Avaliação eletromecânica da atividade cardiomiocito optogeneticamente modulada

As fotocorrentes mediadas pelo ChR foram registradas pela primeira vez no olho das algas verdes unicelulares^1,2. Logo após a clonagem genética e expressão heteróloga de Chlamydomonas reinhardtii ChR1 e ChR2, chR foram usados como ferramentas para alterar o potencial de membrana em oócitos xenopus e células mamíferas pela luz^3,4. A Cção não-seletiva chR despolariza a membrana das células com um potencial de membrana de repouso que é negativo para o potencial de reversão da RCh. Assim, podem ser usados para provocar AP em células excitáveis, incluindo neurônios e CM, permitindo o ritmo óptico^5,6.

Complementares ao cárter ChR, próton leve, cloreto e bombas de sódio^7,8,9 foram usados para inibir a atividade neuronal^10,11,12. No entanto, estes últimos possuem limitações, exigindo altas intensidades de luz e iluminação sustentada, uma vez que um íon é transportado por fóton absorvido. Em 2014, dois estudos independentes de Wietek et al. e Berndt et al. descreveram a conversão de CS rc condutorde cáção em ACR através de mutações no poro do canal^13,14. Um ano depois, a ACR natural foi descoberta no criptofite Guillardia theta (GtACR)¹⁵. Como a ACR projetada mostrou condutância residual, elas foram substituídas por ACR natural, caracterizada por uma grande condutância de canal único e alta sensibilidade à luz¹⁵. O GTACR foi utilizado para silenciar a atividade neuronal polarizando o potencial de membrana para o potencial de reversão do cloreto^16,17. Govorunova et al. aplicaram GtACR1 a CM ventricular de ratos cultivados e mostraram fotoinibição eficiente a baixos níveis de intensidade de luz que não eram suficientes para ativar ferramentas de inibição previamente disponíveis, como a bomba de prótons Arch¹⁸. Nosso grupo informou recentemente que a fotoinibição mediada por GTACR1 de CM é baseada na despolarização e que o GtACR1 também pode ser usado, portanto, para o ritmo óptico de CM¹⁹.

Aqui, apresentamos um protocolo para estudar os efeitos eletrofisiológicos e mecânicos da fotoativação gtacr1 em cm ventricular de coelho cultivado. Descrevemos primeiro o isolamento celular, a cultura e a transdução. Os efeitos eletrofisiológicos são medidos usando gravações de grampode remendo de células inteiras. As correntes mediadas pela luz em uma determinada tensão de membrana são avaliadas no modo v-clamp. A dinâmica do potencial da membrana é medida enquanto eletricamente ou opticamente aceleram CM (modo I-clamp). A inibição óptica do AP acionado eletricamente é testada usando a aplicação de luz sustentada. Os efeitos mecânicos são medidos usando fibras de carbono em combinação com o rastreamento baseado em imagens do comprimento do sarcomere. Para isso, as células opticamente paceable são mecanicamente pré-carregadas, anexando duas fibras de carbono à membrana plasmática perto de extremidades celulares opostas. Alterações de comprimento de sarcomere são registradas durante o ritmo óptico ou elétrico. Finalmente, a fotoinibição é medida durante a estimulação do campo elétrico das células, e as forças geradas são analisadas.

O protocolo inclui as seguintes etapas indicadas no fluxograma na Figura 1:anestesia profunda do coelho, injeção de overdose de tiropental, excisão cardíaca, langendorff-perfusão e digestão tecidual, dissociação mecânica do tecido para liberação de células, análise microscópica de rendimento de CM, cultivo de CM, transdução com adenovírus tipo 5, seguido de incubação e experimentos funcionais.

Figura 1: Fluxograma do protocolo utilizado para obter CM eletricamente e opticamente paceable. Os corações são extirparados de coelhos de 9 a 10 semanas de idade, e o tecido cardíaco é digerido enquanto é perfundido usando uma configuração Langendorff. As células são liberadas por agitação mecânica. O rendimento cm é contado um microscópio. Cm são cultivados, transduzidos com adenovírus tipo 5 e experimentos funcionais são realizados 48-72 horas após a transdução. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Todos os experimentos com coelhos foram realizados de acordo com as diretrizes estabelecidas na Diretiva 2010/63/UE do Parlamento Europeu sobre a proteção de animais usados para fins científicos e aprovados pelas autoridades locais em Baden-Württemberg (Regierungspräsidium Freiburg, X-16/10R, Alemanha).

1. Soluções para isolamento celular

1. Preparar as soluções para o isolamento celular com água dos seguintes requisitos (Tabela 1) e de acordo com as composições iônicas listadas na Tabela 2.
   NOTA: CaCl₂ e MgCl₂ são adicionados a partir de soluções de estoque de 1 M.

