Artigo de método

Estudos de Optocardiografia e Eletrofisiologia de Ex Vivo Langendorff-perfundido Corações

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DOI:

10.3791/60472

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7 de novembro de 2019

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1Sheikh Zayed Institute for Pediatric Surgical Innovation, Children's National Hospital, 2Children's National Heart Institute, Children's National Hospital, 3Center for Neuroscience Research, Children's National Hospital, 4Department of Biomedical Engineering, School of Engineering, University of Alabama at Birmingham, 5Department of Pediatrics, Department of Pharmacology & Physiology, School of Medicine and Health Sciences, George Washington University

Neste artigo

Resumo

O objetivo deste estudo foi estabelecer um método de investigação da dinâmica cardíaca por meio de um modelo animal translacional. A abordagem experimental descrita incorpora optocardiografia de dupla emissão em conjunto com um estudo eletrofisiológico para avaliar a atividade elétrica em um modelo cardíaco suíno isolado e intacto.

Resumo

Pequenos modelos animais são mais comumente usados em pesquisas cardiovasculares devido à disponibilidade de espécies geneticamente modificadas e menor custo em comparação com animais maiores. No entanto, mamíferos maiores são mais adequados para questões de pesquisa translacional relacionadas à fisiologia cardíaca normal, fisiopatologia e testes pré-clínicos de agentes terapêuticos. Para superar as barreiras técnicas associadas ao emprego de um modelo animal maior em pesquisas cardíacas, descrevemos uma abordagem para medir parâmetros fisiológicos em um coração de leitão isolado, perfundido em Langendorff. Essa abordagem combina duas poderosas ferramentas experimentais para avaliar o estado do coração: estudo de eletrofisiologia (EP) e mapeamento óptico simultâneo de tensão transmembrana e cálcio intracelular usando corantes sensíveis ao parâmetro (RH237, Rhod2-AM). As metodologias descritas são adequadas para estudos translacionais que investigam o sistema de condução cardíaca, alterações na morfologia potencial de ação, manuseio de cálcio, acoplamento de excitação-contração e incidência de alternans cardíacos ou Arritmias.

Introdução

A doença cardiovascular é uma das principais causas de doença e morte em todo o mundo. Como tal, um foco de pesquisa primária é otimizar metodologias que podem ser usadas para estudar a fisiologia cardíaca normal e mecanismos subjacentes que podem contribuir para a morbidade e mortalidade em seres humanos. A pesquisa cardiovascular básica tem tradicionalmente contado com pequenos modelos animais, incluindo roedores e coelhos1,2,3,devido à disponibilidade de espécies geneticamente modificadas4,5, menor custo, menor pegada experimental e maior rendimento. No entanto, o uso de um modelo de porco tem o potencial de fornecer dados mais clinicamente relevantes6. De fato, estudos anteriores documentaram semelhanças na eletrofisiologia cardíaca (EP) entre humanos e suínos, incluindo correntes de íons semelhantes7,ação potencial forma8, e respostas ao teste farmacológico9. Além disso, o coração suíno tem cinética contéci e relaxamento que são mais comparáveis aos seres humanos do que roedores ou coelhos10. Em comparação com um modelo canino, a anatomia coronariana porsina mais se assemelha a um coração humano11,12 e é o modelo de escolha para estudos focados no desenvolvimento cardíaco, cardiologia pediátrica e/ou defeitos cardíacos congênitos 13.Embora existam diferenças entre o porco eo coração humano8, essas semelhanças fazem o coração suíno um modelo valioso para a pesquisa cardiovascular14.

A perfusão retrógrada do coração tornou-se um protocolo padrão para estudar a dinâmica cardíaca ex vivo15 desde a primeira estabelecida por Oskar Langendorff16. Assim, a perfusão de Langendorff pode ser usada para suportar um coração isolado e intacto na ausência de influências autonônicas. Este modelo é uma ferramenta útil para comparar diretamente a eletrofisiologia cardíaca e a contratilidade entre corações saudáveis e não saudáveis. Uma vez que a dinâmica cardíaca é temporal e espacialmente complexa, uma ligeira alteração em uma região pode afetar drasticamente a capacidade do coração inteiro de trabalhar como um sincicamente17. Portanto, imagens de alta espaçotemporal de corantes sensíveis ao parâmetro é uma ferramenta útil para monitorar a função cardíaca em toda a superfície do coração18,19. De fato, a dupla imagem simultânea de sondas fluorescentes sensíveis à tensão e ao cálcio permite a avaliação da atividade elétrica, manuseio de cálcio e acoplamento de contração de excitação no nível do tecido20,21, 22,23,24,25,26,27,28. Langendorff-perfusão e/ou técnicas de mapeamento óptico têm sido usadas anteriormente para documentar o declínio do desempenho cardíaco devido ao envelhecimento ou mutações genéticas, e para avaliar a segurança de agentes farmacológicos ou exposições ambientais29 30,31,32,33.

No ajuste clínico, um estudo cardíaco invasor da eletrofisiologia é usado frequentemente para investigar distúrbios do ritmo cardíaco, identificar patologias, e identificar opções possíveis do tratamento. Da mesma forma, descrevemos um protocolo de EP que pode ser usado para avaliar a função do nó sinuoso, medir a condução atrioventricular e identificar a refratação do tecido do miocárdio. O estudo de EP descrito pode ser realizado em conjunto com mapeamento óptico, ou optocardiografia34,para caracterizar totalmente a fisiologia cardíaca em corações isolados. No protocolo descrito, a imagem latente da fluorescência da resolução spatiotemporal elevada foi executada com uma combinação de corantes da tensão (RH237) e do cálcio (Rhod-2AM) em uma configuração dupla da emissão. Além disso, os parâmetros de eletrofisiologia cardíaca foram monitorados o ritmo do sinuoso e em resposta à estimulação elétrica programada.

