Identificação de vias hospedeiras alvo de proteínas efetoras bacterianas usando toxicidade de levedura e telas supressoras

Summary

Patógenos bacterianos secretam proteínas no hospedeiro que têm como alvo processos biológicos cruciais. Identificar as vias hospedeiras alvo de proteínas efeteroras bacterianas é fundamental para abordar a patogênese molecular. Aqui, um método usando um supressor de levedura modificado e tela de toxicidade para elucidar as vias hospedeiras alvo de proteínas efívoras tóxicas é descrito.

Abstract

Bactérias intracelulares secretam fatores de virulência chamados de proteínas efetentes no citosol hospedeiro que agem para subverter as proteínas hospedeiras e/ou suas vias biológicas associadas em benefício da bactéria. A identificação de proteínas de efetoras bacterianas putativas tornou-se mais gerenciável devido aos avanços no sequenciamento do genoma bacteriano e ao advento de algoritmos que permitem a identificação de silicos de genes que codificam candidatos de secreção e/ou eucarióticos Domínios. No entanto, a identificação desses importantes fatores de virulência é apenas um passo inicial. Naturalmente, o objetivo é determinar a função molecular das proteínas efetivas e elucidar como eles interagem com o hospedeiro. Nos últimos anos, técnicas como a tela de dois híbridos de levedura e imunoprecipitações em larga escala, juntamente com espectrometria de massa, ajudaram na identificação de interações proteína-proteína. Embora a identificação de um parceiro de ligação do hospedeiro seja o primeiro passo crucial para elucidar a função molecular de uma proteína efetora bacteriana, às vezes a proteína hospedeira tem múltiplas funções biológicas (por exemplo, actina, clathrina, tubulina) ou a proteína bacteriana não pode ligar fisicamente as proteínas hospedeiras, privando o pesquisador de informações cruciais sobre a via de hospedeiro precisa que está sendo manipulada. Uma tela modificada da toxicidade do fermento acoplada com uma tela do supressor foi adaptada para identificar os caminhos do anfitrião impactados por proteínas bacterianas do efetor. A tela da toxicidade confia em um efeito tóxico no fermento causado pela proteína do efetor que interfere com os caminhos biológicos do anfitrião, que manifesta frequentemente como um defeito do crescimento. A expressão de uma biblioteca genômica de levedura é usada para identificar fatores hospedeiros que suprimem a toxicidade da proteína efetora bacteriana e, assim, identificam proteínas na via que a proteína efetora tem como alvo. Este protocolo contém instruções detalhadas para a toxicidade e telas supressoras. Estas técnicas podem ser realizadas em qualquer laboratório capaz de clonagem molecular e cultivo de levedura e Escherichia coli.

Introduction

O primeiro relato de procedimentos semelhantes aos apresentados aqui caracterizou o efetor SidD, um deAMPylase que modifica Rab1^1. Técnicas comparáveis foram utilizadas para a caracterização de vários efetores de Pneumofilia L. ^1,2,3. O ensaio foi adaptado para caracterizar uma^proteínade efeito 4 tipo IV de Coxiella burnetii, e recentemente a utilidade desta técnica foi expandida para a caracterização das proteínas de membrana de inclusão de Clamídia trachomatis ⁵ .