Tabela 1: Requisitos hídricos.

Tabela 2: Soluções para isolamento cm.

2. Ajuste todas as soluções para pH 7.4 a 37 °C e verifique a osmolaridade.
   NOTA: Dissolva as enzimas (Collagenase tipo 2 e Protease XIV) diretamente antes da excisão cardíaca. Oxigene todas as soluções antes de usar.

2. Preparação da configuração langendorff-perfusão

NOTA: A configuração usada é feita medida. Como descrito na Figura 2,a configuração consiste em três reservatórios revestidos de água (1-3), um trocador de calor de contrafluxo em espiral (4) e um vaso de perfusão revestido de água (5).

Figura 2: Configuração de perfusão de Langendorff otimizada para o isolamento das células de coelho. (1-3) Reservatórios reprodutores de água com (1) solução salina fisiológica, (2) baixo cálcio, solução de potássio elevado e (3) solução cardioplégica contendo enzimas. (4) Trocador de calor de contrafluxo em espiral e (5) tanque de coleta com tampa de água. O fluxo do sistema revestido de água é o trocador de calor em espiral (a temperatura das soluções que saem da cânula de perfusão no final do trocador de calor deve ser constante a 37 °C), seguida pelo vaso de perfusão e os três reservatórios. Todas as soluções são oxigenadas (linha tracejada). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

1. Ligue a bomba do banho de água para circular água a 38 °C no sistema de troca de calor e pré-aqueça todas as soluções a 37 °C.
   NOTA: A temperatura no fluxo de saída de (4) deve ser controlada e constante a 37 °C.
2. Encha os três reservatórios com a respectiva solução e lave cada linha (preta) com a solução correspondente. Encha a linha principal (azul) no final sem bolhas de ar usando solução (1).
   NOTA: Oxigene as soluções antes (10 min) e durante o uso. Encha a linha do reservatório (3) até a torneira com baixo cálcio, solução de potássio alto.
3. Prepare uma sutura para amarrar o coração ao redor da aorta na cânula.

3. Isolamento celular

1. Prepare as seguintes seringas.
   1. Para sedação/anestesia: Misture 0,5 mL/kg de cloridrato de esquetamina de peso corporal (25 mg/mL) e 0,2 mL/kg de cloridrato de xilazina de peso corporal (2%).
   2. Encha duas seringas com 12 mL de solução NaCl (0,9%).
   3. Preparar 6 mL de 12,5 mg/mL Na-thiopental, dissolvido em solução NaCl de 0,9%.
   4. Encha 0,2 mL de cloridrato de esquetamina (25 mg/mL) em uma seringa.
   5. Diluir 0,2 mL de Na-heparina (5.000 UI/mL) em 1 mL de solução NaCl de 0,9% (concentração final 1.000 UI/mL).
2. Coelhos sedados/anestesiantes (9-10 semanas, coelho branco da Nova Zelândia, fêmea ou macho, ~2 kg) através de injeção intramuscular de cloridrato de esquetamina e cloridrato de xilazina (passo 3.1.1).
   NOTA: Os coelhos precisam de pelo menos 10 min para serem totalmente anestesiados; a duração exata depende do seu peso corporal. Confirme a anestesia com a perda do reflexo de redireita.
3. Raspe o peito e as orelhas onde as veias estão localizadas.
4. Insira uma cânula flexível na veia do ouvido, fixe-a com fita e lave-a com uma solução NaCl de 0,9%.
5. Injete 1 mL da solução de Na-heparina por via intravenosa e lave-se com solução NaCl de 0,9%.
6. Injete 0,2 mL de cloridrato de esquetamina, lave novamente com solução nacl de 0,9% e injete Na-thiopental até apnéia.
   NOTA: O Coelho não deve responder ao reflexo de retirada do pedal.
7. Abra o peito do lado esquerdo e remova o pericárdio.
8. Inicie o temporizador quando o coração for extizado e lave o coração duas vezes em solução fisiológica sorofia.
   NOTA: Use uma tesoura com pontas redondas para evitar danos acidentais ao tecido cardíaco.
9. Cannulate a aorta em um banho com solução salina fisiológica e mantenha todo o tecido em solução. Ligar o sistema langendorff-perfusão (solução salina fisiológica (1), velocidade 24 mL/min).
10. Transfira o coração para a configuração de perfusão de Langendorff, conecte a aorta ao bocal perfusato e amarre firmemente o coração com a sutura ao redor da aorta à cânula (< 1 min).
    NOTA: Pré-encha a cânula com solução salina fisiológica, certifique-se de que nenhuma bolha de ar entre na cânula durante o transporte do local de cânula para a configuração langendorff, conecte-se sem bolhas.
11. Perfuja o coração até que todo o sangue seja lavado (2-3 min).
12. Mudar para baixo cálcio, solução de potássio alto (2). Perfuse por mais 2 min depois que o coração parou de bater e mudar para solução enzimática.
13. Comece a circular a solução enzimática, após 2 min desde o início da digestão, de volta ao reservatório. Diminua a velocidade para 16 mL/min após 5 min de digestão.
14. Quando o tecido parecer macio (40-50 min de digestão), corte o coração da cânula e separe o ventrículo esquerdo.
15. Solte as células por dissociação mecânica (separar suavemente o tecido com uma pipeta e um fórceps finopara segurar o tecido) na solução de bloqueio.
16. Filtrar a suspensão celular através de uma malha (tamanho dos poros de 1 mm²) e centrífuga por 2 min a 22 x g (aceleração gravitacional).
17. Remova o sobrenadante contendo não miócitos e suspenda novamente cm na solução de bloqueio.

