Cultura, Manipulação e Transplante Ortotópico de Organoides tumorais da bexiga de camundongo

O câncer de bexiga é o câncer de trato urinário mais prevalente, com aproximadamente 165.000 pacientes morrendo anualmente¹. Entre os vários tipos de câncer de bexiga, o carcinoma urotelolial invasivo por músculos apresenta um fenótipo agressivo, e sua taxa de sobrevivência de 5 anos é inferior a 50%². Novas opções terapêuticas para tumores uroteliais invasivos não foram expandidas nas últimas décadas¹.

As linhas de células cancerígenas têm sido amplamente usadas para o rastreamento de medicamentos³. Embora os resultados favoráveis tenham sido observados em numerosos candidatos a medicamentos em linhas de células cancerosas, resultados ruins são relatados em ensaios clínicos⁴. Após o aumento da adaptação a ambientes culturais bidimensionais in vitro (2D), tornou-se cada vez mais difícil recapitular tumores nativos em linhas celulares. Modelos de câncer animal ou xenoenxertos tumorais derivados do paciente podem ser usados para lidar com as limitações observadas nas linhas celulares cancerosos da bexiga. No entanto, os modelos de câncer animal são intensivos em tempo e recursos. Portanto, os modelos de doenças melhorados estão demanda há anos e um novo sistema modelo, organoides, foi desenvolvido para superar as deficiências dos modelos⁵existentes.

Um organoide é uma construção 3D multicelular que pode recapitular in vitro as características fisiológicas de seu órgão in vivo correspondente. Os organoides normais e tumorais podem ser derivados de células-tronco pluripotentes ou adultas, e células tumorais primárias, respectivamente^5,6. Nos últimos anos, os organoides tumorais foram estabelecidos a partir de um grande número de diversos tecidos tumorais⁷, incluindo cólon^8,9, bexiga^10,pâncreas^11,12, próstata¹³, fígado¹⁴, e tecido tumoral de¹⁵ mamas. Tais organoides tumorais imitam seus tumores originais fenotipicamente e geneticamente. Devido à sua semelhança com os tecidos tumorais vivos e suas inúmeras aplicações práticas, os pesquisadores os adotaram como novos modelos de doençano estudo da patogense do câncer.

Aqui, estão estabelecidos os procedimentos para o estabelecimento de organoides tumorais a partir de um tumor urotellial invasivo induzido por cancerígeno^16. A nitrosamina n-butil-N-(4-hidroxibutyl) é usada como cancerígeno para induzir o carcinoma urotelial invasivo em camundongos¹⁷ e os organoides tumorais, que apresentam as características patológicas dos tumores de bexiga invasivos por ratos, são estabelecidos a partir do câncer de bexiga murina induzido pelo BBN¹⁶. O método para manipular geneticamente os organoides tumorais é ilustrado usando transdução mediada por lentivírus para desenvolver um sistema modelo para estudar a base molecular do desenvolvimento do câncer de bexiga. Além disso, é descrito um método de transplante de organoides ortotópico em uma bexiga para investigar o papel do ambiente nativo da bexiga no câncer de bexiga.

Todos os procedimentos foram aprovados e conduzidos as diretrizes do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais do POSTECH (número do IACUC: POSTECH-2019-0055).