Este protocolo pode ser dividido em duas partes principais: 1) a tela de toxicidade de levedura, em que a proteína efetora bacteriana de interesse é expressa em levedura e clones são rastreados para um fenótipo tóxico, como evidenciado por um defeito de crescimento, e 2) a tela supressor a levedura , em que o fenótipo tóxico é suprimido pela expressão de uma biblioteca genômica de levedura na cepa tóxica. Assim, a tela de toxicidade é uma tela para fenótipos tóxicos que se manifestam como defeitos de crescimento quando o efetor bacteriano de interesse é superexpresso. Clones tóxicos, transformados com sucesso e expressando o efetor bacteriano, são selecionados e guardados para o próximo passo. O segundo grande passo envolve a superexpressão de uma biblioteca genômica de levedura parcialmente digerida no clone tóxico de levedura. Plasmids que compõem a biblioteca genômica de levedura sugerida para o uso neste protocolo carregam inserções de 5 a 20 kb, geralmente correspondentes a quadros de leitura abertos de levedura de 3 a 13 (ORF) de um tamanho genético médio de ~1,5 kb em todos os plasmídeos, representando todo o genoma do fermento coberto aproximadamente 10x. Esta parte do ensaio é chamada a tela do supressor, porque o objetivo é suprimir a toxicidade da proteína bacteriana do efetor. Os plasmídeos potenciais do supressor são isolados do fermento, sequenciados, e dos ORFs de supressão identificados. A lógica subjacente à tela supressora é que a proteína efetora se liga, interage com, e /ou sobrecarrega componentes da via hospedeira que visa, e que fornecer essas proteínas hospedeiras de volta em excesso pode resgatar o efeito tóxico na via e, portanto, o defeito de crescimento. Assim, orfs identificados que suprimem a toxicidade muitas vezes representam vários participantes de uma via de acolhimento. Experimentos ortogonais são então realizados para verificar se o efetor bacteriano interage com a via implicada. Isto é especialmente necessário se um parceiro vinculativo, como clathrin ou actina foi identificado, porque essas proteínas estão envolvidas em uma infinidade de processos hospedeiros. Outras experiências podem então elucidar a função fisiológica da proteína efetiva durante a infecção. As telas de toxicidade e supressortambém são ferramentas poderosas para decifrar a função fisiológica de proteínas efetoras bacterianas que não ligam fisicamente proteínas hospedeiras com afinidades suficientes para detectar por imunoprecipitação ou que interagem com o host em interações enzimáticas hit-and-run que não podem ser detectadas por uma tela híbrida de levedura dois.

Embora a tela supressora possa ser um método poderoso para revelar potenciais interações fisiológicas entre proteínas efetoras bacterianas e vias hospedeiras, a proteína efetora bacteriana deve induzir um defeito de crescimento na levedura, caso contrário, usá-lo no tela supressor será de pouca utilidade. Além disso, o fenótipo tóxico deve resultar em pelo menos um déficit de crescimento de 2 a 3 log₁₀ ou será difícil identificar supressores. Se um laboratório é criado para a cultura celular, proteínas efecionistas de triagem para toxicidade em linhas celulares comuns, como HeLa, muitas vezes pode dar uma visão sobre se vale a pena o esforço para prosseguir com a tela de toxicidade de levedura. Expressão ectópica da proteína efetora nas células HeLa, por vezes, resulta em toxicidade que se correlaciona muito fortemente com a toxicidade na cepa de levedura usada para estas telas⁴. Características observáveis de estresse nas células HeLa incluem perda de fibras de estresse, desprendimento celular da placa e condensação nuclear indicando apoptose. Qualquer indicação visual de estresse nas células HeLa tornar a proteína de interesse um bom candidato para induzir um defeito de crescimento na levedura, que se replicam muito mais rapidamente e são, portanto, mais sensíveis à perturbação de vias essenciais.

Note-se que a tela supressora nem sempre identifica parceiros de ligação do hospedeiro como supressores, mas ainda pode implicar componentes críticos da via de hospedeiro (s) direcionada, produzindo uma visão holística dos processos biológicos que estão sendo sequestrados proteína efetora bacteriana. Na superfície, isso parece contraintuitivo, porque fornecer o parceiro de ligação da proteína efetiva em excesso seria esperado para resgatar o defeito de crescimento. Nos esforços para identificar caminhos visados pela proteína c. trachomatis efetivo CT229 (CpoS), que se liga a pelo menos 10 diferentes Rab GTPases durante a infecção⁵, nenhum dos parceiros de ligação Rab suprimiu a toxicidade do CT229. No entanto, foram identificados numerosos supressores envolvidos no tráfico de vesículas revestidas de clathrin (CCV), o que levou a um trabalho adicional demonstrando que o CT229 subverte especificamente o tráfico de CCV dependente da Rab. Da mesma forma, ao investigar a proteína efetora C. burnetii Cbu0041 (CirA) vários Rho GTPases que resgataram o defeito de crescimento da levedura foram identificados, e mais tarde descobriu-se que a CirA funciona como uma proteína ativadora de GTPase (GAP) para RhoA⁴.

