Summary
Elektrofuktningsbaserad digital mikrofluidisk är en teknik som använder en spänningsdriven förändring i den skenbara kontaktvinkeln hos en mikrolitervolymdropp för att underlätta dess manipulering. Genom att kombinera detta med funktionella magnetiska pärlor möjliggör integrering av flera laboratorieenhetsoperationer för provberedning och identifiering av patogener med enzymanknuten immunosorbent assay (ELISA).
Abstract
Elektrofuktning är den effekt med vilken kontaktvinkeln för ett dropp som utsätts för en ytladdning ändras. Elektrowetting-on-dielectric (EWOD) utnyttjar de dielektriska egenskaperna hos tunna isolatorfilmer för att förbättra laddningstätheten och därmed öka elektrofuktningseffekten. Förekomsten av avgifter resulterar i en elektriskt inducerad spridning av droppen som tillåter målmedveten manipulation över en hydrofoba yta. Här demonstrerar vi EWOD-baserade protokoll för provbearbetning och detektion av fyra kategorier av antigener, med hjälp av en automatiserad ytaktiveringsplattform, via två varianter av metoder för enzymrelaterad immunsorbent assay (ELISA). ELISA utförs på magnetiska pärlor med immobiliserade primära antikroppar som kan väljas för att rikta ett specifikt antigen. En antikropp som konjugeras till HRP binder till antigenet och blandas med H2O2/Luminol för kvantifiering av de fångade patogenerna. Analys avslutningstider på mellan 6 och 10 min uppnåddes, medan minimala volymer av reagenser utnyttjades.
Introduction
Den föreslagna metoden syftar till att underlätta automatiserad provberedning för ELISA med kvantitativ upptäckt av antigener med hjälp av EWOD-baserad metod med digital mikrofluidik (DMF) och magnetoforesitisk separation. Det har visats för flera biologiska tillämpningar att DMF i kombination med magnetofores är ett intressant alternativ till flytande hanteringsapplikationer1. Mer specifikt är upptäckten av patogener en implicit aspekt inom många sektorer, från hälso-och sjukvård 2 till jordbruk och miljö3,4 till nationell säkerhet5. En detektionsteknik som kan ta itu med hoten från patogener måste innehålla hög genomströmning (t.ex. kort analystid), effektivitet (låg detektionsgräns – LoD – och hög känslighet) och specificitet (för målpatogentyp) för att den ska fungera6.
Tidigare har EWOD-baserade DMF genomförts framgångsrikt för Omvänd transkription Polymeraskedjereaktion (RT-PCR), upptäckt av en antibiotikaresistent patogen (Meticillinresistentstaphylococcus aureaus eller MRSA), M.pneumonia och C.albicans med en låg budget, tryckt kretskortschip och magnetofos7. Tekniken tillämpades också för detektion av deoxyribonukleinsyra (DNA) mutationer genom pyrosekvensering och chemiluminescent upptäckt8. EWOD-baserade plattformar utökar också sin funktionalitet mot immunassay applikationer, vilket möjliggör samtidig provåtervinning och detektering inom en enda, integrerad plattform. Till exempel visades en enda EWOD-chip design framgångsrikt med en DMF plattform för point-of-care testning för både bead-baserade immunoassays av hjärt troponin I från ett helblodprov och som ett separat experiment RT-PCR för MRSA upptäckt2. Det chipet använder oljefyllmedel, vilket förhindrar avdunstning av dropparna och underlättar tillförlitlig automatiserad manipulering av nanolitersvolymer. Mångsidiga biotillämpningar undersöktes med genomförandet av liknande DMF-metoder som omfattar kvantitativhomogena och heterogena immunanalyser9,10 inklusive utformning av experiment (DoE) studier för analys parameteroptimering11.
Trots sina uppenbara meriter att bearbeta intensifiering på grund av miniscule arbetsvolymer, en oljefylld DMF plattform kan vara utmanande och kräver en viss nivå av expertis för att fungera. Oljefyllda system, eftersom de kräver förseglade komponenter, är inte idealiska för vissa in-field tillämpning där systemet transportability är viktigt. Dessutom skulle ett oljebaserat system vara mycket svårt om inte omöjligt att använda för vissa specifika tillämpningar som utnyttjar torrmaterialinsamling på en yta som föreslagits av Zhao och Cho12, Jönsson-Niedziółka m.fl.13, och Foat et al.14. Däremot är oljefria system enkla att integrera och har fördelen av att ge enkel chip-to-chip provöversättning. Av dessa skäl har den föreslagna metoden utvecklats för att tillhandahålla en EWOD-baserad immunanalys på DMF som inte skulle kräva olja, vilket effektivt förenklar enhetens drift.
I detta bidrag rapporterar vi om att använda en skräddarsydd, fristående, helt automatiserad DMF-plattform för immunoassays, och vi utvecklar protokollet för snabb upptäckt av biomolekyler, nämligen proteiner, vegetativa bakterier, bakteriesporer och virus. Kombination av EWOD-chip med magnetiska partiklar för automatiserad provberedning och immunfällning har redan visats med ytterligare en off-line MS-mätning15. Nyligen har in-field diagnostik mot mässling och röda hund IgG visats i avlägsna nordvästra Kenyas befolkning av Wheeler grupp16. Både Wheelers och vårt system, som är transportbara, fristående, helt automatiserade med medföljande på chip, realtid chemiluminescent mätningar är utan tvekan bland de mest avancerade DMF biodetection system som finns tillgängliga.