1. Cultura In Vitro de Organoides tumorais da bexiga

1. Estabelecer organoides tumorais da bexiga a partir do tumor da bexiga murina (Figura 1Um).
   NOTA: O procedimento para gerar tumores de bexiga de camundongo induzidos por BBN é delineado em Shin et al.¹⁷.
   1. Forneça 0,1% de água contendo BBN em uma garrafa escura para o ad libitum do mouse por 6 meses. Troque a água contendo BBN 2x por semana.
      NOTA: Foi utilizado um rato macho C57BL/6 com peso corporal de aproximadamente 25 g aos 8 e 10 semanas de idade. A água contendo BBN pode ser administrada até cinco ratos em uma única gaiola.
   2. Após 6 meses, eutanize o camundongo usando inalação de dióxido de carbono e isole todo o tumor da bexiga. Transfira para uma placa de Petri de 90 mm.
   3. Remova partes não cancerígenas e regiões necróticas usando tesouras cirúrgicas estéreis e lave os fragmentos do tumor da bexiga 2-3 vezes com o sorolo tampão de fosfato (DPBS) de 1x Dulbecco frio. Pegue os fragmentos e transfira-os para uma nova placa de Petri de 90 mm.
   4. Adicione 1 mL do meio mínimo essencial modificado de Dulbecco (DMEM) com 10 mM 4-(2-hidroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic (HEPES).
   5. Pique o tecido tumoral em pedaços o menor possível (0,5-1 mm³) usando uma lâmina de barbear esterilizada.
   6. Adicione 9 mL de DMEM com HEPES de 10 mM, 250 μg/mL coloagenase tipo I, 250 μg/mL coloagenase tipo II, e 250 Termollysin U/mL. Incubar o tecido tumoral picado por 1,5-2 h em um agitador orbital em uma incubadora (37 °C, 5% CO₂) para dissociar os fragmentos na suspensão celular. Transfira a suspensão da célula para um tubo de 50 mL.
      NOTA: Se o tamanho do tumor colhido do camundongo for superior a 1 cm^3,trate-o com 2x a quantidade de termolysina ou aumente o tempo de incubação.
   7. Centrífuga o tubo a 400 x g por 5 min a 4 °C e aspirar o supernatante.
   8. Resuspender a pelota usando 5 mL de tampão de lysing de amônio-cloreto-potássio (ACK) para lyse quaisquer glóbulos vermelhos. Incubar o tubo por 3-5 min à temperatura ambiente (RT) até a lise completa dos glóbulos vermelhos.
      NOTA: Se os glóbulos vermelhos não forem observados, omita o processo de lising.
   9. Adicione 20 mL de DMEM no tubo. Centrífuga o tubo a 400 x g por 5 min a 4 °C e aspirar o supernatante.
   10. Suspenda novamente a pelota com 1 mL de 0,25% Trypsin-EDTA e 10 μM Y-27632 dicloridor (Y-27632) para dissociar a pelota em células únicas. Incubar o tubo por 5 min em um banho de água de 37 °C.
       NOTA: Observe o tumor um microscópio para confirmar a dissociação completa em células únicas. Se pedaços de células persistirem, pipeta a suspensão ainda mais.
   11. Neutralizar a trippsina utilizando 10 mL de DMEM com soro bovino 10% fetal (FBS). Filtrar a suspensão da célula através de um filtro de célula de 100 μm em um novo tubo de 50 mL para remover os detritos não digeridos.
   12. Centrífuga o tubo a 400 x g por 5 min a 4 °C e aspirar o supernatante.
   13. Cubra um poço em uma placa de 24 poços usando 150 μL de fator de crescimento frio reduzido matriz de membrana do porão (Tabela de Materiais) e coloque a placa de poço 24 em uma incubadora (37 °C, 5% CO₂) por 30 min para solidificar a matriz de membrana do porão.
       NOTA: Descongele e mantenha a matriz de membrana do porão a 4 °C para evitar solidificação antes do uso.
   14. Resuspender a pelota usando 1 mL de DMEM e conte as células usando um hemocímetro. Transfira 3-4 x 10⁴ células tumorais em um microtubo de 1,5 mL no gelo.
   15. Centrífuga o microtubo a 400 x g por 3 min a 4 °C e descarte cuidadosamente o supernatante.
   16. Resuspender as células com 500 μL de meio organoide pré-aquecido(Tabela 1) e 10 μM Y-27632 e transferi-las para o poço revestido. Coloque a placa de 24 poços em uma incubadora (37 °C, 5% CO₂).
   17. As células tumorais extras da bexiga podem ser estocados com 1 mL de DMEM contendo 10% de FBS, 1% penicilina/estreptomiacina e 10% sulfoxida de dimetila (DMSO) em crioviais de 1,5 mL. Coloque-os em um recipiente de congelamento criovial e transfira o recipiente para um freezer de -80 °C. Depois de armazenar no congelador durante a noite, transfira os crioviais para nitrogênio líquido para armazenamento a longo prazo.
   18. Altere o meio a cada 2 dias usando 500 μL de meio organoide pré-aquecido(Figura 1B).
2. Organoides tumorais de bexiga subcultura.
   NOTA: Recomenda-se a passagem de organoides tumorais da bexiga quando atingirem 100-150 μm de diâmetro.
   1. Adicione 500 μL de colagenase/dispase ao meio organoide na placa de 24 poços com organoides tumorais. Pipette para cima e para baixo a matriz de membrana do porão e o meio. Incubar por 20 min a 37 °C e colher as células em um tubo de 15 mL.
      NOTA: Examine os organoides isolados da matriz de membrana do porão um microscópio. Se os organoides não forem separados da matriz da membrana do porão, aumente o tempo de incubação ou pipeta mais vezes.
   2. Adicione 5 mL de DMEM pré-aquecido, centrífuga o tubo a 400 x g por 3 min a 4 °C, e aspirar o supernatante.
   3. Resuspender a pelota usando 1 mL de pré-aquecido 0,25% trypsin-EDTA e 10 μM Y-27632. Incubar por 5 min em um banho de água de 37 °C. Vigorosamente pipette as células para cima e para baixo e neutralizar a trippsina usando 5 mL de DMEM com 10% FBS.
   4. Centrífuga o tubo a 400 x g por 3 min a 4 °C e aspirar o supernatante.
   5. Resuspender a pelota usando 1 mL de meio organoide pré-aquecido e conte o número de células tumorais únicas.
   6. Repita as etapas 1.1.14-1.1.18.