A utilidade da tela supressora de levedura para elucidar as vias hospedeiras alvo de proteínas efívoras não pode ser exagerada, e outros pesquisadores que tentam caracterizar proteínas efívoras intracelulares podem se beneficiar muito estas técnicas. Estes ensaios são de valor se as imunoprecipitações e/ou telas híbridas de levedura dois não conseguiram encontrar um parceiro vinculativo e podem elucidar quais as vias que são alvo da proteína efetora bacteriana. Aqui, protocolos detalhados para a toxicidade e telas supressoras para identificar as vias biológicas do hospedeiro alvo de proteínas efetoras bacterianas intracelulares são fornecidos, bem como alguns dos obstáculos comuns experimentados ao usar esses ensaios e seus soluções correspondentes.

Protocol

1. Preparação de mídia e reagentes

NOTA: As placas devem ser preparadas antes do dia do ensaio e são boas para 1 mês. Os meios e os reagents podem ser feitos em qualquer ponto e são bons por 1 mês.

1. Prepare 1 L da solução de glicose (10% w/v) dissolvendo 100 g de D-(+)-glicose em 800 mL de água destilada em um copo de 1.000 mL. Ajuste o volume para 1 L com água destilada. Filtre através de um filtro estéril de 0,2 μm em uma garrafa de armazenamento de mídia estéril 1 L.
2. Prepare 1 L da solução de galactose (10% w/v) dissolvendo 100 g de D-(+)- galactose em 800 mL de água destilada em um copo de 1 L. Ajuste o volume para 1 mL usando água destilada e filtre através de um filtro estéril de 0,2 μm em uma garrafa de armazenamento de mídia estéril de 1.000 mL.
3. Prepare 1 L de extrato de levedura peptone dextrose (YPD) ágar dissolvendo 10 g de extrato de levedura, 20 g de peptone, 20 g de glicose e 20 g de ágar em 1.000 mL de água destilada. Autoclave por 20 min e arrefecer em 56 °C banho de água até esfriar. Despeje em placas de 100 mm usando ~ 20 mL de mídia por prato.
4. Prepare 1 L de caldo de YPD dissolvendo 10 g de extrato de levedura, 20 g de peptone e 20 g de glicose em 1.000 mL de água destilada. Autoclave por 20 min.
5. Prepare o recil sintético (SD) uracil (Ura^-) agar de glicose. Para 1 L, dissolva 6,7 g de base de nitrogênio levedura sem aminoácidos, 1,9 g de suplemento de abandono sem uracil e 15 g de ágar em 800 mL de água destilada. Autoclave por 20 min e arrefecer em um banho de água de 56 °C até que a temperatura é ~ 50-60 °C. Usando uma pipeta sorológica de 50 mL ou um cilindro graduado estéril, adicione 200 mL da solução da glicose preparada na etapa 1.1. Misture bem rodando suavemente ou coloque no prato de agitação. Despeje em placas de 100 mm usando ~ 20 mL de mídia por prato.
6. Prepare o retocil sintético (SD) uracil (Ura^-) ágar de galactose. Para 1 L, dissolva 6,7 g de base de nitrogênio levedura sem aminoácidos, 1,9 g de suplemento de abandono sem uracil e 15 g de ágar em 800 mL de água destilada. Autoclave por 20 min e arrefecer em um banho de água de 56 °C até que a temperatura é ~ 50-60 °C. Usando uma pipeta sorológica de 50 mL ou um cilindro estéril graduado, adicione 200 mL da solução de galactose preparada na etapa 1.2. Misture bem rodando suavemente ou coloque no prato agitar. Despeje em placas de 100 mm usando ~ 20 mL de mídia por prato.