De två systemen har utformats med mycket olika applikationer i åtanke. Wheelers system riktar biomarkör för att tillåta biomedicinsk diagnostik på patienter medan vårt biodetekteringssystem är uppbyggt kring försvarskrav för direkt detektering av patogen som tidigare provats från luft. Likheten mellan de två är den underliggande principen om droppaktivering, som visar det breda spektrum av life-influencing sektorer att ewod-baserad teknik kan påverka. Nämligen dmf-baserade detektionsplattformen och tillhörande EWOD-system kan finna en viktig inverkan på hälsan (biomedicinsk diagnostik); militärt och civilt skydd (hotdetektering). Agri-tech (övervakning av grödor) och arbetssäkerhet (kontrollerad miljöövervakning)
Utförandet av vår DMF plattform bedöms mot helt automatiserad upptäckt av mänskliga serum albumin (HSA, en klotformig protein), Escherichia coli (E. coli, en vegetativ atrophaeus(BG, en bakteriell spor) och MS2 (en bacteriophage virus). Ännu viktigare är den föreslagna DMF-metoden extremt mångsidig i den meningen att fånga antikroppar kan utbytas för att rikta upptäckten av andra antigener som skiljer sig från de fyra som beaktas i denna artikel. Kringgå antikroppsbaserade avkänning helt, dmf-plattformen kan bygga till en potentiell tillämpning baserad på aptamer biosensing, där de magnetiska pärlorna bär specifika aptamers för fångst och / eller upptäckt av nukleotider. Utformningen och förverkligandet av de olika komponenterna som utgör den integrerade, helt fristående DMF-plattformen, inklusive högspänningsvågformgeneratorn och drivelektroniken avslöjas någonannanstans 6.
Protocol
1. Preliminära åtgärder som är nödvändiga för analysen
OBS (VIKTIGT): Alla preliminära steg måste utföras i en steril miljö för att undvika föroreningar. Natriumazid bör inte användas för lagring eftersom det skulle hämma aktiviteten hos pepparrotperoxidas (HRP) enzym.
- Förbered löpbuffert (100 mM HEPES, pH 7,5), med hjälp av (4-(2-hydroxyethyl)piperazzine-1-etanesulfonsyra och tillsätt Interpolering 80 till en koncentration på 0,01 % (v/v).
- Immobilisera de primära antikropparna (fånga antikroppar) på ytan av nhs-aktiverade magnetiska mikropärlor genom att följa det protokoll som tillhandahålls av leverantören. Kortfattat omfattar protokollet Magnetiskip/co-IP Kit(Table of Materials)följande steg.
- Aliquot 0,2 ml pärlor (2 mg) i ett plaströr och ta bort supernatanten.
- Tvätta pärlorna genom att lägga till 1 ml iskalla 1 mM HCl.
- Bind den valda antikroppen (Anti-Human Serum Albumin [15C7], Rb anti-BG polyklonal, Rb anti-E.coli MRE 162 polyklav al-eller get anti-MS2 polyklonal), 40 μg/mL i 67 mM Borate Buffer, covalently till pärlorna för 1 h med skakning vid 37 °C. Tabell 1 innehåller en förteckning över alla antikroppar som används med det nuvarande protokollet och antigenpatogenerna6.
- Tvätta de obundna antikropparna två gånger med 0,8 ml Elution Buffer.
- Släcka reaktionen med 1 ml av quenching buffert för 1 h.
- Tvätta pärlorna en gång med modifierad boratebuffert och en gång med IP Lys/Wash Buffer.
- Återsuspendpärlorna i 0,5 ml IP Lysis/Wash Buffer och förvara vid 4 °C tills det krävs för användning.
OBS: För bästa resultat, en ny sats av mikropärlor är kopplade till antikroppardagen före EWOD-isolering och ELISA på chip. Mikropärlorna kopplade till den primära antikroppen kan dock lagras vid 4 °C upp till en månad. Om tätbebyggelse uppstår trycker du på injektionsflaskan för att bryta fällningen och att återsuspendera pärlorna i lösningen. - Blockera mikropärlorna med den kopplade antikroppen över natten, med hjälp av slutlig koncentration 4 mg/ml för mikropärlorna, i en Blocker Casein (1% w/v) i 100 mM fosfatbuffbuffrad realine (PBS).
OBS: Blockeringssteget utförs alltid dagen innan biodetection-analysen körs. - Separera pärlorna från Blocker-kasein med hjälp av en magnet och ta bort supernatanten.
- Resuspend i 1 ml löpbuffert och blanda i 1 min.
- Separera pärlorna med magneten och ta bort supernatanten.
- Upprepa ovanstående tvättsteg (1.2.10 och 1.2.11) två gånger.
OBS: Tre tvättsteg är tillräckliga för att minska vidhäftningen av pärlorna till ytan och för att underlätta fri rörlighet för droppen. - Återsuspendpärlorna i löparbufferten vid en koncentration av 2,5 mg/ml. Denna lösning av mikropärlor är klar att användas med EWOD-chippet.
- Förbered en lösning av neutravidinkonjugerade pepparrotsperoxidas (HRP) och sekundärbiotinylated antibody till en slutlig koncentration för var och en av 1 μg/ml i löparbuffert (används för BG detektion6).
OBS: För att rikta antigenerna (tabell 1)testades olika koncentrationer av sekundär biotinylated antikropp, från 0,5 till 4,0 μg/ml testades framgångsrikt. - Blanda lika volymer av Luminol med väteperoxidlösning precis innan analysen körs
OBS: Luminol används för att kvantifiera antalet bindande händelser baserat på HRP-enzymet som är bundet kovalent till den sekundära antikroppen som riktar sig mot antigenet (t.ex. patogen). Olika rapporteringsmolekyler och strategier kan dock användas för detektion17 i stället för chemiluminescence och Luminol.