Protocolo

Todos os experimentos foram realizados de acordo com o Guia Nacional de Saúde para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório (Oitava Edição). Todos os métodos e protocolos utilizados nesses estudos foram aprovados pelo Comitê Institucional de Protocolo de Cuidados e Uso de Animais do Hospital Nacional da Criança seguindo as Diretrizes de Cuidados e Uso de Animais de Laboratório publicadas pelo NIH. Todos os animais utilizados neste estudo receberam cuidados humanos em conformidade com o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório.

1. Preparação

  1. Prepare 6 L de krebs-henseleit modificado solução16 (mM: 118.0 NaCl, 3.3 KCl, 1.2 MgSO4,24.0 NaHCO3, 1.2 KH2PO4,10.0 glicose, 2.0 sódio pyruvate, 2% albumina, 2.0 CaCl2). Adicione CaCl2 no dia do experimento, uma vez que ao longo do tempo, na presença de fosfatos, cloreto de cálcio vai precipitar terminalmente fora da solução como fosfato de cálcio.
  2. Ajuste o pH para 7,4 após filtragem estéril (tamanho dos poros: 0,22 μm). Verifique a osmolalidade da solução para garantir um alcance de 275 a 310 mOsm/kg. Cool 1 L no gelo para uso imediatamente após o coração é extrido. Aqueça 3 L em um banho de água para aproximadamente 37 °C antes de borbulhar com carbogênio (95% O2,5% CO2).
    Nota: O aquecimento minimiza bolhas e embolia potencial, uma vez que o líquido frio tem uma maior capacidade de gás para dissolver; Portanto, à medida que a mídia Krebs-Henseleit modificada passa pelo sistema de perfusão e aquece, o gás será liberado como bolhas.
  3. Prepare 2 L de cardioplegia (solução de cardioplegia modificada de l Nido, Tabela 1). Congele cardioplegia suficiente em uma bandeja de cubo de gelo para encher um copo de 500 mL.
  4. Ligue os banhos de água circulantes definidos para 42 °C. Ligue as bombas para circular o perfusato em um ciclo de aquecimento hidrônico fechado (para uma lista completa de materiais, ver Tabela de Materiais e Figura 1).
    Nota: Um banho de água circulante aquecido é usado para aquecer os tubos resumidos à água e trocadores de calor.
  5. Limpe circuitos e câmaras de tubulação executando 2 L de uma solução de 1% de detergente universal na água através do sistema. Enxágüe todos os circuitos de tubos e câmaras do sistema Langendorff com >4 L de água purificada. Executar bombas até que toda a água tenha sido removida do sistema.
  6. Adicione um filtro de membrana sintética em linha com as bombas de perfusão (filtro de polipropileno, tamanho dos poros >5 μm). Gas a microfiber oxygenator (hemofilter) with 95% O2 and 5% CO2 at 80 kPa.
    Nota: Ao usar albumina, muitas vezes há espumando associada com oxigenação e / ou a atividade de bombeamento através do circuito de tubulação. Um composto anti-espuma (antiespuma emulsão Y30) pode ser adicionado dropwise periodicamente (~ a cada 30 min) para saciar-lo como ocorre.
  7. Verifique uma calibração de dois pontos (0 e 60 mmHg) para o sensor de pressão localizado acima da aorta ou na armadilha da bolha; calibrar conforme necessário.
  8. Imediatamente antes da excisão cardíaca, despeje a mídia no sistema de perfusão de loop Langendorff. Certifique-se de que o perfusato passa através de oxigenadores de microfibra (hefiltros) gaseados com perfusado oxigenado, que então flui através de trocadores de calor para manter uma temperatura perfusate de mídia de 37 °C na aorta.
  9. Defina o banho de água circulante a alguns graus acima de 37 °C, como 42 °C, para explicar a perda de calor durante a troca e em todo o sistema. Monitore a temperatura perfusate circulante com termocasais.