7. Prepare o dcaldo de glicose de abandono sintético (SD) (Ura^-). Para 1 L, dissolva 6,7 g de base de nitrogênio levedura sem aminoácidos e 1,9 g de suplemento de abandono sem uracil em 800 mL de água destilada. Autoclave por 20 min e arrefecer em um banho de água de 56 °C até que a temperatura é ~ 50-60 °C. Usando uma pipeta sorológica de 50 mL ou um cilindro estéril graduado, adicione 200 ml da solução de glicose preparada na etapa 1.1.
8. Prepare o retocil sintético (SD) uracil (Ura^-) leucina (Leu^-) gara de glicose. Para 1 L, dissolva 6,7 g da base de nitrogênio levedura sem aminoácidos; 1,9 g de suplemento de abandono sem uracil, leucina e triptofano; 15 g de ágar; e 0,076 g de triptofano em 800 mL de água destilada. Autoclave por 20 min e arrefecer em um banho de água de 56 °C até que a temperatura é ~ 50-60 °C. Usando uma pipeta sorológica de 50 mL ou um cilindro graduado estéril, adicione 200 mL da solução da glicose preparada na etapa 1.1. Despeje em placas de 100 mm usando ~ 20 mL de mídia por prato.
9. Prepare abandono sintético (SD) uracil (Ura^-) leucina (Leu^-) ágar galactose. Para 1 L, dissolva 6,7 g de base de nitrogênio levedura sem aminoácidos; 1,9 g de suplemento de abandono sem uracil, leucina e triptofano; 15 g de ágar; e 0,076 g de triptofano em 800 mL de água destilada. Autoclave por 20 min e arrefecer em um banho de água de 56 °C até que a temperatura é ~ 50-60 °C. Usando uma pipeta sorológica de 50 mL ou um cilindro estéril graduado, adicione 200 mL da solução de galactose preparada na etapa 1.2. Misture bem rodando suavemente ou colocando em uma placa de agitação. Despeje em placas de 100 mm usando ~ 20 mL de mídia por prato.
10. Prepare abandono sintético (SD) uracil (Ura^-) leucina (Leu^-) caldo de glicose. Para 1 L, dissolva 6,7 g de base de nitrogênio levedura sem aminoácidos; 1,9 g de suplemento de abandono sem uracil, leucina, triptofano; e 0,076 g de triptofano em 800 mL de água destilada. Autoclave por 20 min e arrefecer em um banho de água de 56-60 °C até que a temperatura é ~ 50 °C. Usando uma pipeta sorológica de 50 mL ou um cilindro graduado estéril, adicione 200 mL da solução da glicose preparada na etapa 1.1.
11. Prepare a solução de polietilenoglicol (PEG). Adicione 50% w/v de polietileno glicol 3350 em água destilada. Esterilizar por autoclismo.
12. Prepare 1 M de acetato de lítio (LiAc) dissolvendo 10,2 g de destilação de acetato de lítio em 200 mL de água destilada. Esterilizar por autoclismo.
13. Prepare o DNA do esperma de arenque. Diluir 10 mg/mL de arenque esperma to 2 mg/mL usando água destilada. Aqueça a 100 °C por 5 min e coloque imediatamente no gelo por 5 min.

