espelo não infecciosas e evita a necessidade de laboratórios de nível de contenção 3 para testes moleculares de tuberculose.

Resumo

A tuberculose é causada pelo Mycobacterium tuberculosis (Mtb), um patógeno classificado pela Organização das Nações Unidas (ONU) como uma substância biológica perigosa categoria B. Para o bem da segurança dos trabalhadores, o manuseio de todas as amostras presumidas para transportar Mtb deve ser realizado em um laboratório de nível de contenção (CL) 3. O teste de carga bacteriana molecular da TB (TB-MBLA) é um teste de reação em cadeia de polimerase quantitativa transcriptase reversa (RT-qPCR) que quantifica a carga bacilada Mtb usando primers e sondas de dupla etiqueta para 16S rRNA. Descrevemos o uso da inativação de calor para tornar as amostras de TB não infecciosas, preservando o RNA para a TB-MBLA. Uma alíquota de 1 mL da amostra de espeto em tubos de centrífuga de 15 mL bem fechados é fervida por 20 min a 80 °C, 85 °C ou 95 °C para inativar bacilos Mtb. O cultivo do calor inativado e o controle (vivo) das amostras por 42 dias confirmaram a morte da TB. A amostra inativada é então cravada com 100 μL do controle de extração e o RNA é extraído seguindo o procedimento padrão de isolamento do RNA. Não foi observado crescimento nas culturas de amostras tratadas a calor. O RNA isolado é submetido a RT-qPCR em tempo real, que amplifica um alvo específico no gene rRNA Mtb 16S, produzindo resultados na forma de ciclos de quantificação (Cq). Uma curva padrão é usada para traduzir Cq em carga bacteriana, ou unidades de formação de colônias estimadas por mL (eCFU/mL). Há uma relação inversa entre Cq e a carga bacteriana de uma amostra. A limitação é que a inativação de calor atinge algumas células, expondo o RNA a RNases que causam uma perda de <1 log₁₀eCFU/mL (ou seja, <10 CFU/mL). Outros estudos determinarão a proporção de pacientes com carga muito baixa que causam resultados falsos negativos devido à inativação do calor.

Introdução

Causada suscetida pela Mycobacterium tuberculosis (Mtb), mais de 7 x¹⁰⁶ novos casos de tuberculose (TB) são relatados globalmente dos quais mais de 1 x 10⁶ morrem por ano^1,2. Para reverter a tendência, a Organização Mundial da Saúde (OMS) lançou uma abordagem de três pilares, incluindo o desenvolvimento de ferramentas eficazes de diagnóstico e tratamento³. Classificada como uma substância biológica perigosa B pela ONU, trabalhar com amostras presumidamente positivas para Mtb requer um nível de contenção (CL) de 3. Os laboratórios CL3 são caros para construir e manter. Consequentemente, a maioria dos países tem serviços de cultura de TB centralizados em nível regional ou nacional. Isso significa que a microscopia de difamação é a ferramenta de diagnóstico mais disponível nas unidades de saúde periféricas.

Existe a aprovação da OMS para implementar testes moleculares rápidos como o Xpert MTB/RIF em unidades de saúde de nível 4, situadas principalmente nos níveis distritais^4,5. Alguns distritos são muito grandes e menos acessíveis para algumas pessoas. Embora benéfico, xpert MTB/RIF funciona detectando o DNA Mtb. O DNA é uma molécula estável que sobrevive muito tempo depois que as células morrem e, portanto, não é um bom padrão para medir células viáveis críticas para monitorar a resposta ao tratamento^5,6. Os ensaios baseados em RNA oferecem uma alternativa para medição precisa de células viáveis^{7,,8,9,10,11,12,13}. O RNA existe em diferentes espécies de estabilidade variável: RNA ribossômico (rRNA), RNA de transferência (tRNA) e RNA mensageiro (mRNA). O RNA mensageiro está associado à expressão genética e, portanto, o mais associado à atividade celular e viabilidade¹⁴. É importante notar que a ausência de expressão genética não é equivalente à morte celular porque patógenos como mtb são conhecidos por existirem em estados inativos (dormentes), mas estados viáveis^15,16. Espécies estáveis de RNA como o rRNA são, portanto, melhores marcadores de estados ativos e inativos de células viáveis.

Usando Escherichia coli, Sheridan mostrou que o rRNA 16S aumentou proporcionalmente com o crescimento bacteriano medido pelas unidades de formação de colônias (UFC) conta¹⁷. Houve um declínio simultâneo na contagem de UFC e 16S rRNA quando as bactérias E. coli foram expostas a antibióticos. A queda do rRNA após a morte celular foi um indicador de que poderia ser usado como marcador para a viabilidade celular^13,17. A partir desse princípio, o ensaio de carga bacteriana molecular da TB (TB-MBLA) foi desenvolvido para direcionar m. tuberculosis 16S rRNA para medir a carga bacilado de TB viável como marcador de resposta ao tratamento para pacientes em terapia anti-TB^11,18,19. Desenvolvemos e otimizamos ainda mais a TB-MBLA para incorporar um controle de extração celular que reflete a lésia de M. tuberculosis bacilli e é robusto em diferentes ambientes²⁰. O procedimento TB-MBLA exige que os primeiros passos de isolamento de RNA do MTB sejam conduzidos em laboratório CL3 até que as células Mtb sejam completamente lysed para garantir a segurança dos trabalhadores. Também inclui a preservação da amostra para análise retrospectiva em lote a ser mantida a -80 °C em guanidina tiocianato, uma substância tóxica nível 4. Para isso, usamos calor para inativar o Mtb e tornar as amostras seguras para tb-MBLA a serem realizadas em laboratórios de nível de microscopia de manchas.