4. Cultivo de CM

NOTA: Realize as seguintes etapas em condições estéreis.

1. Diluir a laminina (da membrana do porão de sarcoma de murina Engelbreth-Holm-Swarm, 1 mg/mL) 1:10 em solução salina tamponada de fosfato estéril (sem Ca²⁺/Mg²⁺) para uma concentração final de 100 μg/mL.
2. Preparar o meio de cultura em M199-Medium com os suplementos indicados na Tabela 3.

Tabela 3: Meio de cultura celular.

3. Solução de filtro estéril (0,22 μm) e adicionar 5% de soro bovino fetal.
4. Para experimentos de retalhos, tampas autoclave sucursais ø 16 mm, espessura nº 0, cubra-os com lamina de 100 μg/mL diretamente antes de cultivar.
5. Para experimentos com fibra de carbono, cubra a superfície da placa de Petri com poli(2-hidroxitil metocrilato) (poli-HEMA, 0,12 g/mL em 95:5 EtOH:H₂0) e deixe solidificar.
   NOTA: As células não 'grudam' em placas de Petri revestidas de poli-HEMA; isso é crucial para sua contração sem atrito em estudos de mecânica celular.
6. Após a re-suspensão cm ter resolvido (~10-15 min), remova o sobrenadante e, em seguida, suspenda novamente CM no meio de cultura.
7. Conte CM com uma câmara de Neubauer e sementes a uma densidade alvo de 17.500 células/mL, seja em tampas revestidas de lamin a lamin ou em placas de Petri revestidas de poli-HEMA.
8. Incubar células a 37 °C, 5% CO₂ por 3-4 horas. Troque o meio (37 °C) de células semeadas de deslizamento de cobertura.
9. Adicione acodificação de adenovírus (tipo 5) para GtACR1-eGFP em uma multiplicidade de infecção (MOI) de 75 e inicie experimentos funcionais após 48 horas.
   NOTA: Após a transdução, mantenha as células no escuro. Use iluminação vermelha ao trabalhar com proteínas azuis ou verdes ativadas pela luz. Um sistema de entrega adenoviral comercialmente disponível (ver Tabela de Materiais) é usado para clonar os genes que codificam gtacr1-eGFP no vetor adenoviral. A inserção de interesse, aqui GtACR1-eGFP, é amplificada pcr e, em seguida, combinada com um vetor adenoviral incluindo um promotor CMV em uma reação de clonagem IN-Fusion. O promotor cmv (citomegalovírus humano) é comumente usado para conduzir a superexpressão de transgenes em células de mamíferos. eGFP é uma proteína fluorescente verde aprimorada derivada de Aequorea victoria com um máximo de excitação de 488 nm e um máximo de emissão em 507 nm. O Adenovírus (tipo 5) foi produzido externamente em Charité-Universitätsmedizin Berlin, Institut für Pharmakologie, Berlin, Prof. Dr. Michael Schupp.
   ATENÇÃO: A transdução adenoviral é categorizada como trabalho de nível de segurança BSL-2, e as medidas de segurança apropriadas são legalmente necessárias.

5. Experimentos funcionais

NOTA: As gravações são realizadas usando um microscópio de fluorescência invertido. Filtrar a luz de transmissão por um filtro de banda-pass vermelho (630/20 nm) no condensador para evitar a co-ativação de GtACR1.

1. Configuração do patch-clamp
   1. Use um amplificador em combinação com um conversor analógico para digital. Use um software de aquisição de dados para registrar dados de corrente e tensão (ver Tabela de Materiais).
      NOTA: Os dados gravados são digitalizados a 10 kHz e filtrados a 5 kHz.
2. Configuração de fibra de carbono
   1. Use uma câmera para detectar a posição da fibra de carbono e o comprimento do sarcomere rastreando mudanças no contraste óptico (as fibras de carbono aparecem como estruturas mais escuras, sobrepostas ao padrão celular estriado). Uma representação esquemmática da configuração é mostrada na Figura 3.
      NOTA: O comprimento de sarcomere é calculado em tempo real usando uma rápida transformada fourier (FFT) do espectro de energia do padrão de estria.