2. Cloning o gene do interesse na toxicidade do fermento plasmid pYesNTA-Kan

NOTA: Atualmente, há uma variedade de vetores de toxicidade de levedura disponíveis comercialmente e academicamente. A tela supressora de levedura pode ser usada em conjunto com muitos desses vetores desde que o plasmídeo expressando a proteína efente de interesse usa uma seleção de abandono que não uracil e um marcador antibiótico que não Bla^R. Este trabalho utilizou um vetor pYesNTA modificado^4,5 que inclui uma fita de resistência à kanamicina para uma triagem mais fácil para potenciais supressores. O esquema de clonagem deve permitir que a proteína efetora seja in-frame com o promotor Gal e His-Tag. A chlamydia trachomatis inclusão membrana proteína CT229 foi usado como uma prova de princípio para estes ensaios.

1. Use o PCR para amplificar o CT229 do DNA genômico C. trachomatis seguindo as instruções do fabricante usando cartilha CT229 +1 Kpn F (CCGGTACCAATGAGCTGTTCTAATTTAATTTCAGGT) e CT229 XhoI R (CCCTCGAGTTTTTTTTTTTTCGGGGGATGCC) primers. Use as seguintes condições de PCR: (1) 98 °C para 30 s; (2) 98 °C para 10 s, 55 °C para 30 s, 72 °C por 2 min; (3) repetir o passo 2 para um total de 25x; (4) 72 °C por 10 min; e (5) 4 °C de porão.
2. Analise 5 μL do produto PCR em um gel agarose de 1% (Figura 1).
3. Purifique os 45 μL restantes do ADN usando um jogo da purificação do PCR que segue as instruções do fabricante.
4. Dime os 50 μLs de inserção de PCR purificada e pYesNTA-Kan (Figura 2) para 1 h a 37 °C em um banho de água usando KpnI-HF e XhoI-HF.
   NOTA: Para pYesNTA-Kan, digere 5 μg de plasmídeo usando 5 μL de KpnI-HF, 5 μl de XhoI-HF e 6 μL de buffer em um volume total de 60 μL. Para a inserção, digere os 50 μL inteiros do produto purificado do PCR usando 2 μL de KpnI-HF, 2 μL de XhoI-HF, e 6 μL do amortecedor.
5. Executar todo o plasmídeo digerir em um gel agarose 1%. Realize a purificação do plasmídeo digerido usando um kit de extração de gel seguindo as instruções do fabricante.
6. Purifique a inserção de PCR digerido usando um kit de purificação PCR seguindo as instruções do fabricante.
7. Clonar a inserção em pYesNTA-Kan usando 2 μL de pYesNTA-Kan (passo 2.5), 2 μL de dna ligase buffer, 1 μL de t4 ligase, e 15 μL de inserção (passo 2.6). Incubar à temperatura ambiente por 1 h.
8. Adicione toda a reação de clonagem a 50 μL de células competentes de E. coli e realize a reação de transformação.
9. Placa toda a reação de transformação em uma placa LB contendo 100 μg/mL de carbenicilina.
10. Inocular 10 mL do LB contendo 100 μg/mL de carbenicilina com três colônias individuais. Incubar durante a noite em 37 °C com agitação em 150 rpm.
11. Isolar o plasmídeo usando um kit de minipreparação plasmid seguindo as instruções do fabricante.
12. Sequenciar os plasmídeos isolados usando primers específicos do gene (passo 2.1).

3. Teste a proteína de interesse para a toxicidade em levedura

1. Streak Saccharomyces cerevisiae W303 em YPD ágar (passo 1.3) para obter colônias isoladas. Incubar a 30 °C para 24 h.
2. Inocule 10 mL de caldo de YPD (passo 1.4) com uma única colônia da placa ágar (passo 3.1). Incubar a 30 °C com agitação em 150 rpm durante a noite.
3. Adicione 0,5 mL da cultura durante a noite para 10 mL de caldo de YPD (passo 1.4) e incubar a 30 °C com agitação em 150 rpm para 4 h.
   1. Pelotas os 10 mL de cultura a 3.000 x g por 10 min a 4 °C.
   2. Resuspenda a pelota em 1 mL de água estéril, transfira para o tubo de microcentrífuga e pelota a 3.000 x g por 1 min à temperatura ambiente.
   3. Resuspenda a pelota em 1 mL de 1 mm de acetato de lítio (LiAc) e pelota a 3.000 x g por 1 min à temperatura ambiente.
   4. Repita a lavagem LiAc 2x.
   5. Retire a lavagem. Resuspenda a pelota em 2,4 mL de 50% PEG 3350. Adicione 360 μL de 1M LiAc, 500 μL de 2 mg/mL de DNA de esperma de arenque e 400 μL de água estéril.
      NOTA: Isso é suficiente para 20 transformações.
   6. Adicione 180 μL da mistura de transformação do passo 3.3.5 para um tubo de microcentrífuga contendo 5 μL de pYesNTA-Kan CT229 plasmid DNA (100-500 ng) do passo 2.12.
   7. Incubar em um banho de água a 30 °C por 30 min.
   8. Incubar em um banho de água em 42 °C por 30 min.
   9. Pelota a 3.000 x g para 1 min à temperatura ambiente.
   10. Retire a mistura de transformação com a pipeta. Resuspenda a pelota em 100 μL de água estéril. Placa a transformação em SD Ura^- ágar com glicose (passo 1.5).
   11. Incubar placas a 30 °C para 48 h.
4. Inocular 5 mL de SD Ura^- caldo contendo glicose (passo 1.7) com uma única colônia da placa. Incubar durante a noite a 30 °C com agitação em 150 rpm. Inclua levedura transformada apenas com o vetor como um controle negativo.
   1. Adicione 180 μL de água estéril a 5 poços de uma placa de 96 poços (A2-A6).
   2. Vortex a cultura durante a noite para misturar.
   3. Adicione 180 μL de levedura ao primeiro poço (A1). Dilui-se em série 1:10 (seis amostras no total, incluindo não diluídas).
   4. Usando uma pipeta multicanal, local 5 μL de cada diluição em SD Ura^- glicose (passo 1,5) e Ura^- placas de ágar do passo 1,6. Incubar a 30 °C para 48 h.
5. Avalie a toxicidade comparando o crescimento do fermento expressando a proteína efetiva de interesse cultivada na mídia contendo galactose com o crescimento da levedura expressando o vetor sozinho.
6. Confirme a expressão da proteína de fusão His-tag por borrão ocidental.