2. Tillverkning och ytbehandling av EWOD-spånkomponenterna
OBS: EWOD-chippet består av en aktiveringsplatta med mönstrade kroomelektroder för att varva den skenbara kontaktvinkeln hos ett dropp och en täckplatta för att definiera höjden på droppar.
- Rita utformningen av elektroderna och kontakterna i 2D med standard CAD-programvara. Inkludera även avfallsuppsamlingsdynan med mått på 5 x 5 mm2 för att förvara de använda lösningsmedelna(figur 1).
OBS: För att manipulera dropparna använder vi 47 elektroder, var och en med mått på 1,7 x 1,7 mm2. Denna elektrodstorlek rymmer droppvolymer från 1,5 μL till 3 μL (för ett gap på 500 μm). Av erfarenhet, när man arbetar med en 500 μm gap, 1,5 μL är den minsta droppstorlek som kan aktiveras. Det motsvarar ungefär droppen (projiceras) konturen begränsas till fyrkantsplattan. Det finns dock ingen teoretisk gräns i storlek än orsakad av vätskekroppens motståndskraft (friktion). Det rekommenderas dock att volymen inte överstiger 3 μL för tillförlitlig aktivering med ett gap på 500 μm. Elektroderna behandlas av 48-kanals elektronik.
OBS: Dynornas konstruktionsdimensioner och storlekar kan variera beroende på de avsedda volymerna och laboratorieenhetens verksamhet som ingår i protokollet. - Skicka designritningen till en masktillverkningstjänst för utskrift av krommasken på ett glassubstrat. Tjockleken på kromskiktet är 100 nm.
OBS: Kromlagret på fotomasken som används som substrat för EWOD-chippet är per definition ogenomskinligt. Utformningen av var och en av våra elektroder innehåller en rutnätslayout för att säkerställa semi-öppenhet. - Skär plattan till storlek 56 x 56 mm2 med precision CNC Tärning/ skärsåg.
- Stick maskeringstejp över de elektriska kontakterna för att isolera dem under de två beläggningsstegen.
- Täck plattans kromglasplatta med ett dielektriskt skikt genom att deponera 6 μm Parylene-C på dess yta. Gorhamprocessen18 används med 7,4 g DPX-C i ett Parylene Deposition System(Table of Materials).
- Spin-coat amorft fluorpolymerer(Table of Materials)med hjälp av en spinn-coater på 1500 rpm för 30 s ovanpå plattan och grädda den på 140 °C i 30 min.
OBS: Detta gör ytan hydrofoba. Man kan validera om beläggningen har deponerats framgångsrikt genom att placera en droppe vatten på ytan. Kontaktvinkeln mellan droppen och plattan måste vara i området 110º. - Ta bort maskeringstejpen från de elektriska kontakterna.
- Spin-coat amorft fluorpolymerer(Table of Materials) med hjälp av en spin-coater på 1500 rpm för 30 s ovanpå 4-i kisel rån och baka den på 140 ° C i 30 min.
OBS: Det är viktigt att både ytorna på aktiveringen och täckplattorna är hydrofoba för att underlätta en smidig rörelse av de diskreta dropparna under analysen.
3. Lastning, montering och drift av EWOD-chippet på DMF-plattformen
OBS: EWOD-chippet fungerar med parallellplåtskonfiguration med ett exakt definierat mellanrum 0,5 mm mellan ställdonoch den ledande, jordade täckplattan. Denna sandwichmontering beskrivs i det aktuella avsnittet.
- Ta bort locket från DMF-plattformen6 och placera det på bänken.
OBS: En mörk Faraday bur kammare, är nödvändigt för att förhindra herrelösa ljus och elektromagnetiska störningar under detektionen. Det finns inget förregling på locket, därför gör plattformen det möjligt för oss att observera droppar rörelse. - Placera en ren aktiveringsplatta på det roterande stadiet, krom uppåt. Plattan måste anpassas till det övre vänstra hörnet av det infällda steget(bild 2A).
- Kläm fast aktiveringsplattan från toppen med panelen med 47 kontaktstift. Detta säkrar plattan på plats och underlättar anpassningen till kontaktstiften.
- Lägg 3 mm shim och 2 mm polymetylmetakrylat (PMMA) separator på det roterande scenen, för att ge ett kontrollerat mellanrum mellan aktiveringen och täckplattorna.
OBS: Alternativt kan transportera papper placeras på avfallsplattan innan du aliciterar dropparna före nästa steg. Som analysen fortsätter, är avfallet direkt absorberas i papperet som kan tas bort i slutet av analysen. - Ladda dropparna på de föreslagna lastkuddarna(bild 1).
- Aliquot fyra 2,5 μL droppar från körbufferten på B-, A-, R-, E-denoted kuddar, en droppe på varje pad.
- Aliquot 2,5 μl Luminol:H2O2 (1:1, v/v) lösning på d-denoted pad.
- Aliquot 2,5 μl Neutravidin konjugerat till HRP (1 μg/ml) på F-noterade pad.
- Aliquot 2,5 μl biotinylated sekundär antikropp (1 μg/ml) på g-denoted pad.
- Aliquot 2,5 μl mikropärlor med konjugerat primär antikropp (2,5 mg/ml) går in på I-denoted pad.
- Aliquot 2,5 μl av det okända provet på C-noterade dynan.
OBS: Det föreslagna lastningsmönstret är bara ett exempel på en experimentell layout, men lastningsmönstret kan ändras så länge dessa ändringar matchar den sekvens som definieras i programvaran (Tilläggsfil 1).
- Placera täckplattan på ytan av riggen, förutom den runda fördjupningsområdet, och skjut den i sidled i fördjupningen och ovanpå aktiveringsplattan(figur 2B).