Figura 3: Esquema que retrata a configuração experimental para medições de fibra de carbono. (O desenho não está em escala). Duas fibras de carbono são anexadas em uma célula e sua posição é controlada por um posicionador piezo. O pacer é usado para estimulação de campo elétrico. LeDs multicoloridos são acoplados na porta de epifluorescência do microscópio invertido para iluminação de células no plano do objeto. A energia LED é controlada através de uma caixa de controle dedicada, que recebe pulsos digitais através da saída digital do digital-analogue-converter (DAC). O DAC se comunica através da saída analógica com a interface do sistema de fluorescência. Uma câmera em preto e branco (774 pixels por 245 linhas) para imagens celulares é conectada ao computador para rastrear o comprimento do sarcomere e a dobra de fibra de carbono. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

3. Iluminação temporizado
   1. Fornecer luz para microscopia de fluorescência e ativação de canais de íons com tampa de luz através de uma caixa de controle LED personalizada externa, composta por três LEDs de cores diferentes (460 nm, 525 nm, 640 nm, ver Tabela de Materiais).
   2. Modifique o código de interface do usuário microcontrolador e gráfico (GUI) para a caixa de controle para permitir o controle do LED através de pulsos de Tempo de Vida externo (TTL), gerados em protocolos de software de aquisição de dados (ver Tabela de Materiais). Transmita pulsos TTL para a caixa de controle LED através do conversor digital-analógico.
   3. Dirija o LED e escolha o número de pulsos através da GUI. Ao receber o comando da GUI, o microcontrolador inicia um processo em um novo núcleo. Nesse processo, a entrada TTL, bem como um conjunto de interruptor de controle da GUI serão continuamente verificados.
   4. Quando a entrada TTL é positiva, o microcontrolador liga o LED e, em seguida, retoma a verificação da entrada TTL. Uma vez que o sinal TTL retorna a zero, o microcontrolador desliga o LED e reduz o número de pulsos deixados por um. Se em algum momento o interruptor de controle for falso ou o número de pulsos for zero, o microcontrolador interrompe esse processo até que um novo comando seja recebido da GUI.
   5. Acople diretamente os LEDs no backport do microscópio.
4. Determinação da intensidade da luz no plano do objeto
   1. Medir a área iluminada com um micrômetro de estágio (ampliação objetiva 40x, A = 0,8 mm²).
   2. Use um medidor de potência óptico (ver Tabela de Materiais).
   3. Defina as configurações para os experimentos: comprimento de onda de excitação (525 nm), ampliação objetiva (40x), filtro de excitação (530/20 nm) ou espelho, e leia a energia de luz [W] em várias tensões de entrada led.
   4. Calcule a intensidade da luz [W/mm²] dividindo a potência da luz [W] pela área iluminada [mm²] (aqui: 0,8 mm²).
      NOTA: Meça a potência real da luz com os respectivos protocolos na etapa 5.6 para verificar se durações curtas de pulso de luz de 10 ms alcance e durações longas mantêm o valor definido(Figura Suplementar 1).
5. Preparação para experimentos de patch-clamp
   1. Prepare as seguintes soluções externas e internas (Tabela 4; para os requisitos hídricos ver Tabela 1).
   2. Ajuste a osmolaridade com glicose a 300 ± 5 mOsmol/L. Aliite a solução interna e armazene a -20 °C.
      NOTA: Mantenha a solução interna no gelo durante o dia da gravação. Mantenha a solução externa em temperatura ambiente. As soluções aqui descritas de patch-clamp foram baseadas em soluções previamente utilizadas e a Cl^- a concentração foi alterada para níveis mais baixos e fisiológicos⁷. Para caracterização da seletividade de íons do respectivo atuador optogenético, sugere-se variar as concentrações de íons maiores (por exemplo, Cl^-, Na⁺, K⁺, H⁺) nas soluções extra e intracelulares¹⁹.
   3. Retire o eletrodo de gravação do suporte da pipeta e remova a camada de cloreto de prata do fio de prata com lixa muito fina.
      NOTA: Faça esta etapa no início de cada dia de medição.
   4. Conecte o fio ao pólo positivo de uma bateria de 1,5 V e mergulhe na solução de 3 M KCl para revestimento de cloreto de prata por 10 min.
      NOTA: O pólo negativo está conectado a um fio prateado de referência imerso na solução de 3 M KCl.
   5. Prepare a câmara de medição: coloque graxa de silicone na estrutura da câmara de medição e coloque uma travessa (diâmetro: 50 mm, espessura nº 0) na parte superior da estrutura que a câmara está selada.
   6. Coloque um eletrodo de pelota de prata/prata-cloreto de referência no banho e conecte-o com o estágio da cabeça.
   7. Puxar 1,7 - 2,5 MΩ de cantas de vidro de cal de soda (diâmetro externo: 1,55 mm, diâmetro interno: 1,15 mm) com um puxador de micropipeta (ver Tabela de Materiais).
   8. Iniciar software de aquisição de dados e ajustar o teste de membrana (pulso 10 mV para 15 ms, linha de base 0 mV).