2. Excisão do coração e Langendorff-perfusão

  1. Sedao o porco com uma injeção intramuscular (I.M.) de cetamina (20 mg/kg) e xilazine (2 mg/kg) e intuito com tubo endotraqueal. Para indução, administrar uma injeção intravenosa (I.V.) bolus de fentanil (50 μg/kg) e rocurônio (1 mg/kg). Manter anestesia com Isoflurano inalado (0,5 a 3%), fentanil (10 a 25 μg/kg) e pancurônio (1 mg/kg).
    Nota: Para este estudo de prova de princípio, foram utilizados porcos juvenis de Yorkshire (14 a 42 dias, n = 18) que variaram de 2,5 a 10,5 kg de peso corporal e 18 a 137 g de peso cardíaco (Figura 2). Se for necessária uma injeção adicional para indução, a cetamina (10 mg/kg) pode ser injetada em I.M.
  2. Uma vez que o animal é completamente anestesiado e não responsivo, realize uma sternotomia para expor a aorta ascendente e o átrio direito.
    1. Usando um bisturi, faça uma incisão midline da parte superior do esterno na inseto torácica, até o processo xifórico. Com um cautery (ou tesoura), dissecar a gordura subjacente e músculo até que o esterno é visível.
    2. A partir do processo xifórico, corte a linha média do esterno até o espartio com uma tesoura de osso cirúrgico ou uma serra óssea. Insira retratores na incisão para expor o coração.
  3. Entregue uma dose de heparina (300 U/kg) ao átrio direito, usando uma agulha e seringa de 18 G, para minimizar coágulos de manchas na excisão de órgãos. Coloque almofadas absorventes na cavidade torácica e gelo ao redor do coração.
  4. Com tesoura, corte cuidadosamente o pericásio, isole a aorta por dissecção contundente do tecido conjuntivo circundante, e aperte a aorta logo abaixo do primeiro ramo arterial no arco da aorta. Usando uma seringa de 50 mL com uma agulha de 18 G, injete cardioplegia gelada (20 mL/kg) através do topo da aorta ascendente.
  5. Corte os vasos que levam ao coração e retire o coração com a aorta ascendente intacta e mergulhe o coração extirpciado na cardioplegia gelada.
  6. Segure as paredes da aorta com um par de hemostats e coloque-o em uma cânula nervurada anexada à tubulação que leva a 1 L de mídia cardioplegia gelada suspensa acima do coração (~ 95 cm para fornecer ~ 70 mm Hg). Permita que o líquido entre e encha a aorta até que transborde para evitar que qualquer bolha entre na vasculatura.
    Nota: O uso de um desacoplador mecânico (monoxime mecânico da butanediona [BDM] ou do blebbistatin) diminuirá a taxa de perfusão coronária enquanto a demanda do oxigênio do tecido declina.
  7. Proteger a aorta para a cânula usando fita umbilical e ancorá-lo ainda mais amarrando os hemostats para suportar o peso do coração, que agora está pendurado na cânula (Figura 1C). Permita que a mídia fria retrograde perfundir o coração a uma pressão constante de 70 mmHg através da gravidade. Mantenha o coração submerso em cardioplegia fria até que esteja pronto para ser transferido para o sistema de perfusão Langendorff aquecido (37°C) (<10 min).
    Nota: A aorta em corações menores (<50 g, até 2 semanas de idade porco) vai suportar o peso do coração, mas corações maiores estão em risco de escorregar da cânula. Durante a cannulação inicial e ao mover-se para o sistema aquecido, impedir que o ar entre na aorta, o que pode causar emboli a coronário. Use tubos de perfuração grandes (>3/8" diâmetro interno) que permite que as bolhas subam mais rápido do que a solução que entra na aorta.
  8. Transfira o coração para o sistema Langendorff (37 °C) sem introduzir ar na cânula. Permita que o ritmo normal do sinuoso para lavar a vasculatura de qualquer sangue restante e cardioplegia.
    Nota: No estudo descrito uma taxa de fluxo inicial média de 184 ± 17 mL/min foi observada em corações juvenis isolados do leitão. A taxa de fluxo caiu para 70 ± 7,5 mL/min (média ± SEM) após perfusão com mídia aquecida contendo um desacoplador mecânico (20 mM BDM). Não submergir o tecido cardíaco, pois pode interferir em imagens cardíacas. A temperatura do tecido é mantida pelo fluxo coronariano no coração do porco devido ao seu maior volume e menor área de superfície, em comparação com roedores. pleno fluxo, as temperaturas epicardium e endocardium variaram de 35 °C a 37 °C, respectivamente.
    CUIDADO: Use equipamentos de proteção individual apropriados, incluindo o desgaste do olho ao trabalhar com desacopladores mecânicos. O coração pode ejetar a mídia de forma rápida e inesperada.
  9. Defibrila o coração em caso de arritmias chocáveis (taquicardia ventricular, fibrilação ventricular) colocando pás externas no ápice e base do coração e entregando um único choque em 5 J, aumentando em incrementos de 5 J (ou tão selecionáveis pelo desfibrilador) até 50 J, cardioversão, ou ritmo não-chocável. Repita os choques a 50 J, se necessário.
    Nota: No estudo apresentado, 89% dos preparativos necessitaram de desfibrilação. Após a equilíbrio (~10 min), observou-se uma frequência cardíaca média de 70 ± 4,5 bpm (média ± SEM) para os corações juvenis de leitões(Figura 2).
  10. Lave o coração com pelo menos 1 L de mídia Krebs-Henseleit modificada, sem recircular, para remover qualquer sangue residual e cardioplegia. Uma vez que a mídia corre clara através do coração, fechar o loop circulante para recircular perfusate.

3. Estudo de Eletrofisiologia

  1. Para registrar um eletrocardiograma II de chumbo padrão (ECG) ao longo do curso de estudo, anexe um eletrodo de agulha 29 G ao epicardium ventricular perto do ápice, com outro eletrodo no átrio direito. Conecte as entradas positivas e negativas de um bioamplificador diferencial ao ápice e ao átrio direito, respectivamente.
  2. Anexe um eletrodo de estímulo bipolar no átrio direito, e um segundo eletrodo de estímulo bipolar para o ventrículo esquerdo lateral para fins de ritmo.
  3. Ritmo do coração usando um estimulador de eletrofisiologia, com a corrente inicial definida para o dobro do limiar diastólico (1-2 mA) e uma largura de pulso 1 ms35,36.
    Nota: Se a estimulação não elicia uma resposta, a largura do pulso pode ser aumentada até 2 ms. Mais atual (~10x) é necessário com grandes eletrodos coaxial (estimulação bipolar).
  4. Identifique o limiar de ritmo aplicando uma série de impulsos de estímulo (1-2 mA, 1 ms largura de pulso) em comprimentos de ciclo de ritmo definidos (PCL) para garantir uma resposta consistente de estímulo.
    Nota: Uma vez que a taxa intrínseca é estabelecida, o trem impulso inicial pode começar em um PCL ligeiramente mais curto.
  5. Realize um ritmo extraestímulo usando um trem de ritmo S1-S1 ou S1-S2, neste último um trem de 6 a 8 impulsos (S1) foi seguido por um único impulso (S2). Diminua o S2 PCL em 10 ms (ou seja, 200 ms, 190 ms, 180 ms, etc.) até não capturar. Passo até o penúltimo PCL (ou seja, 190 ms) e diminuir em intervalos de 1 ms para encontrar o PCL mais preciso antes da perda de captura (ou seja, 184 ms).
    NOTA:     Os mesmos parâmetros de estimulação são usados para S1 e S2 (1-2 mA, 1 ms largura de pulso). Veja a Figura 3 para exemplos representativos, ou valores publicados anteriormente em medições de eletrofisiologia do coração suíno37.
    1. Para estabelecer o período refratário eficaz ventricular (VERP), use o eletrodo de estímulo no ventrículo esquerdo lateral para identificar o intervalo S1-S2 mais curto em que o S2 (batida prematura) inicia a despolarização ventricular.
      Nota: O período refratário é o intervalo de acoplamento S1-S2 alcançável mais curto.
    2. Para definir a duração do ciclo de Wenckebach (WBCL), use o eletrodo de estímulo no átrio direito para encontrar o intervalo S1-S1 mais curto em que 1:1 condução atrioventricular se propaga através da via de condução normal.
      Nota: Não fazer isso representa 2º grau de bloqueio cardíaco.
    3. Para definir o tempo de recuperação do nó do seio (SNRT), use o eletrodo de estímulo no átrio direito para aplicar um trem de ritmo (S1-S1) e medir o atraso de tempo entre o último impulso no trem de estimulação, e a recuperação da atividade espontânea sinoatrial node-mediada.
    4. Para estabelecer o período refratário eficaz do nó atrioventricular (AVNERP), use o eletrodo do estímulo no átrio direito para encontrar o intervalo de acoplamento S1-S2 o mais curto em que a estimulação atrial prematura é seguida por um seu potencial do pacote que elicia um QRS complexo, o que significa despolarização ventricular.