- Sätt den permanenta magneten ovanpå täckplattan och säkra den genom att skjuta de två spärrarna(figur 2C).
- Rotera scenen med 180° och inspektera visuellt om de laddade dropparna fortfarande är på plats (figur 1C).
OBS: Man bör kunna ögongloben position och form av droppar genom det genomskinliga steget och baksidan av aktiveringsplattan(figur 2D). Analysen är redo att köras om runda droppar kan ses ovanpå de laddningselektrodkuddar. Om, en droppe förflyttas man kan ta bort magneten och täckplattan, sedan återvinna den fördrivna droppe med en ren pipett och placera den igen på lastplattan. - Kontrollera att laddningspositionen för varje droplet matchar den programmerade aktiveringssekvensen i programvaran (se Tilläggsfil 1 för information om programvaran).
OBS: För att visuellt kunna kontrollera placeringen av dropparna, måste fotodetektorn demonteras(bild 2D). - Placera fotodetektorn sett "kan" i facket på det roterande steget.
OBS: Fotodetekteringssystemet svänger runt en fotodiod, som har ett stort samlingsområde (10 x 10 mm2)för att maximera ljussamlingen utan ytterligare optik, plus en transimpedansförstärkare för att minimera brus6. Systemet är dock extremt känsligt och kan samla in minutsignaler. För att minska ljudnivån implementerades ett antal elektronikbaserade strategier (t.ex. fotodetekteringssystemet skyddades genom att placera det i en Faraday-bur, ett metallhölje som kallas en skärmad "burk"). - Anslut kabeln till fotodetektorn sett "can".
OBS: När EWOD-chippet är i linje med fotodetektorn är DMF-plattformen helt monterad och är nu redo att användas. - Placera locket över DMF-plattformen och starta programsekvensen med hjälp av mjukvarugränssnittet som utvecklats vid University of Hertfordshire.
OBS: Ytterligare programvara används för att läsa och registrera luminescens från droppen som en funktion av tid i en CSV-fil (se Tilläggsfil 2).- Se till att de programmerade sekvensen (se Kompletterande fil 1)snabbmeddelanden visas vid gränssnittet för att informera operatören om att "Luminol-droppen är redo att samla in de extraherade magnetiska pärlorna" eller "Detektionsdroppen är redo att flyttas till detektionsplatsen". I båda fallen måste bekräftelsen från operatören fortsätta med sekvensen.
4. Drift i visuellt läge (valfritt för optimering av protokoll)
OBS: Om så önskas, för att visualisera varje droplet-baserad drift, kan analysen användas genom att hoppa över steg 3.10-3.12 och ersätta dem med följande operationer.
- Starta programsekvensen med hjälp av programvarugränssnittet.
OBS: Dropprörelsen kan observeras när den används i visuellt läge, vilket är användbart under protokolloptimering. För det första för att kontrollera reproducerbarheten av den magnetiska separationsoperationen. Om till exempel mängden pärlor som används är för låg, kommer den magnetiska separationen inte att ske, vice versa, om mängden pärlor är för hög, kan droppen immobiliseras av beadpelleten. För det andra, för att fastställa tillförlitligheten i en ny analys som vissa droppformulering kan orsaka aktivering nedskrivningar som kan upptäckas genom observation. - Montera fotodetektorn avskärmad "burk" i slitsen på det roterande scenen, när du uppmanas.
- Anslut kabeln till fotodetektorn som visas "can", genom att sätta i stiften i uttaget.
- Placera locket över DMF-plattformen och återuppta analysen.
OBS: Använd ytterligare programvara för att läsa och registrera luminescens från droppen som en funktion av tid i en CSV-fil (se tilläggsfil 2)
5. Ta bort flytande avfall och rengöring av chipet
VARNING: Se till att utrustningen är avstängd och frånkopplad från strömkällor (dator, huvud) före rengöring. Använd handskar, ett labbrock och skyddsglas (PPE) när du tar bort biologiska prover från chipet!
- För att komma åt elektroderna och de använda lösningsmedel på aktiveringsplattan, öppna DMF-plattformslocket och vrid scenen 180°.
- Rubba magnethöljet, ta bort magneten från det roterande scenen och placera den på bänken.
- Ta bort täckplattan, kiselrån, från slitsen med ett par pincett, skölj den med DI-vatten, torka den med tryckluft och placera den i en Petri-skål, där plattorna kan förvaras och återanvändas.
- Använd en micropipette för att flytta flytande avfall från dynan utan att vidröra ytan.
- Rengör ytan genom att transportera bort vätskan från manövrerplattan med hjälp av absorberande papper (filtermaterial).
OBS: Att hålla ytan intakt kommer att öka livslängden på aktiveringsplattan, som tillåter flera användningsområden. - Rengör aktiveringsplattan genom att försiktigt svepa elektrodernas yta med en ren DI-vattendroppe med hjälp av en ren pipett. Ta sedan bort droppen med transporterande papper (filtermaterial).
VARNING: Kassera vävnader, papper, pipetter tips och handskar som är förorenade med biologiskt material i bioavfall bin. - Använd aktiveringsplattan för en annan analys eller ta bort den från DMF-plattformen för lagring eller återvinning.
Representative Results
Aktiveringsspänningspåverkan undersöktes för att belysa vilka optimala förhållanden som skulle utföra analyserna. Ett dropp från bufferten drevs vid olika aktiveringsspänningar och dess rörelse registrerades. Resultaten visade (figur 3) fanns ett samband mellan roten medelkvadratisk aktiveringsspänning (Vrms)och den genomsnittliga hastigheten. Livslängden på en aktiveringsplatta minskade dock när höga värden för Vrms användes. Baserat på dessa resultat valdes 105 Vrms som standardaktiveringsspänning, 120 Vrms befanns fungera bäst för H2O2/Luminol droplet och 165 Vrms implementerades för extraktionluo. Dessa spänningar ingick i den automatiserade programmeringssekvensen (Tilläggsfil 1).