O uso de calor em aplicações laboratoriais e clínicas existe há séculos^21,,22. No entanto, alguns microrganismos como mtb são difíceis de matar, e menor exposição ao calor é insuficiente para matar todas as células^23,24. Um estudo revelou que o aquecimento de 20 min de culturas de TB a 80 °C matou todos os bacilos Mtb sem destruir o DNA necessário para pcr²⁵. Posteriormente, uma série de técnicas de extração de DNA laboratorial atualmente aquecem a 95 °C. Aplicamos o mesmo princípio para mostrar que amostras de TB fervente a 80 °C, 85 °C ou 95 °C inativam Mtb, preservando RNA suficiente para a TB-MBLA a ser realizada. A cultura ou a escória inativadas podem ser mantidas em recipientes bem fechados à temperatura ambiente ou refrigerados por 7 dias sem reduzir a quantidade de rRNA quantificável.

O teste TB-MBLA, atualmente utilizado apenas como uso de pesquisa (RUO), é adaptável e tem sido aplicado a diferentes tipos de amostra, incluindo escarro, tecido pulmonar e fluido espinhal cerebral. Ainda está para ser aplicado em fluido alveolar brôquico, sangue e outros tipos de amostra. Utilizando escarro como amostra, resultados da avaliação multisite na África (dados inéditos) e publicações anteriores^18,26 mostram que a sensibilidade da MBLA é consistente com a cultura líquida do tubo indicador de crescimento de micobacterium (MGIT). No entanto, a TB-MBLA é mais rápida, dando resultados em horas ao invés de dias ou semanas de cultura, específicas, não afetadas por microrganismos não-TB na amostra, e dá uma medida quantitativa da gravidade da doença. A OMS reconheceu recentemente a TB-MBLA como candidata a substituir a microscopia e a cultura de difamação para o monitoramento do tratamento da TB².

Neste artigo descrevemos detalhadamente a inativação do calor e o protocolo TB-MBLA publicado em Sabiiti et al.²⁷. Este protocolo detalhado fornecerá um recurso visual único para os usuários de TB-MBLA em todo o mundo.

Protocolo

1. Preparação da amostra

1. Cultura
   1. Trabalhando em um banco limpo ou cabine classe 1, colhe alíquotas de 1 mL de cultura de fase exponencial Bacillus Calmette-Guérin (BCG) em tubos de centrífuga de plástico de 15 mL. Feche bem os tubos.
      NOTA: Para processar uma amostra inteira de 5 mL, são necessários cinco tubos de centrífuga de 15 mL.
      ATENÇÃO: É necessário um gabinete de biossegurança ao trabalhar com qualquer cultura de TB.
2. Amostra de espaquete do paciente
   1. Trabalhando em um espaço bem ventilado e usando uma máscara nasal, abra cuidadosamente o copo da amostra, pipeta 1 mL alíquotas em tubos de centrífuga de plástico de 15 mL e feche firmemente os tubos.
      NOTA: Recomenda-se uma ponta de boca larga para a escória da pipeta. Usando uma tesoura, corte a parte fina da boca da ponta de 1 mL para criar uma boca mais larga.

2. Inativação de calor

1. Antes da preparação da amostra, coloque o banho de água a 95 °C.
   NOTA: A temperatura de 95 °C aumenta a chance de reduzir a atividade do RNase e, assim, preservar mais RNA para TB-MBLA a jusante.
2. Transfira os tubos de amostra para um rack de retenção imerso no banho-maria. Certifique-se de que três quartos de cada tubo de amostra esteja imerso na água.
3. Ferva a 95 °C por 20 min, depois transfira os tubos para o banco para esfriar em temperatura ambiente por 5 min antes de iniciar a extração de RNA.
   NOTA: A inativação completa do calor de M. tuberculosis bacilli e BCG foi verificada por incubação de amostras inativadas por calor e controles a 37 °C durante 42 dias para verificar o crescimento. Uma medição de densidade óptica a 600 nm (OD₆₀₀) foi feita na linha de base e, em seguida, semanalmente para o período de incubação de 42 dias.

3. Extração de RNA

NOTA: O processo de extração de RNA descrito aqui é para o kit De RNA listado na Tabela de Materiais. Outros kits de extração de RNA adequados por diferentes fabricantes podem ser usados.