4. Mapeamento óptico da tensão transmembrana e cálcio intracelular

Nota: Um desacoplador mecânico deve ser usado para minimizar artefatos de movimento durante o mapeamento óptico e para evitar a hipóxia3,38,39,40. (-/-) Blebbistatin (5 μM concentração circulante) pode ser adicionado lentamente como uma dose bolus de 0,5 mM em 5 mL de perfusate (100x de concentração final)41. Alternativamente, bdm pode ser inicialmente incluído na mídia perfusate em uma concentração circulante de 20 mm.

  1. Prepare o tinuismo de tensão dissolvendo 5 mg de RH237 em 4 mL de anidro DMSO. Diluir o aliba toque com até 5 mL de mídia e vórtice. Adicione lentamente RH237 (62.1 μg por 500 mL do perfusate) proximal à cânula aórtica.
    Nota: O tecido do miocárdio pode ser remanchado com RH237, se necessário, durante toda a duração do experimento.
  2. Prepare o tinuismo de cálcio dissolvendo 1 mg de Rhod2-AM em 1 mL de anidro DMSO. Misture o corante com 50 μL de ácido plurônico, coloque em um banho sonoro de 37 °C por até 10 min e, em seguida, diluir com até 5 mL de mídia. Adicione lentamente o tinulado de cálcio (50 μg por 500 mL de perfusato) proximal à cânula da aorta.
    Nota: Para garantir a coloração uniforme de corante, os corantes devem ser adicionados lentamente (>30 s). Rhod-2AM leva até 10 min para atingir o pico de fluorescência, enquanto RH237 mancha o coração dentro de um 1-2 min. Usando o carregamento de corante descrito, faixas de proporção de sinal para ruído (SNR) de ~ 42-86 e ~ 35-69 para tensão e cálcio, respectivamente, pode ser esperado. Os valores de SNR podem ser calculados como SNR = (contagem de pico a pico)/(Desvio padrão durante o intervalo diastólico)42.
  3. Posicione o hardware de imagem (câmera, divisor de imagem, lente) como mostrado na Figura 1,para se concentrar em um campo de visão apropriado.
    Nota: O divisor é configurado com um espelho dicroico (660+ nm) que passa RH237 e reflete espectros de emissão Rhod2. Filtros de emissão de alta transmissão são usados para o RH237 (710 nm pass long pass) e Rhod2 (585 ± 40 nm) emitidos luz (passe longo ET710, ver Tabela de Materiais). Uma lente de 50 mm/F0.95l de aluno largo é anexada à frente do divisor de imagem. Essa configuração resulta em separação adequada de luz de emissão, conforme previamente validado43,44.
  4. Conecte a câmera a uma estação de trabalho e adquira imagens usando software selecionado, com um tempo de exposição de 0,5 a 2 ms. Realize alinhamento de imagem com o auxílio de software que pode dividir as regiões desejadas, sobreposição e exibir uma subtração em escala cinza ou pseudo-cor além de destacar o desalinhamento (ver Tabela de Materiais para opção de software).
  5. Desligue a luz do quarto para minimizar a interferência da fluorescência da iluminação ambiental. Teste as luzes LED (525 nm, 1,4 mW/mm2)antes do início da imagem para garantir iluminação epicardial uniforme e máxima, conforme determinado pela profundidade do sensor.
    Nota: Cada luz é direcionada através de um filtro de excitação (535 ± 25 nm). As luzes LED podem ser acionadas manualmente antes das filmagens para maximizar a linearidade do sinal. A fluorescência emitida do epicardium é passada através dos filtros do divisor e da emissão da imagem. Imagens divididas são projetadas em um sensor de alta velocidade. O campo de visão é de aproximadamente 12 cm x 10 cm, ou 5,9 cm x 4,7 cm para cada imagem dividida, dependendo da escolha da lente e distância do coração.
  6. Para estudos de mapeamento óptico, imagem do miocásio durante o ritmo do seio, fibrilação ventricular (Figura 4) ou ritmo dinâmico (S1-S1, 1-2 mA, 1 ms largura de pulso) através de um eletrodo de estimulação posicionado no ventrículo esquerdo (Figura 5). Comece com um comprimento de ciclo de ritmo de 350 ms, e decrement por 10-50 ms para gerar curvas de restituição (Figura 5E)35,36.

5. Limpeza

  1. Retire o coração do sistema e escorra todo o perfusate. Lave a tubulação do sistema e câmaras com água purificada.
  2. Para manutenção de rotina, lave periodicamente o sistema com solução detergente ou uma solução diluída de peróxido de hidrogênio, conforme necessário.