Två immunoassays (Figur 4) testades framgångsrikt med hjälp av EWOD-chipet med DMF-plattformen för fyra olika patogener(tabell 1). EWOD-chippet underlättade på varandra följande förflyttning av dropparna från lastkuddarna till blandningsregionen och slutligen till avfallet. Det fanns två grundläggande LUOs som upprepades i hela protokollet för att slutföra ELISA. Den första var extraktionen LUO; kort beskrivs här, droppen som innehåller suspenderade pärlor drevs till separationsplatsen i mitten av blandningszonen, magneten aktiverades automatiskt för att närma sig chipet och att slå ihop de magnetiska pärlorna i en pellet (figur 5). Därefter flyttades droppen mot avfallsplattan och lämnade pärlorna på aktiveringsplattan, vilket avslutade extraktionen LUO. Blandning var nästa nyckel LUO att äga rum på EWOD chip. Analyteprovet med en okänd koncentration av patogener flyttades till pärlorna genom elektrofuktning. Då pärlorna avbröts genom att flytta droppe med klumpade pärlor över blandningsområdet (10 kuddar totalt). Dessa två luos var viktiga eftersom de underlättade en miniatyriserad, snabb och reproducerbar provbearbetning med på varandra följande upptäckt av patogenerna i 6 till 10 min. Figur 6 visar hela sekvensen av luos från en immunassay uppnås med EWOD chip.
För att uppfylla de önskade automatiseringsnivåerna kan variationer i protokollet införas. Till exempel separerades pärlorna från antigenet utarmat dropp, som sedan överfördes till avfallsplattan, upprepa den grundläggande extraktionen LUO. I detta skede kan protokollet förgrena sig beroende på om detektionsantikroppart konjugerades till HRP redan, effektivt med hjälp av åtta luos totalt för att upptäcka de olika antigenerna(figur 7A-C). I dessa fall kom droppen med detektionsantikroppart till pärlorna och blandades sedan av aktivering. Alternativt kan bindning av detektionsantikroppar till Neutravidin-HRP-konjugat utföras sekventiellt på plats på EWOD-chippet, vilket det visades för kvantifieringen av E. coli (figur 7D). Båda protokollen, elisa på åtta och tio steg (figur 4) gav reproducerbar upptäckt av antigener.
Inkubationstiderna och konjugatkoncentrationerna varieradeför för att experimentellt hitta de optimala förutsättningarna för analysen (figur 7A). Det konstaterades att inkubationstiden på 160 s och konjugatkoncentrationen på 2 μg/ml uppnådde det bästa signalkvoten med en 36% ökning av signalstyrkan och praktiskt taget ingen förändring i bakgrundsljudnivåerna. Alla siffror och uppgifter som användes i avsnittet representativa resultat ändrades från ett tidigare arbete6.
| Primär / Fånga antikroppar | Detekteringsantikroppar | Antigen |
| Anti-Human Serum Albumin [15C7] (anti-HSA, Abcam ab10241) | Peppar rädisa Peroxidase (HRP) taggade anti-HSA [1A9] (Abcam ab24438) | Human Serum Albumin (HSA, Abcam) |
| Rb anti-BG polyklonal | Biotinylated Rb anti-BG polyklonal | B. globigii (BG) sporer |
| Rb anti-E.coli MRE 162 polyklonal | Biotinylated Rb anti-E.coli 162 MRE polyklonal | E. coli MRE 162 |
| Get anti-MS2 polyklonal | Biotinylated Rb anti-MS2 polyklonal | MS2 bakteriophage virus |
Tabell 1: Antigener och antikroppar som testats med detta protokoll. Fyra typer av patogenantigener användes för att visa funktionerna i EWOD-chippet med DMF-plattformen.
Bild 1: Design av EWOD-plattan. aSchematisk notation av EWOD-aktiveringsplattan med kontakter (rutor, överst) som är kopplade (linjer) till elektroderna (rutor, nederkant). Varje pad tilldelas ett nummer och kan adresseras från programvarukoden (Tilläggsfil 1). De lastade elektrodkuddarna markeras med pilar och betecknas med en versaler ovanför eller under varje pad. En viktig funktion för DMF-plattformen är blandningszonen som består av tio kuddar (nr 31, 32, 33, 36, 37, 42, 43, 44, 46, 47). Som visuell guide markeras blandningszonen med en röd rektangel. b)Mikrograf av dynornas mikronätsdesign. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 2: Komponenter och nyckelsteg för dmf-enheten (Digital microfluidic system). (A) Fäst EWOD-aktiveringsplattan, placera shimsen på det roterande steget och ladda dropparna. (B) Placera täckplattan. (C) Montera magnethöljet, fäst spärrarna och vrid scenen 180°. (D) Den automatiserade magneten pekar nedåt. Kontrollera placeringen och formen på dropparna, kontrollera att pcb-stiften (Printed Circuit Board) är i linje med kontakterna på EWOD-chippet, anslut fotodetektorn och placera den i fotodetektorfacket. Efter att ha anslutit styrelektroniken till en dator är systemet redo att köra analysen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 3: Upprepad användning av aktiveringsplattorna och påverkan på aktiveringsspänningen. Den genomsnittliga hastigheten för ett dropp från den löpande bufferten ritas som en funktion av aktiveringsspänningen (blå cirklar) och standardavvikelsen från tre oberoende mätningar (N = 3). Här anger antalet analyser per platta (grå staplar) ett förbättrat sönderfall av ytan vid högre spänningar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Diagram över de immunoassays som testats med EWOD. Varje cirkel i detta diagram representerar en volym på 2,5 μL som laddas på EWOD-chippet. Det första protokollet (på vänster sida) visar åtta luos med hjälp av förblandad antikropp-HRP-konjugat; Det andra protokollet omfattar tio luos,adderade system ansvariga för strålning, pärlextraktion och på varandra följande bindning av Neutravidin-HRP-konjugat. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 5: Magnetisk ad-extraktion. Denna process är uppdelad i (a-c) aktivera droppen med suspenderade magnetiska pärlor till den magnetiska separationsplatsen i mitten av blandningszonen (pad nr 33), (d, e) magneten rör sig i position med fokus på pärlor, (f, g, h) pärlor hålls på plats av den magnetiska kraften medan droppen aktiveras bort av EWOD mot avfallsplattan (pad. 41). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: Komplett immunanalyssekvens med EWOD, som visar reagenser, provlastning och laboratorieenhet. Varje rad innehåller en sekvens av exempelbilder från de karakteristiska operationerna på en droppe. Åtgärderna är indelade i kolumner. Blandning utförs inte för pärlorna i suspension, presenteras av en svart bruten linje. Droplet riktningar indikeras av blå pilar, pärlorna markeras i en av bilderna av en orange pil. Den grå rutan (nedre högra hörnet) separerar de två bilder som representerar rörelse och position i detektionsområdet, den brutna cirkeln belyser detektionsområdet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7: Kalibreringskurvor från immunoassays som utförs på EWOD-chip med DMF-plattformen. Som tidigare rapporterats6 utspänningsspänningar (mV) kontra koncentrationer visas för: (A) Human serum albumin, som används för att studera effekten av konjugatantikroppskoncentrationen [C] och inkubationstiden, tinc,mätt från blandning av pärlorna med känd analyt tills utvinningen LUO, B) B. atrophaeus (BG) sporer som visar immunoassayens reproducerbarhet, (C) MS2 bacteriophage immunoassay och (D) tio-LUOs-protokollresultat för E. coli. Förkortningar: kolonibildande enheter (cfu), plackbildande enheter (pfu), antal oberoende experiment (N), laboratorieenhet (LUO). Figur ändrad från föregående publikation6. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande fil 1: Komplett sekvens för att köra DMF-plattformen för automatiserad ELISA-analys med Neutravidin-HRP som konjugat. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande fil 2: Gui för chemiluminescence mätning och ett exempel från en mätning med programvaran visas. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Discussion
EWOD-immunoassayprotokollet är flexibelt och kan omfatta ett annat antal laboratorieoperationer (t.ex. fånga antigen, blandning, inkubation, beadutvinning, tvättning) beroende på de reagenstyp, stabilitets- och användningskrav som definieras av analysprotokollet. Som ett principbevis anses två immunoassayprotokoll i den aktuella artikeln visa genomförandet av åtta eller tio luos(figur 4)med EWOD-chippet som beskrivs. Sådana miniatyrisering fördelar från mikroliter, diskreta volymer av reagenser/ analyt som ökar effekten av ELISA genom att minska både förbrukningen av reagenser, den tid som krävs per operation, i huvudsak den totala experimentella tiden (6 till 10 min). Dessutom är analysen automatiserad med tidssänkad manipulering av droppar som minskar variationer na och förbättrar precisionen i immunoassay17. I sitt nuvarande format innebär experimentet manuell hantering av droppar i början av varje analys, vilket är en punkt för vidare diskussion i nästa avsnitt.
Ett kritiskt steg i den nuvarande DMF-metoden är att dela ut dropparna på Ytan av EWOD-chippet. Vanligtvis används en micropipett e med en engångsspets för att mäta den exakta volymen och ladda den. Det kan dock bli svårt att immobilisera droppen på den hydrofoba ytan av aktiveringsplattan på grund av interaktioner mellan droppen och den laddade ytan på engångsspetsen. Som ett resultat kan droppen skjuta upp efter den yttre ytan av spetsen istället för att stanna kvar på plattan. För att undvika detta måste mikropipetten hållas i upprätt läge, vinkelrätt mot spånytan, utan att röra vid den, kan droppen lämnas ut på lastplattan genom att den kommer i kontakt med ytan. Om droppen fastnar på pipettspetsen, returnera den till lagerlösningen, byt tipset och sätt tillbaka en ny dropp. I en vidareutveckling av det nuvarande proof-of-concept-systemet kan automatisk leverans av dropp planeras.
Ett annat kritiskt steg, innan du kör analysen, stänger locket på parallellplattan satt. Som tidigare nämnts i protokollet måste locket glidas ovanpå aktiveringsplattan. Lockets hydrofoba yta förhindrar förvrängning och förskjutning av dropparna som sitter på manövrerplattan. För att garantera droppens smidiga rörelse rekommenderas det starkt att använda orörd aktiveringsplatta, korrekt lastning av dropparna och spånmonteringen. Det är möjligt att återanvändbara för aktiveringsplattorna. Antalet cykler beror dock på aktiveringsspänningarna (figur 3)och analyt/reagensnedsättning på ytan, aka biofouling. Den presenterade plattformen utnyttjade kromtryckt EWOD-chip, som skulle kunna återanvändas på ett tillförlitligt sätt för på varandra följande mätningar upp till fyra gånger vid driftspänning på 120 V och mellanplattsrengöring efter varje experiment. Plattorna återvanns, för att minska kostnaden per experiment, genom att dekontaminera (borsta ytan med outspäddrengöringsmedel innan de sköljde noggrant) den biofouled amorfa fluorpolymerer(Table of Materials)beläggning och spin-beläggning en ny ovanpå plattan. Manövrering plattan återvinning kräver manuell hantering, kostsamma reagenser (amorfa fluorpolymerer(Table of Materials)) och specialiserad utrustning (spin-coater). Alternativa EWOD-chips undersöks framgångsrikt med kostnadseffektiva substrat som papper19,acetatfilmer eller kretskort (PCB)20,21. Sådana engångsförbrukningsvaror kan underlätta tillförlitlig och prisvärd användning av DMF-plattformen och kan ge medel för att kringgå biofouling frågan.