4. Transforme levedura tóxica com a biblioteca genômica de levedura

1. Inocular 100 mL de SD Ura^- caldo de glicose (passo 1,7) usando 1 mL do estoque a partir do passo 3.4. Incubar por 16-24 h a 30 °C com agitação em 150 rpm. Coloque 900 mL de SD Ura^- caldo de glicose a 30 °C durante a noite para prewarm a mídia.
2. Adicione os 100 mL inteiros da cultura durante a noite ao frasco prewarmed de 1 L. Incubar por 4-5 h a 30 °C com agitação em 150 rpm.
   1. Pelotas a cultura em 6.000 x g para 10 min em 4 °C.
   2. Descarte o supernatant. Resuspenda a pelota em 250 mL de água estéril. Pelotas a cultura em 6.000 x g para 5 min em 4 °C.
   3. Descarte o supernatant. Resuspenda a pelota em 250 mL de 1 mM LiAc. Pelotas a cultura em 6.000 x g para 5 min em 4 °C.
   4. Retire o LiAc e resuspenda a pelota em 9,6 mL de 50% PEG 3350. Adicione 1,44 mL de 1M LiAc, 2 mL de 2 mg/mL de dna de esperma de arenque, 50 μg da biblioteca genômica pYep13 (ATCC 37323). Ajuste o volume para 15 mL com água estéril. Misture suavemente por inversão.
   5. Incubar em um banho de água a 30 °C por 30 min.
   6. Adicione 750 μL de dimetil sulfoxida (DMSO) para aumentar a eficiência da transformação. Incubar em um banho de água a 42 °C por 30 min. Misture por inversão suave a cada 10 min.
   7. Pelota o fermento em 3.000 x g para 5 min à temperatura ambiente.
   8. Descarte o supernatant e resuspenda a pelota em 10 mL de água estéril. Pelota a 3.000 x g por 5 min à temperatura ambiente.
   9. Resuspenda a pelota em 8 mL de água estéril.
   10. Para determinar a eficiência da transformação, diluir 1:10 e placa 100 μL de cada diluição em SD Ura^- Leu^- gara de glicose (passo 1,8).
   11. Placa 200 μL da amostra em Placas sd Ura^- Leu^- galactose agar (passo 1.9). Use 50 placas no total.
   12. Incubar a 30 °C para 48-96 h ou até que as colônias aparecem.
       NOTA: Colônias geralmente aparecem em placas de ágar de glicose em 48-72 h e placas de ágar de galactose em 72-96 h.
3. Colônias de remendos (resgates potenciais) em SD Ura^- Leu^- ágar de galactose (passo 1.9) para expandir e fazer estoque. Incubar a 30 °C para 24-48h.
4. Inocular 5 mL de SD Ura^- Leu^- caldo de glicose (passo 1.10) usando a parte do patch. Incubar durante a noite a 26 °C com agitação em 150 rpm.
   1. Adicione 180 μL da água estéril a 5 poços de uma placa de 96 poços (A2-A6).
   2. Vortex a cultura durante a noite para misturar.
   3. Adicione 180 μL de levedura ao primeiro poço (A1). Dilui-se em série 1:10 (seis amostras no total, incluindo não diluídas).
   4. Usando uma pipeta multicanal, local 5 μL de cada diluição em SD Ura^- glicose e SD Ura^- placas de ágar de galactose. Inclua o efetor tóxico sozinho como um controle.
   5. Incubar a 30 °C para 48 h.
5. Compare o crescimento do fermento expressando o efetor tóxico sozinho ao fermento que contem os supressores potenciais. Apenas proceder com potenciais supressores que diminuíram a toxicidade em comparação com o fermento expressando o efetor sozinho.