6. Processamento de dados

  1. Confirme a qualidade do sinal óptico em todo o estudo abrindo um arquivo de vídeo, selecionando uma região de interesse e traçando fluorescência média ao longo do tempo usando um pacote de software apropriado ou algoritmo personalizado.
  2. Analise dados de imagem como descritos123,33,43,45,46,para quantificar potencial de ação e parâmetros temporais transitórios de cálcio, incluindo o tempo de ativação, tempo de acoplamento de tensão-cálcio (diferença entre os tempos de ativação de Vm e Ca) e medições de duração da repolarização.
    1. Aplique limites para isolar pixels epicardial fluorescentes e descartar dados de fundo barulhentos.
      Nota: O thresholding simplificará e acelerará a análise em vídeos grandes.
    2. Filtrar espacialmente sinais ópticos sobre uma área de superfície epicardial com tamanhos de kernel variando de 3 mm x 3 mm a 5 mm x 5 mm, como pode ser visto na Figura 4 e Figura 5.
      Nota: Este último irá melhorar o SNR sem distorcer as características potenciais de ação, morfologia transitória de cálcio, ou contorno geral das frentes de onda19,47. Isso pode ser desnecessário se usar um sensor com pixels grandes ou se se binning durante a aquisição.
    3. Sinais de filtro temporalcom um filtro de passe baixo digital (por exemplo, 5ª ordem Butterworth) com uma frequência de corte entre 100 e 75 Hz para eliminar o conteúdo de sinal insignificante45.
      Nota: Veja a Figura 5C para um exemplo de traços processados representativos.
    4. Aplique a remoção e a subtração da deriva, através do encaixe polinomial da Nth-ordem, para minimizar os efeitos do photobleaching, do movimento, ou de outras fontes significativas de variação.
    5. Após o processamento e normalização de dados ópticos em um vídeo inteiro, calcule o potencial de ação e os parâmetros transitórios de cálcio de interesse. Determinar o tempo de ativação, definido como o tempo de derivado máximo durante a despolarização, e pico de fluorescência, a fim de calcular tempos percentuais de repolarização e períodos (duração potencial de ação [APD] e [Ca2+]i duração [CaD], ver Figura 5).
    6. Depois que os parâmetros temporais são calculados, gere mapas isocronais para descrever aspectos de um único potencial de ação ou transitório de cálcio em toda a superfície epicardial imagemda usando algoritmos personalizados23,33, 43,45,46.
      Nota: Veja a Figura 5D por exemplo.

Resultados

A figura 1A mostra um diagrama do sistema isolado da perfusão cardíaca, que inclui o circuito da tubulação, a bomba, o filtro, o oxygenator, os reservatórios e os elementos de aquecimento. A colocação do ECG (configuração de chumbo II) e eletrodos de ritmo é mostrada na Figura 1B,e a configuração de imagem é retratada na Figura 1C. Um esquema dos componentes ópticos e caminhos de luz são mostrados na Figura 1D.

Estudos experimentais foram realizados em intactos, corações inteiros isolados de porcos juvenis de Yorkshire (14 a 42 dias, n = 18) que variaram em tamanho de 2,5 a 10,5 kg de peso corporal e 18 a 137 g de peso cardíaco (Figura 2A). Depois de transferir o coração isolado para um sistema Langendorff (37 °C), a frequência cardíaca estabilizou para 70 ± 4,5 bpm (média ± SEM) dentro de ~ 10 min de desfibrilação e permaneceu constante durante toda a duração do estudo (Figura 2B). Foi medida uma taxa média de fluxo de 184 ± 17 mL/min (média ± SEM), que diminuiu para 70 ± 7,5 mL/min após perfusão com mídia aquecida contendo um desacoplador mecânico (Figura 2C).

Os ECGs de chumbo II foram registrados ao longo da duração do estudo durante o ritmo do sinusite(Figura 3A)ou em resposta ao ritmo externo(Figura 3B-E)para quantificar parâmetros eletrofisiológicos. Para avaliação do EP, o ritmo dinâmico (S1-S1) foi aplicado ao átrio direito para identificar o WBCL e o SNRT (tempo de recuperação após o início do S1-S1, Figura 3C),onde o WBCL foi denotado como o PCL mais curto que iniciou a julgamento à condução ventricular. Um protocolo de estimulação S1-S2 foi implementado usando um eletrodo de estímulo bipolar no ventrículo esquerdo, a fim de identificar o menor intervalo de acoplamento que iniciou a despolarização ventricular, identificando assim o VERP (Figura 3D). Alternativamente, um protocolo de ritmo atrial S1-S2 é aplicado para identificar AVNERP (S1-S2), como mostrado na Figura 3E. Exemplos representativos de parâmetros de eletrofisiologia do coração de porco se alinham estreitamente com os37publicados anteriormente.

Experimentos de mapeamento óptico foram realizados durante o ritmo do sinusite, fibrilação ventricular espontânea (Figura 4),ou durante o ritmo dinâmico (S1-S1) do ventrículo esquerdo (LV) para gerar curvas elétricas e de restituição de cálcio descritas em Figura 5. Imagens representativas de um coração de leitão carregado de corante são mostradas na Figura 4 com potenciais de ação óptica correspondentes (Vm) e transientes de cálcio (Ca) coletados de duas regiões de interesse na superfície epicardial (ventrículo direito [RV] = azul, LV = vermelho) . Sinais não processados são exibidos durante o ritmo do sinuoso e durante a fibrilação ventricular. Como mencionado anteriormente, o ritmo dinâmico de epicardial (S1-S1) também foi usado durante experimentos de mapeamento óptico para normalizar qualquer pequena diferença na frequência cardíaca intrínseca (Figura 5A-E). Sinais brutos são exibidos (RV = azul, LV = vermelho), que foram usados para descrever o potencial de ação - tempo de acoplamento transitório de cálcio (Figura 5C),ativação e tempo de duração(Figura 5D),restituição elétrica e cálcio (Figura 5E). Para preparações de miocárdio espessa, filtragem espacial com tamanho de kernel ~ 3 mm x 3 mm é apropriado para potencial de ação epicardial ou análise transitória de cálcio19,47. Assim, imagens de alta resolução espacial (na configuração descrita 1240 x 1024 total, ou 620 x 512 por canal, 6,5 μm tamanho pixel) são muitas vezes espacialmente binned durante ou pós-aquisição (Figura 5C). O processamento de imagem pode ser realizado para gerar mapas de ativação e repolarização usando algoritmos personalizados23,33,43,45 ( Figura3D),com o tempo de ativação de cada pixel no coração foi definido como o derivado máximo do potencial de ação ou do upstroke transitório de cálcio.