Biofouling är den huvudsakliga begränsningen av EWOD för biologiska tillämpningar22,23. Tidigare studier på DMF har identifierat två mekanismer som bidrar till biofouling, nämligen passiv adsorption på grund av hydrofoba interaktioner, och en elektrostatiskt driven adsorption manifesteras när ett elektriskt fält appliceras24. Resultaten i den aktuella artikeln är förenliga med denna teori eftersom det dokumenterades aktiveringsplattan återanvändbarhet minskar vid höga aktiveringsspänningar. En möjlig förklaring är att proteiner adsorb lätt på Fluoropolymer-belagda (Teflon-liknande) ytor och de aggregerar snabbare på fouled i jämförelse med orörda ytor24. Som en följd av detta är proteinrelaterade analyser på DMF svåra att kvantifiera och kan uppleva förlust av analyt, korskontaminering och minskad precision17. Det värsta scenariot är när en kritisk mängd protein adsorbs vilket gör enheten värdelös. För att minimera biofouling, olika metoder har undersökts från att minimera uppehållstiden för droppen på chipet, genom beläggningar23, till tillsatser (dvs. ytaktiva ämnen eller pluronsyra) i biomaterial-lastade droppar6,22. Därför en viktig aspekt av immunoassay analysen på EWOD är att välja anti-biofouling strategier som är kompatibla med det specifika protokollet till hands.
Den automatiserade DMF-plattformen är utformad för att utföra en enda smörgås ELISA-test per körning när du använder mikrolitervolymer för både reagenser och analyt. När det krävs finns konventionellsmörgås ELISA-satser baserade på förbelagda 96-brunns- eller 384-brunnsplattor som i kombination med hjälplaboratorieutrustning resulterar i högre genomströmning per körning. baserat på reagenser pris endast, den ungefärliga kostnaden per analys / brunn är 6,04 USD (580 USD/96) och 0,33 USD (2 × 580 USD/384) respektive. Detta gör de konventionella ELISA-metoderna idealiska för ett stort antal prover som bearbetas vanligtvis av utbildad teknisk personal vid centraliserade laboratorieanläggningar. På avlägsna platser visade dock ELISA:s detaljerade kostnadsanalys för miljöövervakning att när kapitalkostnaderna (dvs. laboratoriedriftskostnader, återkommande kostnader, provtransport, förnödenheter och personal) ingick det faktiska priset per ELISA var 60 USD var 34 USD för leveranser per urval25. Däremot är den föreslagna DMF-plattformen bärbar, kräver minsta utbildning för att fungera och med förbelagda pärlor kan ge prov-till-svar-analys på några minuter. Därför kan den presenterade tekniken användas till behovsplatser och komplettera analyser som annars finns i centraliserade laboratorier.
I avsnittet representativa resultat användes den automatiserade DMF-immunoassay-plattformen för direkt detektering av patogener för försvarsapplikation. Andra möjliga tillämpningar för DMF-plattformen omfattar men är inte begränsade till, biodiagnostisk, kontinuerlig övervakning och automatiserad provtagning. Potentiellt dmf kan påverka olika sektorer från point-of-care för personlig hälso-och sjukvård, samt kontrollerad miljöövervakning för skydd av patienter från luftburna sjukhus förvärvade infektion, till gröda övervakningssystem för jordbruk och livsmedelsproduktion.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vi vill uppmärksamma våra kollegors bidrag från den mikrofluidiska forskargruppen för deras arbete med mekanisk design och systemintegration. Författarna vill tacka Dstl Porton Down för deras ovärderliga stöd och ekonomiska bidrag, till tidigare och pågående projekt som vidareutvecklar DMF-tekniken och dess tillämpningar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid, HEPES | Sigma-Aldrich | H9897 | |
| Anti-Human Serum Albumin [15C7] | Abcam | ab10241 | |
| Anti-Human Serum Albumin [1A9] (HRP) | Abcam | ab24438 | |
| B. atrophaeus (BG) spores | Dstl, UK | N/a | |
| Biotinylated Rb anti-BG polyclonal | Dstl, UK | N/a | |
| Biotinylated Rb anti-E. coli MRE 162 polyclonal | Dstl, UK | N/a | |
| Biotinylated Rb anti-MS2 polyclonal | Dstl, UK | N/a | |
| Blocker Casein | Thermo Scientific | TFS 37582 | |
| CNC Dicing/Cutting Saw | MTI Corp, USA | SYJ-400 | |
| Cytop | AGC, Japan | CTL-809M | Amorphous fluoropolymers. This is a two component coating. |
| E. coli MRE 162 | Dstl, UK | N/a | |
| Goat anti-MS2 polyclonal | Dstl, UK | N/a | |
| Hamamatsu photodiode | Hamamatsu, Japan | S9270 | |
| Hidrochloric acid (32%) | Sigma-Aldrich | W530574 | |
| Mask manufacturing service | Compugraphics, Scotland, UK | N/a | |
| MS2 virus | Dstl, UK | N/a | |
| Parylene-C, DPX-C | Specialty Coating System, USA | CAS No.: 28804-46-8 | |
| Pierce Direct Magnetic IP/Co-IP Kit | Thermo Scientific | 88828 | Contains all buffers and reagents required for enzyme immobilisation. Store at 4 °C. |
| Rb anti-BG polyclonal | Dstl, UK | N/a | |
| Rb anti-E. coli MRE 162 polyclonal | Dstl, UK | N/a | |
| Recombinant Human Serum Albumin protein, HAS | Abcam | ab201876 | |
| SCS Parylene Deposition System | Specialty Coating System, USA | 2010 | |
| Silicon wafer, 4'', p-type, <100>, 1–10 Ωcm | Pi Kem Ltd | N/a | |
| Spin Coater | SÜSS MicroTec AG, Germany | ||
| SuperSignal ELISA Femto Maximum Sensitivity Substrate | Thermo Scientific | 37075 | It contains 50 mL of Luminol/ Enhancer and Stable Peroxide solutions. Store at 4 °C. |
| Tween 80 | Thermo Scientific | 28328 | The manifacturer is Surfact-Amps Detergent Solution. |
References
- Kokalj, T., Pérez-Ruiz, E., Lammertyn, J. Building bio-assays with magnetic particles on a digital microfluidic platform. New Biotechnology. 32 (5), 485-503 (2015).