Tabela 4: Soluções de grampo de remendo.

6. Protocolos para medições de patch-clamp
   1. Gravar o protocolo de fotoativação no modo v-clamp em um potencial de retenção de -74 mV. Use pulsos de luz de 300 ms.
      NOTA: Sugerimos a realização de gravações de grampo sémio perto do potencial de membrana de repouso do CM cultivado (estabelecido em i-clamp; em nossas mãos entre -79 mV e -77 mV tanto para CM transduzidos e não transduzidos¹⁹). As células recém-isoladas apresentam um potencial médio de membrana de repouso de -79 mV(Figura Suplementar 2, todos os valores após correção do potencial de junção líquida).
   2. Gravar AP no modo I-clamp a 0 pA.
      1. Para o ritmo elétrico, injete pulsos de corrente de 10 ms (rampa de 0 pA para o valor definido dentro de 10 ms), 0,25 Hz e encontre o limiar para obter AP. Registre AP por injeções atuais de 50% mais do que o limite.
      2. Para o ritmo óptico use pulsos de luz de 10 ms, 0,25 Hz na intensidade mínima de luz para obter AP confiável.
   3. Gravar fotoinibição no modo I-clamp em 0 pA. Provocar AP conforme descrito na etapa 5.6.2.1 e aplicar luz sustentada para 64 s a 4 mW/mm² após 15 AP acionados eletricamente.
      NOTA: A Figura 6F mostra um protocolo de fotoinibição onde durante a luz sustentada são aplicadas injeções de corrente mais altas. A partir de 1,5 vezes o limiar (aqui: 0,7 nA) a corrente injetada foi aumentada em etapas de 0,1 nA (nível final: 2,2 nA). Em todas as amplitudes de corrente testadas, a aplicação de luz sustentada inibiu a geração de AP.
      1. Como experimento de controle, pausa a estimulação elétrica para 64 s sem aplicação de luz.
7. Experimentos com patch-clamp
   NOTA: Realize os seguintes experimentos no escuro (a luz vermelha pode ser usada para ferramentas ativadas por luz azul/verde).
   1. Coloque o deslizamento de cobertura com as células na câmara de medição com solução externa e selecione cm fluorescentes.
      NOTA: as células eGFP positivas podem ser detectadas usando um LED azul (460 nm) em combinação com um filtro de excitação band-pass (450 nm - 490 nm), um espelho dicórico de 510 nm e um filtro de emissão de 515 nm de longa duração. Se forem utilizadas outras etiquetas fluorescentes, utilize conjuntos correspondentes de filtros de LED e fluorescência. Se uma alta eficiência de transdução for alcançada (em nossas mãos >99% com o adenovírus GtACR1), não há necessidade de verificar a fluorescência eGFP antes dos experimentos funcionais; isso evita uma possível pré-ativação do GtACR1.
   2. Encha a pipeta de remendo com solução interna. Certifique-se de que não há bolhas de ar na ponta.
   3. Fixar a pipeta ao suporte da pipeta, inserindo o fio prateado revestido de prata de gravação na solução interna.
   4. Depois de atingir a configuração anexada à célula, mude para o modo de célula inteira no software de aquisição de dados com um potencial de retenção de -74 mV. Romper a membrana aplicando suavemente pressão negativa para acessar a configuração de células inteiras. Isso é indicado por um aumento imediato da capacitância medida.
   5. Execute os protocolos descritos na seção 5.6.
8. Técnica de fibra de carbono
   1. Produza fibras de carbono.
      1. Utilize capilares de vidro com os seguintes parâmetros: diâmetro externo: 2,0 mm, diâmetro interno: 1,16 mm, comprimento: 100 mm (ver Tabela de Materiais). Usando um puxador de micropipeette, puxe o capilar de vidro em duas pipetas do mesmo comprimento (comprimento total de fita ~11 mm, Figura 5) para um diâmetro interno final de ~30 μm.
         NOTA: As configurações utilizadas para a primeira e segunda puxadas são 85,2% (proporção da saída máxima do puxador) e 49,0%, respectivamente (dependerá do puxador, tipo e idade do filamento).
      2. Dobre as pipetas até 45° com uma micro forja auto-feita usando as configurações de 12 V, 24 A (consulte a Figura 4 para obter detalhes da configuração de dobra da pipeta).
         1. Alinhe o capilar (2) na linha vermelha no círculo de orientação (5), mantenha o posicionamento da constante capilar para que o comprimento da peça de dobra seja sempre o mesmo após o centro do círculo de orientação (raio de 4,5 mm).
         2. Dobre o capilar até 45° (linha verde) empurrando para baixo a ponta do capilar com a dobra (3) e forje aquecendo o filamento (4) até que a capilarcaptura o ângulo de 45° mesmo após a dobra ser removida.
      3. Coloque as fibras de carbono (fornecidas pelo Prof. Jean-Yves Le Guennec) na ponta fina do capilar de vidro um microscópio estéreo. Use pinças finas com tubos macios no final para aumentar a aderência e diminuir o risco de danificar as fibras.
         NOTA: Essas fibras são caracterizadas por microestruturas, que aumentam a superfície de contato entre fibras e células, melhorando assim a adesão²⁰.
      4. Corte as fibras de carbono em um comprimento de 2 mm e use super cola (cianoacrilato) para fixar a fibra na parte frontal do capilar.
         NOTA: Quanto mais tempo as fibras estiverem, mais elas se dobram na aplicação da mesma força.
   2. Calibrar fibras de carbono.
      1. Calibrar as fibras de carbono usando um transdutor de força com uma sensibilidade de 0,05 mN/V e uma faixa de força de 0 - 0,5 mN (ver Tabela de Materiais).
         NOTA: Esta configuração é feita medida para medir a compressão em vez de puxar.
      2. Conecte o capilar com a fibra de carbono a um suporte que é controlado por um micromanipulador e um motor piezo.
      3. Coloque a ponta da fibra em contato com o sensor de força, mas sem produzir qualquer força e mova o motor piezo em passos de 10 μm (movimento total de 60 μm) em direção ao sensor e leia a tensão medida(E)em Volt.
         NOTA: Certifique-se de que o transdutor de força seja contatado pela ponta da extremidade livre da fibra de carbono.
      4. Repita essas medidas três vezes.
      5. Use a Fórmula 1 para calcular a força para cada posição piezo (ΔΕ diferença de tensão medida entre os passos do motor piezo):
         