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Figura 1: Configuração experimental. (A)Diagrama do sistema isolado de perfusão cardíaca; setas denotam a direção do fluxo. (B) Um coração cannulado é mostrado com colocação de eletrodos. RA = atria direita, RV = ventrículo direito, LV = ventrículo esquerdo, ECG = eletrocardiograma de chumbo II. (C)A plataforma de imagem nas proximidades do tecido cardíaco. (D)A emissão de cada sonda complementar (tensão, cálcio) é separada por comprimento de onda usando um dispositivo de divisão de imagem com filtros de emissão apropriados e espelho dicroico. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

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Figura 2: Peso cardíaco, taxa e medidas de fluxo. (A)Peso cardíaco em relação ao peso corporal para cada leitão utilizado no estudo (n = 18). (B) Frequência cardíaca medida ~10 min após desfibrilação e novamente no final do estudo (aproximadamente 1 h). (C) O fluxo coronariano cai vertiginosamente após a perfusão com um desacoplar mecânico (+BDM) devido à redução da demanda de oxigênio. Barras de escala representam média ± SEM. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

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Figura 3: Exemplos representativos de gravações de eletrocardiograma de chumbo II coletadas durante o ritmo do sinusite ou em resposta ao ritmo externo. (A)Ritmo sinusa normal. (B) Exemplo de epicardial andando na duração do ciclo de 400 ms (S1-S1), que foi usado para experimentos de imagem. (C)Top: Atrial ritmo para identificar WBCL; captura bem sucedida é observada em S1 = 250 ms em que atrial para condução ventricular é observada. Note-se que o ritmo atrial pode ser usado para determinar SNRT (tempo para sinus node descarga, depois de iniciar o ritmo externo). Inferior: Como a duração do ciclo S1 é reduzida para 205 ms, a condução para o ventrículo falha. (D)Top: Epicardial andando (S1-S2) para identificar VERP; Captura bem sucedida é observada em S1 = 450 ms, S2 = 300 ms. Bottom: Como o comprimento do ciclo S2 é reduzido para 250 ms, o tecido ventricular não consegue capturar. (E)Atrial pacing (S1-S2) para identificar AVNERP. Top: Captura bem sucedida é observada em S1 = 450 ms, S2 = 200 ms. Bottom: Como a duração do ciclo S2 é reduzida para 199 ms, a condução para o ventrículo falha. As setas azuis denotam picos de ritmo, setas vermelhas denotam captura ('C') ou nenhuma captura ('NC'). S1-S1 = ritmo dinâmico, S1-S2 = ritmo extraestímulo. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

figure-results-4
Figura 4: Dados ópticos durante o ritmo do sinuoso e fibrilação ventricular. Esquerda: Imagens representativas de um coração de porco carregado de corantes (Vm = tensão, RH237; Ca = cálcio, Rhod2), vista anterior. Tensão transmembrana filtrada espacialmente filtrada e sinais fluorescentes intracelulares de cálcio de um coração de porco durante o ritmo do sinuoso (Centro). Sinais de tensão e cálcio durante a fibrilação ventricular (Direita). Tamanhos da região do sinal (15 x 15 pixels = 2.4 x 2.4 mm2,30 x 30 = 4.8 x 4.8 mm2 tamanho do kernel) representados como quadrados vermelhos e azuis. Unidades = ΔF/F. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-5
Figura 5: Dados ópticos dos corações de porco sinuosos de Langendorff. Tensão transmembrana não processada, filtrada espacialmente(A)e(B)sinais intracelulares de fluorescência de cálcio da direita e da esquerda ventrículos durante o ritmo elétrico no ápice. Sinais não filtrados e espacialmente mediados retratam potenciais de ação óptica e transientes de cálcio de regiões de interesse (as unidades de sinal são ΔF/F). (C) Uma sobreposição de transientes normalizados ilustra o tempo de acoplamento transitório potencial-cálcio de ação (passe baixo filtrado a 75 Hz). (D)Processamento de sinais em toda a superfície epicardial para gerar mapas isocronais de parâmetros temporais, incluindo o tempo de ativação (tato)e 80% de tempo de repolarização. (E) Curvas de restituição transitória elétrica e cálcio geradas em múltiplas frequências (esquerda) com análise estatística (direita) para ilustrar tempo de repolarização mais longo em comprimentos mais lentos do ciclo de ritmo. Barras de escala = média ± SEM. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

QuímicaFórmulaPeso molecularg/L G/L
Cloreto de sódioNacl58.445.26
Gluconato de sódioC 6 H 11 Nao 7 C6H11Nao7 218.145.02
Trihydrate do acetato de sódioC2H3NaO2•3H2O136.083.68
Cloreto de potássioKcl74.550.63
Cloreto de magnésio (anidro)MgCl 2 MgCl2 95.210.1405
8,4% Bicarbonato de sódioNaHCO 3 NahCO3 84.0113
ManitolC6H14O6 182.1716.3
Sulfato de magnésioMgSO 4 MgSO4 120.374
Ph7.4
Osmolaridade (mOsmol/L)294

Tabela 1: Receita de cardioplegia de l Nido modificada.

Discussão

Embora os modelos de pesquisa cardiovascular variem das preparações celulares a in vivo, há um trade-off inerente entre relevância clínica e utilidade experimental. Neste espectro, o coração isolado Langendorff-perfundido continua a ser um compromisso útil para estudar a fisiologia cardíaca48. Todo o modelo cardíaco representa um nível mais elevado de integração funcional e estrutural do que monocamadas unicelulares ou de tecido, mas também evita as complexidades de confusão associadas aos modelos in vivo. Uma grande vantagem durante os experimentos de mapeamento óptico duplo é que a superfície epicardial do coração isolado pode ser observada, e imagens de fluorescência do potencial da transmembrana e manuseio de cálcio podem ser usadas para monitorar a fisiologia cardíaca34.