1. Adição do controle de extração (CE)
   1. Transferir alíquotas de 1 mL das amostras inativadas pelo calor para tubos de 1,5 mL. Espete 100 μL da CE em cada amostra, feche o tubo e misture invertendo o tubo de cabeça para baixo 3x.
      NOTA: A CE é fornecida com o kit de bactérias vitais TB-MBLA (Tabela de Materiais).
2. Sedimentação celular
   1. Usando uma microcentrífuga de bancada, centrifuge os tubos a 20.000 x g por 10 min à temperatura ambiente. Pipeta fora do sobrenadante, deixando 50 μL de sedimentos.
   2. Suspender o sedimento em 950 μL de tampão de lysis por pipetting para cima e para baixo, e transferir toda a suspensão para o tubo de matriz de lysing fornecido com o kit de extração de RNA (Tabela de Materiais). Certifique-se de que os tubos estão bem fechados e rotule tanto a tampa quanto o lado do tubo.
3. Para a lse celular, transfira os tubos da etapa 3.2.2 para um homogeneizador. Homogeneize as amostras para 40 s a 6.000 rpm.
4. Purificação do ácido nucleico
   1. Centrifugar o lysate do passo 3.3 a 12.000 x g por 5 min em temperatura ambiente.
   2. Prepare tubos frescos de 1 mL e adicione 300 μL de clorofórmio em cada tubo.
   3. Usando uma ponta de 1 mL cuidadosamente pipeta fora do sobrenadante sem tocar na matriz de lysing.
   4. Transfira o sobrenadante para o clorofórmio contendo tubos e vórtice para 5 s. Deixe o tubo se contentar com 5 min ou mais até que três fases (superior, média e inferior) estejam claramente visíveis.
   5. Centrífuga a 12.000 x g por 5 min em temperatura ambiente. Pipeta cuidadosamente a fase superior e transfira para tubos frescos de 1,5 mL.
   6. Aos tubos na etapa 3.4.5, adicione 500 μL de etanol 100% frio, feche os tubos e misture invertendo suavemente de cabeça para baixo 3x. Incubar os tubos a -80 °C por 15 min ou -20 °C por 30 min e continuar a extração, ou deixar a -20 °C durante a noite para completar a extração no dia seguinte.
   7. Coloque a microcentrífusa a 4 °C e deixe esfriar a pelo menos 12 °C antes de começar a centrifugação. Carregue os tubos na microcentrífuga e centrífuga por 20 min a 13.000 x g. Descarte o sobrenadante, substitua por 70% de etanol gelado e centrífuga por mais 10 min a 13.000 x g.
      NOTA: O etanol de 70% deve ser feito com água livre de nuclease de grau molecular.
   8. Descarte todo o sobrenadante do passo 3.4.7 e transfira os tubos para uma incubadora a 50 °C. Incubar por 20 min para secar a pelota de RNA/DNA. Mantenha os tubos parcialmente abertos para permitir a evaporação de todo o etanol.
   9. Adicione 100 μL de água livre de nuclease à pelota seca e incubar por 5 min em temperatura ambiente. Vórtice para 3 s para misturar o conteúdo.
      NOTA: Nesta fase, o extrato pode ser armazenado de 2 a 3 dias na geladeira ou mais a -80 °C até que a seção 3.5 seja realizada.
5. Remoção de DNA
   NOTA: Esta etapa é crucial porque a presença de DNA no extrato invalida o resultado da MBLA. Esta seção é baseada em um kit de remoção de DNA (Tabela de Materiais).
   1. Prepare uma mistura da enzima DNase I 10x tampão e enzima DNase I para o número de amostras (10 μL de tampão e 1 μL de DNase por amostra) mais 10% extra para cobrir qualquer perda de pipetting. Misture por vórtice e, em seguida, pipeta 11 μL em cada tubo contendo o extrato de RNA.
   2. Misture ao vórterindo 3 s e gire brevemente (10 s a 13.000 x g)para remover quaisquer gotículas nas paredes. Incubar a 37 °C por 30 min no bloco quente ou incubadora. Adicione um adicional de 1 μL de enzima DNase I diretamente em cada tubo, misture bem por vórtice e incubar por mais 30 min a 37 °C.
   3. Descongele o reagente de inativação de DNase 10 min antes do fim da incubação do DNase. Vortex 20 s para garantir uma suspensão homogênea e leitosa e, em seguida, adicionar 10 μL de reagente de inativação de DNase em cada extrato de RNA do passo 3.5.2.
   4. Incubar a mistura em temperatura ambiente durante 5 min. Vórtice 3x durante a etapa de incubação de 5 min.
   5. Centrifugar a mistura a 13.000 x g por 2 min. Transfira cuidadosamente o sobrenadante para tubos livres de RNase de 1,5 mL sem tocar em nenhuma das matrizs de inativação.
   6. Guarde o extrato de RNA na geladeira se estiver executando o RT-qPCR no mesmo dia ou a -80 °C para armazenamento a longo prazo.