         NOTA: A sensibilidade do transdutor de força depende do modelo do transdutor (aqui: 0,05 mN/V = 50 μN/V). O ganho pode ser definido no controlador.
      6. Plote a força [μN] contra a posição piezo. A inclinação corresponde à rigidez da fibra [μN/μm].
   3. Força recorde de contratação de CM.
      NOTA: Realize os seguintes experimentos no escuro (a luz vermelha pode ser usada para ferramentas ativadas por luz azul/verde).
      1. Cubra a superfície da câmara de medição com poli-HEMA. Encha a câmara de medição com solução de banho externa e coloque algumas gotas da suspensão celular cultivada na câmara (passo 4.9).
      2. Conecte capilares com fibras de carbono ao micromanipulador de estágio. Selecione CM expressor de GtACR1 verificando a capacidade de induzir contrações por meio da aplicação de pulsos curtos de luz verde. Alinhe as fibras de carbono quase horizontalmente à superfície da câmara de medição.
      3. Abaixe a primeira fibra na superfície celular. Fixar a segunda fibra paralela à primeira fibra na outra extremidade do CM. O alinhamento ideal é quase perpendicular ao eixo celular.
         NOTA: Conecte a fibra empurrando suavemente a célula para a superfície inferior. Solte a pressão antes de fixar a segunda fibra. Não estique a célula prendendo a segunda fibra.
      4. Depois que ambas as fibras são fixadas na célula, levante as fibras, de modo que a célula não tem mais contato com a superfície da câmara e é capaz de contrair sem qualquer atrito.
      5. Concentre os sarcomeres no software de aquisição de dados (ver Tabela de Materiais) e defina a janela de rastreamento do comprimento do sarcomere(Figura 7A I(3)) entre as fibras.
         NOTA: O espectro de energia FFT resultante(Figura 7A I (2)) mostra idealmente um pico acentuado, representando o comprimento médio do sarcomere.
      6. Dobre a fibra usando o módulo de detecção de bordas. Defina as áreas de detecção com a janela vermelha e verde e defina um limiar (linha horizontal vermelha e verde) no primeiro derivado do traço de intensidade da luz(Figura 7A III).
      7. Comece a acelerar opticamente a célula a 0,25 Hz (se possível, tente taxas de ritmo mais rápidas) e acompanhe o comprimento do sarcomere e a dobra de fibra.
         NOTA: A posição do suporte de fibra, o gatilho LED e os pulsos de estimulação elétrica são controlados através do software de aquisição de dados (ver Tabela de Materiais).
      8. Depois de registrar pelo menos 15 contrações ópticas, estimular o campo estimule a célula eletricamente (ver Tabela de Materiais). Encontre o limiar para provocar contrações e registre aplicando 1,5 vezes a tensão limiar.
      9. Para o protocolo de inibição, aplique estímulos elétricos para provocar contrações e, em seguida, exponha-se à luz sustentada de 64 s (em várias intensidades de luz).