Os modelos de roedores são mais comumente usados para preparações cardíacas isoladas em oposição a animais maiores, em parte devido ao custo associado de up-sizing todos os elementos envolvidos (por exemplo, volume de solução, circuito de perfusão, quantidade de corantes e não acopladores mecânicos) juntamente com maior instabilidade e propensão para arritmias em animais maiores10,36,49. Uma vantagem para o uso de corações de porco é que eles se assemelham ao coração humano em estrutura, tamanho e taxa de contração, portanto, mais precisamente modelagem parâmetros hemodinâmicos como o fluxo sanguíneo coronariano e saída cardíaca. Da mesma forma, humanos e suínos têm manuseio de cálcio semelhante, intervalos de eletrocardiograma37,e morfologia potencial de ação, incluindo os canais subjacentes que representa12,50,51, 52. Este protocolo descreve em detalhes as etapas para a criação de um modelo animal grande reproduzível para caracterizar de forma abrangente a função do miocárdio. Imagens simultâneas de tensão transmembrana (RH237) e cálcio intracelular (Rhod2), utilizadas em conjunto com protocolos eletrofisiológicos estabelecidos, proporcionam a oportunidade de identificar mecanismos responsáveis por alterações cardíacas Função. A metodologia descrita pode ser usada para testes de segurança pré-clínicos, rastreamento toxicológico e investigação de patologias genéticas ou outras doenças. Além disso, a metodologia descrita pode ser modificada e adaptada para uso com outros modelos cardíacos (por exemplo, canino, humano), dependendo do foco específico da pesquisa53,54,55.

Há algumas modificações críticas a manter-se na mente ao transição de um modelo menor do roedor a um modelo maior do porco para preparações isoladas, inteiras do coração. Durante a preparação e configuração, recomendamos adicionar albumina ao perfusato para manter a pressão oncoética e reduzir o edema (mais antiespuma, se necessário)56,57,58,59. Além disso, perfusate contendo albumina também pode ajudar em estudos metabólicos que também exigem suplementação de ácidos graxos para a mídia60,61. Ao contrário dos corações do roedor, o coração maior do porco não precisa de ser submerso em meios mornos devido a sua relação menor da superfície à volume e ao volume aumentado de meios aquecidos que fluem através das embarcações coronárias que mantêm melhor a temperatura. Como observado anteriormente, colocamos sondas de temperatura dentro do ventrículo direito e na superfície epicardial de ventrículos direito e esquerdo, observando apenas pequenas flutuações de temperatura de 1 a 2 °C em todos os três locais ao longo do estudo. Importante, tais taxas de fluxo mais rápidas podem igualmente aumentar a probabilidade das bolhas e de um embolim potencial. Para contornar este problema, recomendamos o uso de uma armadilha de bolha com tubos de perfuração grande levando direto para a cânula da aorta. Da mesma forma, achamos mais útil ter dois indivíduos trabalhando em conjunto para cannular a aorta em um coração maior (e mais pesado): uma pessoa para manter a aorta aberta com hemostats resistentes e outra para garantir a aorta para a cânula usando fita umbilical. Na metodologia descrita, verificou-se que a perfusão com cardioplegia e desfibrilação foram vitais para a recuperação cardíaca, o que é contrário às preparações cardíacas de roedores. Em nossa experiência, apenas alguns corações extridos retomaram a atividade normal orientada pelo sinuoso sem cardioversão.

Para melhorar os pontos finais de imagem óptica, uma preparação cardíaca suspensa limitou o efeito do brilho que pode ocorrer com um coração submerso. Além disso, o coração pendurado também evita qualquer compressão ou comprometimento dos vasos coronarianos no aspecto posterior do coração que pode ocorrer ao colocar o coração para baixo horizontalmente para imagens verticais. Também descobrimos que carregar corantes fluorescentes após a armadilha da bolha (perto da cânula da aorta) melhorou muito a coloração de tecido e os sinais ópticos. Finalmente, para melhorar os desfechos da eletrofisiologia cardíaca, o uso de um eletrodo de estimulação coaxial maior facilitou o ritmo atrial bem sucedido. Embora descrevamos o uso de eletrocardiogramas para identificar a captura e a perda de captura para vários parâmetros de EP, cateteres intracardíacos ou eletrodos de gravação bipolar também podem ser usados.

Nosso estudo foi focado no desenvolvimento de uma metodologia para mapeamento óptico duplo e avaliação eletrofisiológica cardíaca em um modelo cardíaco suíno isolado e intacto. Devido a semelhanças com o coração humano juvenil, o coração suíno continua a ser um modelo popular para estudos focados em cardiologia pediátrica ou defeitos cardíacos congênitos. É importante ressaltar que a abordagem descrita pode ser adaptada para uso com corações adultos de maior porte e/ou diferentes espécies de interesse. De fato, outros laboratórios podem achar que o uso de corações caninos ou humanos (doador ou doente) são mais aplicáveis para seu foco de pesquisa específico53,54,55. Outra limitação potencial para este estudo é o uso de um desacoplador mecânico para reduzir o artefato de movimento durante a imagem. Blebbistatin tornou-se o desacoplador de escolha em aplicações de imagem cardíaca devido aos seus efeitos mínimos sobre os parâmetros de ECG, ativação e refratários períodos41,62,63. BDM é uma escolha menos cara, que pode ser particularmente importante em grandes estudos com animais que exigem maiores volumes de desacoplado perfusato e mecânico, mas é conhecido por ter um maior impacto sobre as correntes de potássio e cálcio que podem alterar o potencial de ação morfologia64,65,66,67. Se bdm é usado, note que apd encurtamento aumenta a vulnerabilidade corações para choque induzida arrythmias68. Por outro lado, a principal limitação ao uso de blebbistatin é sua fotossensibilidade e fototoxicidade, embora formulações alternativas que reduziram esses efeitos69,70,71. Finalmente, a metodologia descrita utiliza um único sistema de câmera para dupla experimentação de mapeamento óptico, mas é importante notar que estudos de pesquisa focados na fibrilação ventricular e/ou rastreamento de ondas elétricas em toda a superfície epicardial precisaria musterio essa abordagem para incluir imagens panorâmicas tridimensionais, conforme descrito por outros15,19,72,73,74,75 .

Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

Os autores reconhecem com gratidão o Dr. Matthew Kay por orientação experimental útil, e Manelle Ramadan e Muhaymin Chowdhury para assistência técnica. Este trabalho foi apoiado pelos Institutos Nacionais de Saúde (R01HL139472 para NGP, R01 HL139712 para NI), Children's Research Institute, Children's National Heart Institute e Sheikh Zayed Institute for Pediatric Surgical Innovation.