4. Transcriptase reversa qPCR

1. Para amostras desconhecidas, diluir todos os extratos de RNA a serem usados em uma razão de 1:10 em água livre de RNase. Misture bem, vórticando para 5 s e gire brevemente para baixo para remover quaisquer gotículas ou bolhas de ar.
2. Para obter amostras padrão para uma curva padrão, pegue os padrões Mtb e EC RNA do congelador -80 °C e descongele à temperatura ambiente. Faça sete e seis diluições de dez vezes de amostras padrão Mtb e CE, respectivamente. Mude as pontas antes de transferir a mistura de um tubo para outro.
   NOTA: As amostras padrão são fornecidas com o kit TB-MBLA.
3. Preparação de mix mestre
   NOTA: Master mix (MM) é uma solução de reagentes PCR suficiente para amplificar todas as amostras, padrões e água para um controle sem modelo (NTC). A água utilizada como NTC deve ser a mesma água utilizada na extração e para o preparo do MM. Certifique-se de que as normas, cada amostra de RNA e sua diluição decimal sejam amplificadas 2x para a reação reversa transcriptase positiva (RT+) e 1x para a reação reverse transcriptase negative (RT-). A reação RT é um controle para determinar a eficiência da remoção do DNA (Tabela 1).
   1. Transfira 16 μL de MM para cada tubo de reação PCR.
   2. Adicione 4 μL de extrato de RNA em cada tubo de reação RT+ e RT e água nos tubos de reação NTC.
   3. Carregue os tubos de reação em uma máquina PCR em tempo real e ajuste as condições de PCR da seguinte forma: 50 °C para 30 min, 95 °C para 15 min, 40x ciclos a 94 °C para 45 s e 60 °C para 1 min com aquisição com fluoróforos que absorvem em canais verdes e amarelos.
      NOTA: O canal verde é o fluoróforo de detecção de Mtb e o amarelo é o fluoróforo de detecção de controle de extração.
4. Interpretação de resultados
   NOTA: Certifique-se de que as reações duplicadas da mesma amostra não diferem por mais de 1 desvio padrão. Os valores de Mtb e EC Cq superiores a 30 são considerados negativos. Veja mais detalhes de interpretação na Tabela 2.
   1. Para interpretar a resposta do tratamento, converta os valores de Cq em carga bacteriana (eCFU/mL) utilizando a curva padrão. Leia a resposta do tratamento como a mudança na carga bacteriana durante o período de acompanhamento do tratamento.
      NOTA: A queda na carga bacteriana após o tratamento significa uma resposta positiva (ou seja, drogas anti-TB matando as bactérias da TB) enquanto nenhuma alteração ou aumento na carga bacteriana implica uma resposta negativa, o que pode significar resistência das bactérias da TB a medicamentos anti-TB ou o paciente não aderindo adequadamente à sua dose de tratamento. A queda da carga bacteriana medida pela TB-MBLA correlaciona-se com o aumento do tempo de MGIT à positividade da cultura (TTP).

5. Microscopia eletrônica de transmissão

1. Transfira as alíquotas de 2 mL de culturas inativadas por calor e controles em tubos de microcentrífuge de 2 mL. Centrífuga por 10 min a 20.000 x g.
2. Descarte o sobrenadante e suspenda a pelota em 700 μL de tampão de fixação celular e incuba à temperatura ambiente por 5 min para fixar as células.
3. Centrifugar a suspensão por 30 min a 16.000 x g para obter uma pelota dura. Descarte o sobrenadante e substitua por 1% de sacarose em solução salina tamponada por fosfato (PBS). Armazene as pelotas em sacarose a 4 °C até a secção para microscopia eletrônica.
4. Secção e TEM
   NOTA: O protocolo abaixo é adaptado de Griffiths et al.²⁸.
   1. Crioproteja a pelota celular incorporando-a em 2,1 M de sacarose na PBS durante a noite a 4 °C. Lave 3x com água gelada.
   2. Esfrie as pelotas de células crioprotegidas em nitrogênio líquido e monte-as com criomicrotomia. Usando o criomicrotome, corte as seções ultrafinas a 90 nm.
   3. Recupere as seções de corte usando as alças de fio de tungstênio de 1:1 mistura de 2% de celulose metile e 2,1 M de sacarose na PBS.
   4. Transfira as seções para suportes tem de cobre hexagonal revestido de pioloforme de 150 malhas hexagonais (grades) e armazene a 4 °C ou siga para a etapa 5.4.5.
   5. Contraste as grades em acetato de uranyl e ar seco em um filme de acetato de metila. Lave as grades com água gelada seguida por duas gotas de PBS acima de 5 min e seque por 15-30 min. Examine as seções sob tem seguindo as orientações do fabricante.
      NOTA: Todas as etapas de rotulagem foram realizadas à temperatura do gelo (temperatura líquida), exceto as etapas de lavagem, que foram realizadas à temperatura ambiente.

Resultados

Calor inativa todos os bacilos de M. tuberculosis
A densidade óptica (OD) dos controles (células vivas) aumentou ao longo do tempo, (0,04_OD–0,85 OD ) e nenhuma alteração de_ODfoi observada nas amostras de calor inativadas, significando crescimento e nenhum crescimento, respectivamente (Figura 1)²⁷. Da mesma forma, a escória clínica de controle cresceu positivamente no dia 3 em MGIT, enquanto as amostras clínicas inativadas pelo calor não sinalizaram positivamente até o final da incubação. O crescimento de Mtb no MGIT foi confirmado pela microscopia de difamação Ziehl-Neelsen e pelo antígeno MPT64²⁹.

RNA em amostras inativadas fica estável a 37 °C por 4 dias
Amostras inativadas por calor foram incubadas a 37 °C para determinar se o RNA se degrada após a inativação de calor das células. Não foi encontrada diferença entre o RNA colhido no Dia (D) 0 imediatamente após a inativação do calor e o RNA isolado em D1, 2, 3 e 4 em ambas as culturas BCG(Figura 2A-C) e tb positivo(Figura 2D).

RNase exógeno aumenta a taxa de degradação do RNA nas frações inativadas de calor
Para determinar por que o RNA não estava degradante, a enzima RNase A foi exógenamente adicionada a 1.000 U/mL antes e/ou após a inativação do calor. Isso causou perda de RNA equivalente à carga bacteriana 1,5 ± 0,3 -, 1,8 ± 0,2 -, e 1,3 ± 0,1 - registro₁₀ eCFU/mL a 80 °C, 85 °C e 95 °C, respectivamente, durante 4 dias de incubação. Houve diferença no RNA degradado em amostras onde o RNase foi adicionado antes e/ou após a inativação do calor (Figura 3A-C).

