Identificação de vias hospedeiras alvo de proteínas efetoras bacterianas usando toxicidade de levedura e telas supressoras

Summary

Patógenos bacterianos secretam proteínas no hospedeiro que têm como alvo processos biológicos cruciais. Identificar as vias hospedeiras alvo de proteínas efeteroras bacterianas é fundamental para abordar a patogênese molecular. Aqui, um método usando um supressor de levedura modificado e tela de toxicidade para elucidar as vias hospedeiras alvo de proteínas efívoras tóxicas é descrito.

Abstract

Bactérias intracelulares secretam fatores de virulência chamados de proteínas efetentes no citosol hospedeiro que agem para subverter as proteínas hospedeiras e/ou suas vias biológicas associadas em benefício da bactéria. A identificação de proteínas de efetoras bacterianas putativas tornou-se mais gerenciável devido aos avanços no sequenciamento do genoma bacteriano e ao advento de algoritmos que permitem a identificação de silicos de genes que codificam candidatos de secreção e/ou eucarióticos Domínios. No entanto, a identificação desses importantes fatores de virulência é apenas um passo inicial. Naturalmente, o objetivo é determinar a função molecular das proteínas efetivas e elucidar como eles interagem com o hospedeiro. Nos últimos anos, técnicas como a tela de dois híbridos de levedura e imunoprecipitações em larga escala, juntamente com espectrometria de massa, ajudaram na identificação de interações proteína-proteína. Embora a identificação de um parceiro de ligação do hospedeiro seja o primeiro passo crucial para elucidar a função molecular de uma proteína efetora bacteriana, às vezes a proteína hospedeira tem múltiplas funções biológicas (por exemplo, actina, clathrina, tubulina) ou a proteína bacteriana não pode ligar fisicamente as proteínas hospedeiras, privando o pesquisador de informações cruciais sobre a via de hospedeiro precisa que está sendo manipulada. Uma tela modificada da toxicidade do fermento acoplada com uma tela do supressor foi adaptada para identificar os caminhos do anfitrião impactados por proteínas bacterianas do efetor. A tela da toxicidade confia em um efeito tóxico no fermento causado pela proteína do efetor que interfere com os caminhos biológicos do anfitrião, que manifesta frequentemente como um defeito do crescimento. A expressão de uma biblioteca genômica de levedura é usada para identificar fatores hospedeiros que suprimem a toxicidade da proteína efetora bacteriana e, assim, identificam proteínas na via que a proteína efetora tem como alvo. Este protocolo contém instruções detalhadas para a toxicidade e telas supressoras. Estas técnicas podem ser realizadas em qualquer laboratório capaz de clonagem molecular e cultivo de levedura e Escherichia coli.

Introduction

O primeiro relato de procedimentos semelhantes aos apresentados aqui caracterizou o efetor SidD, um deAMPylase que modifica Rab1^1. Técnicas comparáveis foram utilizadas para a caracterização de vários efetores de Pneumofilia L. ^1,2,3. O ensaio foi adaptado para caracterizar uma^proteínade efeito 4 tipo IV de Coxiella burnetii, e recentemente a utilidade desta técnica foi expandida para a caracterização das proteínas de membrana de inclusão de Clamídia trachomatis ⁵ .

....

Protocol

1. Preparação de mídia e reagentes

NOTA: As placas devem ser preparadas antes do dia do ensaio e são boas para 1 mês. Os meios e os reagents podem ser feitos em qualquer ponto e são bons por 1 mês.

1. Prepare 1 L da solução de glicose (10% w/v) dissolvendo 100 g de D-(+)-glicose em 800 mL de água destilada em um copo de 1.000 mL. Ajuste o volume para 1 L com água destilada. Filtre através de um filtro estéril de 0,2 μm em uma garrafa de armazenamento de mídia estéril 1 L.
2. Prepare 1 L da solução de galactose (10% w/v) dissolvendo 100 g de D-(+)- galactose em 800 mL de água destilada em um copo de 1 L. Ajuste o volume para 1 ....

Results

Antes que a tela real do supressor do fermento possa ser executada, a proteína do efeitor do interesse deve ser testada para a toxicidade no fermento. Isto é conseguido expressando a proteína do interesse no fermento o controle de um promotor galactose-indutor. O crescimento da glicose (condições não indutoras) deve primeiro ser comparado para garantir que a toxicidade seja especificamente devido à expressão da proteína de interesse e não seja um defeito geral. Como mostrado na Figura 3, a t.......

Discussion

Este protocolo descreve procedimentos passo a passo para identificar vias biológicas do hospedeiro alvo de proteínas efívoras usando uma toxicidade de levedura modificada e tela supressora. A cepa de levedura utilizada, S. cerevisiae W303, é auxotrófica tanto para uracil quanto para a leucina. A auxofia uracil da cepa é usada para selecionar levedura carregando a proteína de interesse no vetor pYesNTA-Kan, enquanto a auxofia leucine é usada para selecionar para o vetor de biblioteca genômica de levedura pYep13. .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar	Fisher Scientific	BP2641500
Galactose	MilliporeSigma	G0750-1KG
Kit de extração de gel GeneJet	ThermoFisher Scientific	K0691
Kit de purificação de PCR	GeneJet ThermoFisher Scientific	K0701
Kit de minipreparação de plasmídeo GeneJet	Thermo	K0503
Glicose	MilliporeSigma	G8270-1KG
Arenque Esperma DNA	Promega	D1811
KpnI-HF	New England Biolabs	R3142S
Acetato de lítio di-hidratado	MilliporeSigma	L6883-250G
Peptona	Fisher Scientific
Phusion DNA polimerase de alta fidelidade	New England Biolabs	M0530
Poli (etilenoglicol) 3350	MilliporeSigma	1546547-1G
pYep13	ATCC	37323
T4 DNA ligase	New England Biolabs	M0202S
Triptofano	MilliporeSigma	470031-1G
XhoI-HF	New England Biolabs	R0146S
Extrato de levedura	Fisher Kit	BP1422-500
	Zymo	D2001
Base de nitrogênio de levedura sem aminoácidos	MilliporeSigma	Y0626-250G
Suplementos de meio de abandono sintético de levedura	MilliporeSigma	Y1501-20G	sem uracilo
Suplementos de meio de abandono sintético de levedura	MilliporeSigma	Y1771-20G	sem uracila, leucina, triptofano