2. Manipulação Genética de Organoides tumorais da bexiga usando transdução mediada por lentivírus(Figura 2A)

1. Produzir as partículas lentivirais expressas pelo GFP.
   1. No dia 0, placa HEK 293T células em uma densidade de 5-6 x 10⁶ células por placa de cultura celular de 10 cm em meio de cultura de linha celular (ou seja, DMEM com 10% FBS e 1% de penicilina/estreptomicina).
   2. No primeiro dia, prepare a solução de transfecção de DNA, incluindo plasmídeo de transferência contendo GFP (8 μg), plasmídeo de embalagem lentiviral (10 μg de pCMVR 8,74 e 3 μg de pMD2.G) e 1 mL de meio soro reduzido (Tabela de Materiais).
   3. Adicione 3 μL de reagente de transfecção(Tabela de Materiais) por 1 μg de plasmídeo total de acordo com as instruções do fabricante e misture suavemente tubulando. Incubar por 20 min na RT e adicionar 9 mL de DMEM com 10% de FBS.
   4. Aspirar o meio cultural na placa de cultura celular com células HEK 293T. Transfira cuidadosamente 10 mL da solução de transfecção de DNA para as células HEK 293T e incuba restou em uma incubadora de cultura celular a 37 °C.
   5. No dia 3, observe as células um microscópio de fluorescência (excitação a 488 nm e emissão a 512 nm) para determinar a eficiência da transfecção. Quase 90% a 100% das células de toda a população celular devem expressar GFP.
   6. Colete o supernatante (contendo o vírus) e filtra o supernatant com um filtro de polietersulfone de 0,45 μm (PES).
      NOTA: Use um filtro de baixa ligação proteica, como um filtro PES.
   7. Para concentrar o vírus, centrífuga o vírus supernatant em 98.768 x g em um ultracentrífuga por 2 h a 4 °C em um rotor de balde balançando (Tabela de Materiais) e descarte cuidadosamente o supernatante.
   8. Resuspender a pelota em 2,5 mL de meio organoide frio.
   9. Para armazenamento a longo prazo, alíquota de 250 μL de meio lentiviral em frascos criogênicos e congelá-los usando nitrogênio líquido. Guarde os estoques virais congelados em um freezer de -80 °C.
2. Realizar transdução mediada por lentivírus dos organoides tumorais da bexiga.
   1. No dia 2, divida os organoides tumorais descritos acima (passo 1.2) 12 h antes da transdução mediada por lentivírus.
   2. No dia 3, descongele rapidamente uma alíquota (passo 2.1.9) contendo vírus em um banho de água de 37 °C e adicione os 250 μL de meio organoide com 10 μM Y-27632 e 8 μg/mL hexadimethrine brometo.
   3. Substitua o meio organoide na placa de 24 poços por organoides tumorais por 500 μL de meio contendo vírus e incubação por 12-16 h em uma incubadora (37 °C, 5% CO₂).
   4. No dia 4, mude o meio com 500 μL de meio organoide fresco.
      NOTA: Após 12-16 h de incubação, o meio deve ser alterado, pois o meio contendo lentivírus e brometo de hexadimetrina é citotóxico.
   5. No dia 6, monitore o sinal GFP dos organoides tumorais 3 dias após a transdução um microscópio de fluorescência (Figura 2B).
   6. No dia 10, passagem e estocagem os organoides 7 dias após a transdução conforme descrito na etapa 1.2, para manter as linhas organoides tumorais geneticamente modificadas.