RNA suficiente é preservado para TB-MBLA usando 16S rRNA como marcador de referência
O efeito da inativação do calor no rRNA foi medido em culturas BCG e esfato de pacientes com TB positiva. A carga bacteriana medida de controle da cultura BCG, 5,3 ± 0,2 log₁₀ eCFU/mL, foi de 0,2 ± 0,1 log₁₀ eCFU/mL superior ao combinado 5,1 ± 0,3 log₁₀ eCFU/mL de cultura inativada por calor (ANOVA p < 0,0001) a 80 °C, 85 °C e 95 °C(Figura 4A)²⁷. Da mesma forma, a carga bacteriana de escolamento do paciente de controle, 7,1 log₁₀ eCFU/mL, foi de 0,8 ± 0,1 tronco₁₀ eCFU/mL maior que o combinado 6,3 ± 0,41 log₁₀eCFU/mL a 80 °C, 85 °C e 95 °C(Figura 4B)²⁷. A redução da carga bacteriana foi <1log nos dois tipos de amostras testadas.

O teste de múltiplas comparações de Sidak revelou uma diferença significativa entre a carga bacteriana a 95 °C versus a de 80 °C e 85 °C (p = 0,001). Não foi encontrada diferença nas amostras de TB em todas as temperaturas, p = 0,8.

A integridade da parede celular não é destruída pelo calor na maioria das células Mtb
Usando microscopia eletrônica de transmissão (TEM) investigamos se as células foram lysed por inativação de calor. Seções finas de pelotas fixas de paraformaldeído de células foram feitas e incorporadas em um meio rico em elétrons antes do exame pelo TEM. A inspeção das células em ampliação inferior e maior revelou parede celular intacta e corpos lipídicos intracelulares visíveis. As células pareciam morfologicamente alongadas, mas não lysed. A Figura 5 ilustra a morfologia das células mycobacterium em diferentes ampliações. Os dois primeiros painéis revelam corpos lipídicos intracelulares e o cordão de corda sem obstáculos, uma característica morfológica típica das espécies de micobacterium. Os dois painéis inferiores são maior ampliação expandindo a visão dos corpos lipídicos e revelando algumas estruturas micro-intracelulares.

A carga bacteriana medida pela TB-MBLA está inversamente correlacionada ao tempo de cultura mgit à positividade
Para pacientes que respondem à terapia, a carga bacteriana cai a uma média de₁ 00 eCFU/mL por semana durante o tratamento. Os respondentes rápidos limpam mais rapidamente, convertendo-se em negativo (carga bacteriana zero) por 2 semanas de tratamento. A queda da carga bacteriana medida pela TB-MBLA correspondeu ao aumento do tempo de cultura mgit à positividade (TTP). A Figura 6 demonstra a correlação inversa encontrada entre a carga bacteriana e o TTP MGIT. A diferença, no entanto, é que os resultados da TB-MBLA estão disponíveis em 4h e o tempo de resultado é independente do nível de carga bacteriana. Isso contrasta com 5-25 dias para testes de cultura MGIT. A contaminação com bactérias não-TB compromete ainda mais os resultados dos testes de cultura.

Figura 1: Verificação da inativação bcg a 80 °C (curva do padrão de ponto), 85 °C (curva do t-dash padrão) e 95 °C (curva do padrão do traço). O controle (curva preta) foi a cultura BCG ao vivo (não aquecida) inoculada no mesmo meio de crescimento. O crescimento do controle foi confirmado pelo aumento do OD da cultura durante o período de incubação. Esta figura foi modificada a partir de Sabiiti et al.²⁷. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Estabilidade do RNA quantificável na amostra inativada por calor incubada a 37 °C durante 4 dias (D0-D4). (A),(B)e(C)mostram culturas BCG inativadas a 80 °C, 85 °C e 95 °C, respectivamente. (D) mostra a espeto de TB inativado a 80 °C. O controle é a fração não tratada (ao vivo) da mesma amostra. Barras de erro = desvio padrão. Três repetições, nove réplicas por corrida. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Maior degradação do RNA após adição exógena da enzima RNase A. (A) Inativação de calor (HI) a 80 °C,(B) HI a 85 °C, e (C) HI 95 °C. Barras de erro = erro padrão da média. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: A preservação de RNA suficiente para medição de carga bacteriana TB-MBLA utilizando 16S rRNA como marcador. (A) Carga bacteriana estimada a partir de culturas BCG in vitro. (B) Carga bacteriana estimada a partir da escória positiva da tuberculose. Barras de erro = erro padrão da média (n = 18 e 20 réplicas para A e B, respectivamente). Esta figura foi modificada a partir de Sabiiti et al.²⁷. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Micrografos eletrônicos de bacilos Mtb intactos após a inativação a 95 °C por 20 min. Parede celular clara intacta e corpos lipídicos enumerados foram observados com TEM. Topo: imagens de baixa ampliação de um grupo de células revelando morfologia de corda micobacteriana sem obstáculos e corpos lipídicos intracelulares. Inferior: alta ampliação dos painéis superiores para expandir a visão dos corpos lipídicos e revelar algumas estruturas micro-intracelulares. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6: A curva de resposta ao tratamento de 12 semanas de um paciente em terapia anti-TB mostrando uma correlação inversa da tb-MBLA medida carga bacteriana e MGIT TTP. A carga bacteriana (curva azul) cai enquanto o TTP sobe (curva vermelha) à medida que o paciente responde ao tratamento. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Mistura mestre	Reação positiva do RT	Reação negativa de RT
	Volume por reação x não. de reações + 5	Volume por reação x não. de reações + 5
Mistura de quantitect	10,0 μL	10,0 μL
Mistura de primer Mtb16S (F + R)	0,4 μL	0,4 μL
Sonda Mtb16S	0,2 μL	0,2 μL
Mistura de primer EC (F + R)	0,4 μL	0,4 μL
Sonda CE	0,2 μL	0,2 μL
Enzima RT	0,2 μL	-------
Água livre de RNase	4,6 μL	4,8 μL
Volume total	16 μL	16 μL

Tabela 1: Guia de preparação do mix mestre para o tb-MBLA qPCR.