Figura 4: Configuração de dobra de pipeta. (1) O micromanipulador do lado esquerdo é usado para controlar a posição do capilar, e um segundo micromanipulador à direita é usado para dobrá-lo. (2) Capilar. (3) Bender. (4) Microforge. (5) Círculo de orientação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Pipeta com fibra de carbono. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

6. Análise de dados

1. Gravações de grampo de remendo
   NOTA: Corrija todas as tensões gravadas e de comando para o potencial de junção líquida após o experimento. Determine o potencial de junção líquida no software de aquisição de dados usando a calculadora potencial de junção da ferramenta (para as soluções de patch-clamp indicadas na Tabela 4: 14,4 mV a 21 °C). Subtraia o potencial de junção líquida da tensão gravada/de comando.
   1. Para gravações AP de grampo i, verifique o ritmo elétrico versus o ritmo óptico. Calcule a duração do AP (APD) em 20 e 90% de repolarização com um script personalizado(Material Suplementar). Determine o potencial da membrana de repouso e a amplitude AP.
      NOTA: Determine o APD conforme descrito em Wang K. et al.²¹ O script para carregar arquivos .abf é geralmente acessível através do seguinte link: https://de.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/22114-fcollman-abfload. Valores médios de APD para pelo menos 6 AP.
   2. Para a fotoativação do grampo V, verifique se a linha de base está em 0 pA. Se não ajustar a linha de base a zero. Analisar a corrente registrada desencadeada por pulsos de luz de 300 ms a -74 mV. Transfira os dados para o software de análise de dados e determine o pico e a corrente estacionária média.
2. Experimentos com fibra de carbono
   1. Gravações de contração durante o ritmo óptico: Carregue os dados registrados no software de aquisição de dados e leia a linha de base e a máxima da dobra da fibra de carbono e as alterações do comprimento do sarcomere.
      NOTA: Valores médios para 10 contrações de um registro estável.
   2. Meça a largura da célula e calcule a área transversal da célula assumindo uma seção transversal elíptica(Figura 7B II).
      NOTA: A fórmula para a área de uma elipse é A = π·a·b (Fórmula 2) onde a é a distância do centro para o vértice e b é a distância do centro até o covértice. No nosso caso, isso significa a = (largura da célula)/2 e b = (espessura da célula)/2. De acordo com Nishimura et al.^22, a espessura do CM pode ser estimada em um terço da largura da célula para que A = π· (1/2)·largura· (1/2)·espessura = π· (1/4)·largura· (1/3)·largura = π· (1/12)·largura².
   3. Calcular a força sistólica final (F):
      
   4. Calcular a deformação celular sistólica final (ESD):
      
      NOTA: Outros parâmetros contratuais podem ser analisados: comprimento de sarcomere de repouso, tempo para pico, tempo até 90% de relaxamento, encurtamento fracionado de sarcomere, velocidade máxima de contração e relaxamento (ver manual de aquisição de software).

GtACR1-eGFP foi expresso em cm coelho cultivado ( inserçãoda Figura 6) e as fotocorrentes foram medidas com a técnica patch-clamp. A fotoativação de GtACR1 mostra grandes correntes direcionadas para dentro a -74 mV. Na Figura 6Uma corrente de pico(IP)a 4 mW/mm2 é de 245 pA. AP foram acionados eletricamente(Figura 6B) ou opticamente (Figura 6C) com injeções atuais 1,5 vezes o limiar, ou pulsos de luz despolarizador curtos de 10 ms, respectivamente. Analisando os valores de APD, cm eletricamente acelerados mostram um APD 20 de 0,24 ± 0,08 s e um APD 90 de 0,75 ± 0,17 s, que cm com ritmo óptico apresentam APD 20 de 0,31 ± 0,08 s e APD 90 de 0,81 ± 0,19 s (SE, n = 5, N = 2, no aqui apresentado exemplo APD 20elétrico = 0,17 s; APD 20óptico = 0,27 s e APD 90elétrica = 0,61 s; APD 90óptica = 0,68 s; Figura 6D). Cm opticamente acelerado mostrar um início de AP mais lento(Figura 6D). A ativação do CM foi inibida após a iluminação sustentada (para 64 s, 4 mW/mm2) por polarização do potencial de membrana em direção ao potencial de reversão do cloreto, aqui -58 mV(Figura 6E). Injeções de corrente mais altas do que 1,5 vezes o limiar não provocam geração DE AP(Figura 6F). As forças de pico geradas foram determinadas a partir da dobra da fibra de carbono (Figura 7B,C,E). O CM gerou 232 μN/mm2 após o ritmo elétrico(Figura 7B)e 261 μN/mm2 seguindo o ritmo óptico(Figura 7C). Pulsos de luz verde prolongados inibem contrações(Figura 7E). Após a inibição óptica para 64 s, as contrações recorrentes geram uma força contraífica menor, e os valores de força recuperam-se para a linha de base após ~10 contrações (ritmo a 0,25 Hz, Figura 7D) de acordo com a perda de cálcio diastólica do coelho CM.