3. Transplante ortotópico de Organoide bexiga (Figura 3A)

1. Prepare os organoides tumorais da bexiga para transplante ortotópico.
   1. Antes do transplante, a cultura do tumor da bexiga organoides por 5 a 7 dias, conforme descrito acima (passo 1.2).
   2. Adicione 500 μL de colagenase/dispase ao meio organoide em uma placa de 24 poços com organoides tumorais. Pipette para cima e para baixo a matriz de membrana do porão e meio. Incubar por 20 min a 37 °C e coletar as células em um tubo de 15 mL.
   3. Adicione 5 mL de DMEM pré-aquecido, centrífuga o tubo a 400 x g por 3 min a 4 °C, e aspirar o supernatante.
   4. Resuspender a pelota com 1 mL de DMEM e transfira a solução para uma placa de Petri de 90 mm.
   5. um microscópio, pegue os organoides tumorais de 10 a 100 usando uma micropipeta p200 e recolhe-os em um microtubo no gelo.
   6. Centrífuga o tubo a 400 x g por 3 min a 4 °C e descarte cuidadosamente o supernatante.
   7. Mantenha a pelota celular no gelo até que os ratos estejam prontos para cirurgia.
2. Transplante de parede submucosal da bexiga
   NOTA: Este procedimento é modificado a partir do protocolo publicado por Fu et al¹⁸.
   1. Prepare um rato nu masculino de 8 a 10 semanas (CAnN.Cg-Foxn1nu/Crl) pelo menos 1 semana antes do experimento para permitir que ele se aclimate a um novo ambiente. Injete enrofloxacina (5 mg/kg) subcutâneamente 24h antes da cirurgia.
   2. Limpe a superfície do banco por água e sabão. Autoclave os instrumentos cirúrgicos antes do procedimento cirúrgico e realizar cirurgia utilizando instrumentos estéreis.
   3. Mantenha a seringa de insulina de 29 G, dicas de pipeta e matriz de membrana do porão no gelo. Administrar cetoprofeno (5 mg/kg) subcutâneamente antes da administração da anestesia.
   4. Anestesiar o rato com 4% de isoflurano em uma câmara de indução. Uma vez que a anestesia geral alcançada, coloque o rato em uma posição supina e mantenha anestesia por inalação de 2% de isoflurano vaporizado.
      NOTA: Se o tempo de anestesia for superior a 30 min, aplique pomada ocular em ambos os olhos usando um cotonete de algodão para evitar a secagem da córnea.
   5. Aplique povido-iodo com uma gaze estéril e limpe-o com 70% de etanol. Repita 3x com uma nova gaze ou um cotonete de algodão cada vez.
   6. Cubra o ânus e o campo cirúrgico usando cortinas cirúrgicas descartáveis e estéreis.
   7. Usando um microscópio dissecando para ampliação, faça uma pequena incisão transversa (menor que 1,5 cm) na pele e parede muscular do abdômen médio inferior com tesoura cirúrgica estéril. Exponha a bexiga da cavidade abdominal e apoie-a com cotonetes de algodão encharcado salinos.
      NOTA: Se a bexiga estiver cheia de urina, pressione suavemente a bexiga para descomprimi-la ligeiramente.
   8. Resuspender as pelotas organoides (passo 3.1.7) em 80 μL de meio organoide contendo 50% de matriz de membrana do porão de alta concentração(Tabela de Materiais).
   9. Injete a suspensão organoide no aspecto anterior da cúpula da bexiga usando a seringa de insulina de 29 G um microscópio dissecando.
   10. Feche a camada interna da parede abdominal com sutura absorvível antibacteriana e, em seguida, feche a camada externa com sutura de nylon 4-0. Desinfete o local cirúrgico com povido-iodo e 70% de etanol.
   11. Deixe o rato se recuperar um irradiador infravermelho de 10 a 15 min. Monitore o rato até que recupere a consciência e a motilidade.
   12. Um dia após a cirurgia, verifique a condição geral do rato e vazamento anastomótico. Administrar cetoprofeno (5 mg/kg) uma vez por dia por 3 dias após o funcionamento e tratar enrofloxacina (5 mg/kg) uma vez por dia durante 10 dias pós-operatório.
   13. Quando o local de incisão tiver curado (10-14 dias após a cirurgia), remova as suturas. Monitore o crescimento do tumor da bexiga do camundongo por 2 a 3 semanas após a injeção de organoide tumoral.
   14. Se o crescimento do tumor da bexiga for observado, eutanásia o camundongo usando inalação de dióxido de carbono, e colher todo o tumor da bexiga. Lave-o usando DPBS frios(Figura 3B)¹⁶.
   15. Para analisar a histologia tumoral da bexiga, manusee a seção incorporada à parafina do tecido utilizando hematoxilina e eosina(Figura 3B)¹⁶.