Tipo	Canal de MTB	Canal CE	Interpretação
Amostra	Positivo	Positivo	Válido
Amostra	Positivo	Negativo	Indeterminado
Amostra	Negativo	Positivo	Válido
Amostra	Negativo	Negativo	Inválido
MTB + Controle	Positivo	Negativo	Válido
Controle de Extração (CE)	Negativo	Positivo	Válido
Controle de DNA	Negativo	Negativo	Válido
Controle Negativo (NTC)	Negativo	Negativo	Válido

Tabela 2: Guia de interpretação dos resultados da TB-MBLA.

Discussão

Este artigo mostra que o tratamento térmico para 20 min a 80 °C, 85 °C e 95 °C inativa as amostras de tuberculose de forma eficaz, possibilitando que a TB-MBLA seja realizada em uma instalação não-CL3 sem risco de infecção para trabalhadores de laboratório. Os achados confirmam observações feitas em estudos anteriores, contrastando com algumas sobre a eficácia da inativação do calor de Mtb^25,30. Por exemplo, alguns relatórios indicam que o aquecimento a 80 °C não é eficaz em amostras de alta carga bacilo^{25,,31,,32,33}. O efeito inóculo de alta densidade foi evitado em nosso estudo, garantindo que toda a esmérosa e culturas puras fossem aquecidas a um volume de 1 mL por tubo de centrifuge de 15 mL, proporcionando espaço adequado para expor cada parte da amostra à ebulição²⁷.

A preservação do RNA após a inativação do calor possibilita a realização da TB-MBLA. Esse achado concorda com dois estudos que demonstraram a preservação do RNA após a inativação do calor^12,34. Mostramos que o RNA em amostras inativadas por calor é estável a 37 °C por 4 dias, implicando que os laboratórios poderiam fazer testes em lote mantendo amostras inativadas à temperatura ambiente por uma semana. Ao aplicar kits de extração de RNA que requerem refrigeração ou congelamento, a capacidade de manter amostras inativadas por calor à temperatura ambiente evita a necessidade de laboratórios de cadeia fria e de categoria 3 realizarem TB-MBLA em configurações limitadas de recursos.

Menos de 1log carga bacteriana foi perdida usando o rRNA 16S como marcador. Embora tenha havido uma diferença entre amostra inativada ao vivo e calor, a quantidade perdida para a inativação de calor é muito pequena para comprometer os resultados a jusante. O aumento da temperatura não aumentou a quantidade de RNA perdido, implicando que a perda observada é independente do tratamento térmico. O tratamento térmico a altas temperaturas provavelmente causa a lse celular, expondo o RNA à degradação por RNases. De fato, a adição exógena de RNase A à fração inativada de calor aumentou a taxa de degradação do RNA. A ebulição não reduziu a atividade do RNase, implicando que é uma proteína muito resistente.

É importante notar que uma degradação média de RNA de 1,5 log₁₀ eCFU/mL não é uma grande perda. Para isso, supõe-se que o aquecimento é uma pequena proporção de bacilos Mtb, expondo assim uma pequena quantidade de RNA ao RNase. Usando tem mostrou que a morfologia celular Mtb e a integridade das paredes celulares dificilmente são afetadas pelo aquecimento a 95 °C. Isso significa que pode exigir vários fatores fisiológicos e fornecimento suficiente de RNases, como no hospedeiro, para degradar significativamente o RNA^35,36. Além disso, por ser um ribossomos estruturais, o rRNA 16S é potencialmente menos suscetível ao RNase^37,38. Uma única célula Mtb contém ~700 ribossomos/0,1 mm³ de citoplasma³⁷, implicando que há maiores quantidades de rRNA por célula. Assim, quantidades menores de RNase podem ter um impacto menor³⁸. A existência de elevados números de ribossomos dá uma vantagem à TB-MBLA em termos de sensibilidade e capacidade de detectar pacientes com TB de baixa carga.

Houve forte correlação entre a carga bacteriana medida pela TB-MBLA e pela cultura MGIT TTP. Isso confirma a carga bacteriana como o motor da positividade cultural até certo ponto. No entanto, a vantagem da TB-MBLA é que ela quantifica diretamente a carga bacilada presente na amostra e não requer proliferação celular de Mtb antes da detecção. Isso contrasta com a cultura cujo tempo de positividade depende do nível de carga bacteriana e da taxa de proliferação celular de Mtb. Estudos futuros avaliarão o fluxo de trabalho tb-MBLA, incluindo a inativação do calor, em ambientes clínicos de rotina. O estudo também explorará amostras com uma gama de cargas bacterianas para entender o número que pode mudar de positivo para negativo (ou seja, aqueles com menos bactérias após a inativação do calor).