- Sista, R., et al. Development of a digital microfluidic platform for point of care testing. Lab on a Chip. 8 (12), 2091-2104 (2008).
- Starodubov, D., et al. Compact USB-powered mobile ELISA-based pathogen detection: design and implementation challenges. Advanced Environmental, Chemical, and Biological Sensing Technologies VIII. 8024, 80240 (2011).
- Delattre, C., et al. Macro to microfluidics system for biological environmental monitoring. Biosensors and Bioelectronics. 36 (1), 230-235 (2012).
- Gooding, J. J. Biosensor technology for detecting biological warfare agents: Recent progress and future trends. Analytica Chimica Acta. 559 (2), 137-151 (2006).
- Coudron, L., et al. Fully integrated digital microfluidics platform for automated immunoassay; A versatile tool for rapid, specific detection of a wide range of pathogens. Biosensors and Bioelectronics. 128, 52-60 (2019).
- Hua, Z., et al. Multiplexed Real-Time Polymerase Chain Reaction on a Digital Microfluidic Platform. Analytical Chemistry. 82 (6), 2310-2316 (2010).
- Zou, F., et al. real-time chemiluminescent detection of DNA mutation based on digital microfluidics and pyrosequencing. Biosensors and Bioelectronics. 126, 551-557 (2019).
- Ng, A. H. C., Choi, K., Luoma, R. P., Robinson, J. M., Wheeler, A. R. Digital microfluidic magnetic separation for particle-based immunoassays. Analytical Chemistry. 84 (20), 8805-8812 (2012).
- Vergauwe, N., et al. A versatile electrowetting-based digital microfluidic platform for quantitative homogeneous and heterogeneous bio-assays. Journal of Micromechanics and Microengineering. 21 (5), (2011).
- Choi, K., et al. Automated digital microfluidic platform for magnetic-particle-based immunoassays with optimization by design of experiments. Analytical Chemistry. 85 (20), 9638-9646 (2013).
- Zhao, Y., Cho, S. K. Microparticle sampling by electrowetting-actuated droplet sweeping. Lab on a Chip. 6 (1), 137-144 (2006).
- Jonsson-Niedziołka, M., et al. EWOD driven cleaning of bioparticles on hydrophobic and superhydrophobic surfaces. Lab on a Chip. 11 (3), 490-496 (2011).
- Foat, T. G., et al. A prototype personal aerosol sampler based on electrostatic precipitation and electrowetting-on-dielectric actuation of droplets. Journal of Aerosol Science. 95, 43-53 (2016).
- Seale, B., et al.
- Ng, A. H. C., et al. A digital microfluidic system for serological immunoassays in remote settings. Science Translational Medicine. 10 (438), 6076-6088 (2018).
- Wild, D., Davies, C. Immunoassay fundamentals. The Immunoassay Handbook: Theory and Applications of Ligand Binding, ELISA and Related Techniques. , 1-26 (2013).
- Gorham, W. F. A New, General Synthetic Method for the Preparation of Linear Poly-p-xylylenes. Journal of Polymer Science Part A-1: Polymer Chemistry. 4 (12), 3027-3039 (1966).
- Soum, V., et al. Affordable fabrication of conductive electrodes and dielectric films for a paper-based digital microfluidic chip. Micromachines. 10 (2), (2019).
- Abdelgawad, M., Wheeler, A. R. Low-cost, rapid-prototyping of digital microfluidics devices. Microfluidics and Nanofluidics. 4 (4), 349-355 (2008).
- Jain, V., Devarasetty, V., Patrikar, R. Study of Two-Dimensional Open EWOD System using Printed Circuit Board Technology. Global Journal of Researches in Engineering: Electrical and Electronics Engineering. 17 (6), (2017).
- Luk, V. N., Mo, G. C. H., Wheeler, A. R. Pluronic additives: A solution to sticky problems in digital microfluidics. Langmuir. 24 (12), 6382-6389 (2008).
- Latip, E. N. A., et al. Protein droplet actuation on superhydrophobic surfaces: A new approach toward anti-biofouling electrowetting systems. RSC Advances. 7 (78), 49633-49648 (2017).
- Yoon, J. Y., Garrell, R. L. Preventing biomolecular adsorption in electrowetting-based biofluidic chips. Analytical Chemistry. 75 (19), 5097-5102 (2003).
- Dalvie, M. A., et al. Cost analysis of ELISA, solid-phase extraction, and solid-phase microextraction for the monitoring of pesticides in water. Environmental Research. 98 (1), 143-150 (2005).