Cultura in vitro de organoides tumorais de bexiga de camundongo
O número de células tumorais dissociadas de um tumor induzido por ~1 cm3 BBN é de pelo menos 4 x 105 células. Quando as células são inicialmente semeadas na matriz de membrana do porão, células não cancerígenas e detritos podem ser observados. Os destroços foram gradualmente diluídos pela continuidade da subcultura. A Figura 1B mostra imagens dos organoides cultivados em diferentes pontos de ponto. Se as células tumorais não formam organoides tumorais, as células estão potencialmente mortas durante a etapa de dissociação. Nesse caso, os procedimentos de dissociação, incluindo o tempo de incubação com a enzima, precisam ser ajustados para aumentar a viabilidade celular.

Expressão de GFP em organoides tumorais da bexiga usando manipulação genética mediada por lentivírus
Organoides tumorais da bexiga apresentaram fortes sinais de GFP com infecção lentiviral bem sucedida (Figura 2B). Após a concentração, um total de 250 μL de mídia contendo vírus foi suficiente para infectar 3 x 104 células tumorais únicas na matriz de membrana do porão, mantendo 90% a 100% de eficiência de infecção. Sinais de GFP podem ser detectados a partir dos organoides tumorais da bexiga 3 dias após a transdução lentiviral. Se os sinais de fluorescência são baixos, a eficiência da infecção viral é potencialmente baixa. Isso pode ser devido a inúmeros fatores, como o baixo titer viral, e os procedimentos precisam ser ajustados em conformidade.

Transplante ortotópico de organoides tumorais da bexiga
Um aloenxerto de tumor de bexiga obtido de organoides tumorais de bexiga induzidos pelo BBN é apresentado na Figura 3B16. Os aloenxertos de tumor de bexiga foram colhidos 3 semanas após o transplante ortotópico. A histologia do tumor de bexiga transplantado foi analisada utilizando a coloração H e E. Transplantes ortotópicos de organoides tumorais podem crescer como tumores de bexiga por 2 a 3 semanas.

Figura 1: Cultura in vitro de organoides tumorais da bexiga de camundongo. (A)Diagrama esquemática para o estabelecimento de organoides tumorais de bexiga de camundongo. (B) Imagens representativas para a cultura dos organoides tumorais da bexiga em diferentes pontos de tempo. Organoides tumorais de bexiga de camundongo foram estabelecidos e cultivados ao longo de 9 dias. Barra de escala = 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.

Figura 2: Expressão do GFP nos organoides tumorais da bexiga usando manipulação genética mediada por lentivírus. (A)Diagrama esquemática de transfecção lentiviral e transdução de organoides tumorais da bexiga. (B) Imagens representativas de organoides tumorais da bexiga expressando GFP. Barras de escala = 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.

Figura 3: Transplante ortotópico de organoides tumorais da bexiga. (A)Diagrama esquemática de transplante ortotópico de organoides tumorais da bexiga para um rato nu. (B) Imagens representativas de bexigas e seções manchadas de H e E de camundongos ortotópicos transplantados com organoides tumorais da bexiga. Vistas ampliadas das regiões encaixotadas nos painéis médios são mostradas nos painéis esquerdos. Barra de escala = 500 μm. Esse número foi reproduzido a partir da Figura 1-Figure Supplement 1, Kim et al.16,publicada a Creative Commons Atribuição 4.0 International Public License (CC BY 4.0; https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.

Tabela 1: Composição do tumor de bexiga organoide médio.

Os autores não declaram interesses financeiros concorrentes.