5. Identificar e confirmar supressores

1. Inocular 5 mL de SD Ura^- Leu^- caldo de glicose (passo 1,10) com 100 μL de levedura a partir do passo 4.4 e incubar durante a noite em 30 °C com agitação em 150 rpm.
   1. Pelota o fermento em 3.000 x g para 2 min à temperatura ambiente. Descarte suavemente o supernatant usando uma pipeta.
   2. Isolar o plasmídeo com um kit de minipreparação plasmid levedura seguindo as instruções do fabricante.
2. Transforme o plasmid isolado nas células competentes de E. coli e repercia toda a transformação no ágar lb com 100 μg/mL de carbenicilina. Incubar a 37 °C para 24 h.
3. Inocular 10 mL de caldo LB contendo 100 μg/mL de carbenicilina, com três colônias da placa e incubada a 37 °C durante a noite com agitação em 150 rpm.
   1. Culturas de pelotas a 3.000 x g por 10 min à temperatura ambiente. Isolar plasmid usando um kit miniprep seguindo as instruções do fabricante.
4. Retransforme o fermento tóxico com os plasmídeos isolados da etapa 5.3.1 que seguem as etapas na parte 3 do protocolo.
   1. Inoculate 5 mL de SD Ura^- Leu^- caldo de glicose com uma colônia da placa de transformação. Incubar durante a noite a 30 °C com agitação em 150 rpm.
   2. Spot on Ura^- Leu^- glicose e galactose ágar para confirmar a supressão da toxicidade.
5. Sequência usando cartilha pYep13 F (ACTACGCGATCATGGCGA) e pYep13 R (TGATGCGCGCGCGATGC) primers para identificar ORFs de levedura.

Results

Antes que a tela real do supressor do fermento possa ser executada, a proteína do efeitor do interesse deve ser testada para a toxicidade no fermento. Isto é conseguido expressando a proteína do interesse no fermento o controle de um promotor galactose-indutor. O crescimento da glicose (condições não indutoras) deve primeiro ser comparado para garantir que a toxicidade seja especificamente devido à expressão da proteína de interesse e não seja um defeito geral. Como mostrado na Figura 3, a t...

Discussion

Este protocolo descreve procedimentos passo a passo para identificar vias biológicas do hospedeiro alvo de proteínas efívoras usando uma toxicidade de levedura modificada e tela supressora. A cepa de levedura utilizada, S. cerevisiae W303, é auxotrófica tanto para uracil quanto para a leucina. A auxofia uracil da cepa é usada para selecionar levedura carregando a proteína de interesse no vetor pYesNTA-Kan, enquanto a auxofia leucine é usada para selecionar para o vetor de biblioteca genômica de levedura pYep13. ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar	Fisher Scientific	BP2641500
Galactose	MilliporeSigma	G0750-1KG
Kit de extração de gel GeneJet	ThermoFisher Scientific	K0691
Kit de purificação de PCR	GeneJet ThermoFisher Scientific	K0701
Kit de minipreparação de plasmídeo GeneJet	Thermo	K0503
Glicose	MilliporeSigma	G8270-1KG
Arenque Esperma DNA	Promega	D1811
KpnI-HF	New England Biolabs	R3142S
Acetato de lítio di-hidratado	MilliporeSigma	L6883-250G
Peptona	Fisher Scientific
Phusion DNA polimerase de alta fidelidade	New England Biolabs	M0530
Poli (etilenoglicol) 3350	MilliporeSigma	1546547-1G
pYep13	ATCC	37323
T4 DNA ligase	New England Biolabs	M0202S
Triptofano	MilliporeSigma	470031-1G
XhoI-HF	New England Biolabs	R0146S
Extrato de levedura	Fisher Kit	BP1422-500
	Zymo	D2001
Base de nitrogênio de levedura sem aminoácidos	MilliporeSigma	Y0626-250G
Suplementos de meio de abandono sintético de levedura	MilliporeSigma	Y1501-20G	sem uracilo
Suplementos de meio de abandono sintético de levedura	MilliporeSigma	Y1771-20G	sem uracila, leucina, triptofano