Materiais

4
Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
(-)-BlebistatinaSigma-AldrichB0560-5MGDesacoplador Mecânico
2,3-Butanodiona Monóxido (BDM)Sigma-AldrichB0753-100GDesacoplador Mecânico
AlbuminaSigma-Aldrich, St. Louis, MOA9418
Interface de sinal analógicoemka Technologiesitf16USB
AntifoamSigma-AldrichA5758-250ML
Emulsão Antiespumante Y-30Sigma-Aldrich, St. Louis, MOA5758
Cânula aórtica, 5/16"Cole-Parmer45509-60
Armadilha de bolhasSigma-AldrichCLS430641U-100EA
CaCl2Fisher Scientific, Fair Lawn, NJC77-500
Câmera, sCMOSAndor TechnologyZyla 4.2 PLUS
Eletrodo de estimulação coaxial (átrios)Harvard Apparatus73-0219
DesfibriladorEspelhoZoll M Series
Chroma TechnologyT660lpxrxt-UF2
Amplificador diferencialWarner InstrumentsDP-304A
Filtro de emissão, cálcioChroma TechnologyET585/40m
Filtro de emissão, tensãoChroma TechnologyET710lp
EP estimulador (Bloom)Fisher MedicalDTU-215B
Filtro de excitaçãoChroma TechnologyCT510/60bp
Luzes de excitaçãoThorlabsSOLIS-525C
FiltroMcMaster-Carr8147K52
Cartucho de filtro, polipropilenoPentairPD-5-934
Carcaça do filtroMcMaster-Carr9979T21
Transdutor de fluxoTransonicME6PXN
GlucoseSigma-Aldrich, St. Louis, MO158968
Bobina de aquecimentoRadnoti158821
HemofilterHemocorHPH 400
Fórceps HemostáticoWorld Precision Instruments501326
Image SplitterCairn ResearchOptoSplit II
KClSigma-Aldrich, St. Louis, MOP3911
KH2PO4Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ423-316
Tubulação de grande diâmetro, ID 3/8"Lente Fisher Scientific14-169-7H
50 mm, 0.95 f-stopDispositivos
Alinhamento de Imagem
St. Louis, MOP2256
NaClSigma-Aldrich, St. Louis, MOS-3014
NaHCO3Fisher Scientific, Fair Lawn, NJS-233
Eletrodos de agulha 29 G, 2 mmAD Instruments Inc.
Eliminador de ruídoQuest ScientificHumbug
Bomba de perfusãoPolyStanA/S 1481
Transdutor de pressãoWorld Precision InstrumentsBLPR2
Reservoir, 2 LCole-ParmerUX-34541-07
RH237AAT Bioquest Inc.21480
Rhod2-AMAAT Bioquest Inc.21062
Eletrodo de estimulação (ventrículo)Harvard Apparatus73-0160
Sutura cirúrgicaMcKesson Amplificador detransdutor de 890186
World Precision InstrumentsTBM4M
Console de fluxo de tubulaçãoTransonicTS410
Fita umbilicalJorvetJ0025UA
Banho-maria/circuladorVWR89400-970
Surgical Tools
Tesoura de ligaduraHarvard Apparatus72-8448Lister Bandage Scissors, angular, romba/romba, comprimento da lâmina de 42,0 mm, 17,0 cm
EletrocautérioDalwha Corp. Ltd.BA2ALD001Modelo: 200
RobozRS-7476Pinça de Oclusão de Tubo de São Vicente
Pinça HemostáticaHarvard Apparatus72-8960Hartmann Hemostática Pinça, Curva, Serrilhada Largura da ponta de 2,2 mm, 9,5 cm
HemostáticosHarvard Apparatus72-8985Halstead-Mosquito Pinça Hemostática Curva, Serrilhada, ponta de 2 mm
Tesoura MayoWPI50174914,5 cm, Tesoura
MetzenbaumWPI50174711,5 cm, Pinça
MosquitoHarvard Apparatus72-8980Halstead-Mosquito Hemostática Pinça Reta, Lisa, largura da ponta de 2 mm 12 cm
Suporte de agulhaHarvard Apparatus72-8828 Porta-agulhasWebster, Reto, Liso, 13,0 cm de comprimento total
Cruz pediátrica grampoRobozRS-7660Cooley-Derra Clamp 6,25" 5 mm Calibrações
Pinça de ângulo retoWPI501240Pinça Hemostática Baby Mixter, 14 cm, Bisturi de Ângulo Reto
Ted Pella549-4Cabo de bisturi nº 4, 13,7 cm Aço inoxidável e 10 Nº 22
Lâminas TesouraHarvard Apparatus72-8380Tesoura de operação, reta, romba/romba, lâmina de 42 mm,12 cm
Pinça serrilhada retaWPI500363pinça de curativo 15,5 cm
Abraçadeira para toalhaWPI501700Abraçadeira para toalha Backhaus, 13 cm, curva, alça de travamento,
afastador SS WeitlanerAfastador WPI501314Weitlaner, auto-retenção, 10,2 cm, 2x 3 pinos afiados
descartáveis
3-0 prolene suturaVários fornecedoresVários fornecedores
Alça de vasoAspen cirúrgico011001PBXSterion® Alça de vaso, 0,8 mm x 406 mm
Cardioplegia (Plegisol)Pfizer00409-7969-05Plegisol; Solução de cardioplegia cristalóide St Thomas 20 mL/kg
HeparinaVários fornecedoresVários fornecedores300 U/kg
Seringa e agulhaVários fornecedoresVários fornecedores60 mL e 18 G respectivamente
Fita umbilicalEthiconU12T
dicróico Moleculares Metamorfos Navitar DO-5095 MgSOSigma-Aldrich, St. Louis, MO M-7506 Detergente Mucasol Sigma-Aldrich Z637181-2L Na Pyruvate Sigma-Aldrich,MLA1204médico-cirúrgico Hemostato Básico de 14 cm reta reta

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