O protocolo TB-MBLA para quantificação molecular da carga bacteriana é o primeiro do tipo em bacteriologia. O método quantifica diretamente a carga bacilo Mtb da escória do paciente e não requer cultura para fazê-lo. Isso o torna mais rápido e aumenta seu potencial para informar uma decisão clínica sobre o progresso do paciente. A etapa de inativação do calor reduz o risco de infecção e aumenta a aplicabilidade da TB-MBLA em configurações que não possuem um laboratório de categoria 3. Após a inativação do calor da amostra, existem três etapas de protocolo para alcançar os resultados da TB-MBLA: extração de RNA, transcriptase reversa (RT)-qPCR e análise de resultados qPCR.

Quanto maior a eficiência de isolar o RNA de Mtb de uma amostra do paciente, maior a qualidade dos resultados. É importante notar que a qualidade da amostra de esfatonte afeta a quantidade de RNA isolada. Por exemplo, a salivar é considerada de baixa qualidade e tem sido associada à baixa carga bacilo. Isso significa que treinar o paciente para uma espera de esmaque de qualidade é importante. Para avaliar a eficiência do processo de extração, um controle de extração (ou seja, o número conhecido de células não-Mtb) é cravado na amostra antes da extração do RNA. A recuperação do controle de extração confirma a eficiência do processo de extração de RNA. O processo de isolamento de RNA não pode ser válido a menos que o controle de extração tenha sido recuperado. Dado o fato de que o Mtb é um organismo resiliente faz da lise mecânica uma parte crucial do processo. A homogeneização da amostra em alta velocidade (600 rpm) na presença de contas (ou seja, matriz de lysing) efetivamente lince as células. A purificação do lysato produz um extrato contendo tanto RNA quanto DNA. A remoção do DNA é um último passo crucial da extração do RNA. Tb-MBLA visa medir bacilos viáveis quantificando O Nat. Assim, a não remoção do DNA genômico significa que os resultados terão um sinal do DNA, que não é um bom marcador para a viabilidade celular⁶.

O RT-qPCR é um duplex executando testes com dupla etiqueta para Mtb e controle de extração. Envolve três etapas: transcrição inversa de 30 min por transcriptase reversa a 50 °C, 15 min de desnaturação a 95 °C e 40 ciclos de amplificação a 94 °C e 60 °C. A aquisição de fluorescência das sondas ocorre a 60 °C (ou seja, o estágio de alongamento do fragmento). É importante notar que a TB-MBLA foi otimizada utilizando uma determinada máquina qPCR, de modo que os operadores que utilizam outras plataformas qPCR devem otimizar as condições para seus equipamentos. A eficiência da remoção do DNA é controlada por uma única reação por amostra na ausência de RT. Um resultado positivo dessa reação significa remoção incompleta do DNA. Amostras de alta carga que têm altas quantidades de DNA podem exigir o dobro da quantidade de enzima DNase para remover completamente o DNA. Felizmente, em amostras de alta carga bacilo, a presença de pequenas quantidades de DNA é menos provável que afete o resultado do RNA. O RNA ribossômico, o alvo TB-MBLA, ocorre naturalmente em dobro da quantidade de DNA³⁷. No PCR, um controle sem modelo (NTC), que é a água usada para dissolver os reagentes pcr, controla a contaminação cruzada com DNA exógeno ou RNA. Um sinal positivo no NTC implica contaminação cruzada e o resultado considerado inválido. Isso significa que todas as soluções constituídas com esta água devem ser descartadas e novas feitas usando um frasco fresco de água. É aconselhável manter a água PCR em alíquotas separadas para evitar a contaminação de toda a água. Um controle positivo (Mtb RNA) é usado para controlar a eficiência geral do PCR.

A análise dos resultados envolve a conversão de PCR Cqs em carga bacteriana (ou seja, as unidades de formação de colôniaestimadas por mL) utilizando a curva padrão. Definir e otimizar a curva padrão é crucial para esta etapa. Recomenda-se uma eficiência de curva padrão de 0,95-1. As curvas padrão para MTb e controle de extração devem ser configuradas e otimizadas antes que pacientes ou outras amostras de teste sejam executadas na máquina. As amostras padrão são fornecidas com o kit TB-MBLA. Recomenda-se uma diluição dez vezes maior do extrato de RNA para PCR. Isso implica que o resultado da carga bacteriana deve ser multiplicado por um fator de 10 para obter o resultado final da carga bacteriana por mL. É importante notar que cqs acima de 30 são considerados negativos para TB-MBLA. Um mínimo de dois resultados potenciais de carga bacteriana medidos em diferentes pontos de tempo é necessário para fazer uma inferência sobre a resposta ao tratamento. Recomenda-se fortemente que um dos dois resultados seja a linha de base, antes do início do tratamento. No entanto, se o paciente iniciou a avaliação da carga bacteriana no meio do tratamento, deve haver uma segunda medição de carga bacteriana ponto de tempo para avaliar a resposta do tratamento. Tb-MBLA pode distinguir a carga bacteriana em um espaço de 3 dias no tratamento, mas o ideal são duas medidas de carga bacteriana tomadas com 7 dias de intervalo.