Figura 6: Representação de gravações de fixação de remendo de CM eletricamente e opticamente aceleradas/inibidas. (A) Fotocorrente representativa a -74 mV usando um pulso leve de 300 ms, 4 mW/mm2. IP indica a corrente de pico. A inserção mostra uma célula positiva GtACR1-eGFP. (B) Registro ap representativo a 0 pA utilizando uma rampa de corrente de 10 ms, 0,6 nA para acelerar eletricamente o CM. (C) Registro de AP representativo a 0 pA usando pulsos de luz de 10 ms, 0,4 mW/mm2. (D) Gráfico superior mostra a sobreposição do10º AP de CM ativado eletricamente (azul) e opticamente (verde). O gráfico inferior mostra a diferença do potencial de membrana entre AP óptica e eletricamente acionada (Eóptica-Eelétrica). (E) Ap acionado eletricamente foram inibidos luz sustentada de 64 s, 4 mW/mm2. (F) AP são inibidos por injeções de corrente mais altas do que 1,5 vezes o limiar (de 0,7 nA em etapas de 0,1 nA a 2,2 nA) luz sustentada. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 7: Dados representativos de gravações de fibra de carbono de CM ópticos e eletricamente acelerados/inibidos. (A) Exibir no software de aquisição de dados. A imagem (I) mostra o CM medido com a janela para calcular o comprimento do sarcomere. A largura da célula é rotulada em laranja. (1) Faixa de freqüências relevantes. (2) O espectro de energia FFT mostra a freqüência do espaçamento de sarcomere na célula. O comprimento médio do sarcomere é calculado a partir da frequência de pico. (3) Janela de rastreamento de comprimento sarcomere. (4) Traço de intensidade. (5) O traço de intensidade multiplicado por uma janela hamming é o traço de intensidade janela. O esquema (II) mostra a seção transversal elíptica da célula. Largura em laranja e espessura em azul tracejada. A imagem (III) mostra a posição das fibras de carbono com as respectivas caixas de detecção, deixadas em vermelho e direita em verde. (6) Traço de intensidade. (7) Primeiro derivado de rastreamento de intensidade (ver manual de software de aquisição de dados). (B) Traço representativo de contrações eletricamente provocadas. O painel (I) mostra o encurtamento do comprimento do sarcomere, painel (II) a distância entre as duas fibras de carbono. (C) Traço representativo de contrações ópticas (525 nm, 0,25 Hz, 10 ms, 6 mW/mm2). O painel (I) mostra o encurtamento do comprimento do sarcomere, painel (II) a distância entre as duas fibras de carbono. (D) Gerou força máxima de contração de 1 a 11 após uma pausa causada pela inibição da geração de AP. (E) Traço representativo da inibição óptica das contrações iluminação sustentada (525 nm, 64 s, 6 mW/mm2). O painel (I) mostra o encurtamento do comprimento do sarcomere, painel (II) o comprimento entre as duas fibras de carbono. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 5: Lista de abreviaturas.

Figura suplementar 1: Medições de intensidade de luz com medidor óptico de potência. (A) Medição de pulsos de luz de 10 ms a 4 mW/mm2. (B) Medição da iluminação sustentada de 64 s a 4 mW/mm2. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura suplementar 2: Propriedades de CM recém-isoladas e sua adaptação estrutural na cultura. (A) Registro ap de cm recém-isolado (APD 20 de 1,11 ± 0,34 s, APD 90 de 1,96 ± 0,32 s, n = 7, N = 2). Potencial médio de membrana de repouso de -79,3 ± 0,8 mV (n = 7, N = 2). (B) Registro de fibra de carbono de um CM recém-isolado eletricamente. Força média de pico de 205 ± 78 μN/mm2 (n = 7, N = 2). (C) Imagens confocais de um CM recém-isolado (I); CM não transduzidos (II) e transduzidos (III) após 48 horas de cultura. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Material suplementar: Script MatLab para determinar o potencial de APD e membrana de repouso. Clique aqui para baixar este arquivo.

Os autores não têm nada para revelar.