Embora o protocolo gere resultados quantitativos informativos para a resposta ao tratamento, ele ainda é em grande parte manual e exige mãos substanciais no tempo para a extração de RNA. Técnicos em laboratórios ocupados podem não ter desta vez. Estão em andamento arranjos para automatizar os processos de extração de RNA e PCR.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Inativação de calor:
15 mL Tubos de centrífuga	Fisher-Scientific	10136120	Tubos de 50 mL podem ser usados se volumes de amostra maiores estiverem envolvidos Rack
tubo de arame de 15 mL	Fisher-Scientific	11749128	Outras marcas com marca semelhante podem ser usadas
Banho-maria	Fisher-Scientific	15700619	Outras marcas com marca semelhante podem ser usadas
Extração de RNA:
Clorofórmio	Sigma	372978-1L	Não é necessário em outras marcas de kits de extração de RNA
Etanol, absoluto 99-100%	Sigma	51976-500ML-F	Maior volume disponível
Controle de extração	Grupo SOI St Andrews	VitalbacteriaEC	Fornecido com o TB-MBLA Kit Vitalbacteria
FASTRNA Pro blue Kit	MP Biomedicals	116025050	Fornecido com tubos de matriz de lise
Água de grau molecular (sem RNase)	Sigma	W4502-1L	Qiagen, Fisherscientific também pode fornecer o mesmo produto
Homogeneizador Precellys 24	VWR	432-3750	FastPrep MP Biomedicals também pode ser usado
Microcentrífuga refrigerada, Fresco 21, Heraeus	Fisher-Scientific	15352117	Outras marcas com capacidade semelhante podem ser usadas
Thermomixer	Eppendorf	BLD-455-010C	Funciona com tubos de 1-2 mL
TURBO sem DNA	Fisher-Scientific	AM1907M	Leva mais tempo, mas é mais eficaz do que procedimentos de remoção de DNA mais curtos.
RT-qPCR:
Primers e sondas Taqman	Grupo SOI St Andrews	VitalbacteriaPP	Fornecido com o kit TB-MBLA Vitalbacteria. Os fluoróforos da sonda são FAM (verde) para Mtb e HEX (amarelo) para controle de extração (EC). As plataformas de qPCR da Applied Biosystems usam VIC em vez de HEX.
QuantiTect Multiplex RT-PCR NR Kit	Qiagen	204845	mistura de PCR mais a enzima RT
RotorGene Q 5plex máquina	Qiagen	9001580	Outras máquinas qPCR: Vii7, Quantistudio, Steponelus etc. podem ser usadas
Tubos de tira e tampas, 0,1 mL	Qiagen	981103	Outros tamanhos de tubos disponíveis dependendo do tamanho do rotor. Para outras plataformas de PCR, são necessárias placas de PCR de 96 poços.
Inactivação sem calor Materiais de preservação da amostra
1 M Tris-HCl pH 7,5	Sigma	93313	Fornecido pronto a usar
2-Mercaptoetanol	Sigma	63689	Muitos fornecedores competentes
Tiocianato de guanidina (GTC)	Promega	V2791	Marca Promega recomendada para água
de qualidade Molecular (	Sigma	W4502-1L	Garante que a solução GTC esteja livre de nucleases
Materiais gerais (usados, mas não específicos para TB-MBLA)
500 mL recipientes		734-5087	Marca Nalgene recomendada
Frascos de descarte de resíduos biológicos			Muitos fornecedores competentes
Frascos de descarte de	resíduos químicos		Muitos fornecedores competentes
Luvas descartáveis, resistentes a			Muitos fornecedores competentes
Freezer (-20 ° C)			Muitos fornecedores competentes
Freezer (-80 ° C)			Muitos fornecedores competentes
Geladeira (0-8 ° C)			Muitos fornecedores competentes
Hotte			Para manuseamento seguro de reagentes
tóxicos Balanças			de laboratório Para medição precisa de reagentes
Cilindros
Tubos de reação PCR	Deve ser adequado ao instrumento de PCR utilizado
Pipetas e pontas de pipeta filtradas estéreis correspondentes,			sem DNAse e RNAse, gama: P1000, P200, P10, P2 recomendado
Placas de carregamento Qiagility	Placa de mistura mestre de 5 poços Qiagen, placa de reagente de 16 poços, placa de amostra de 32 poços, placas de reação de 72 poços e 96 poços
Racks para microtubos de 1,5 mL e 2 mL e para tubos			Resistente a produtos químicos e autoclavável recomendado
RNase Away (Remove enzimas RNases do espaço de trabalho)	Fisher Scientific	10666421	Importante garantir que os serviços e dispositivos estejam livres da enzima RNase
Óculos de segurança, resistentes a produtos químicos	Fisher Scientific		Também pode ser obtido na Sigma. Proteja os olhos de reagentes tóxicos.
Pipetas Pasteur estéreis, 1,5-3 mL			Muitos fornecedores competentes
Microtubos			Tubos de 1,5 mL adequados para congelamento a -80 ° C
recomendado desinfetante para TB, por exemplo, Tristel Fuse			Certifique-se de que está recém-preparado ou preparado dentro de uma semana
Marca Vortex			Genie 2 recomendado
Microscopia eletrônica de transmissão
Glutaldeído (8%)	Sigma	G7526-10ML	Parte do tampão de fixação celular (tampão HEPES)
HEPES ( pH 7,4, 100 mM)	Sigma	H4034-25G	Parte do tampão de fixação celular (tampão HEPES)
Leica FCS ultracryo	Leica		Cryomicrotome para seccionamento de tecidos
Ágar metilcelulose	Ágar Scientific	AGG6425	Resina de montagem a frio
Paraformaldeído (4% em PBS)	Sigma	P6148-500G	Parte do tampão de fixação celular (tampão HEPES)
Sacarose	Preservação de Sigma	84097-250G
mancha universal universal da microscopia	acetato de Uranyl	do meio de montagem Coloração científica	AGR1260A