Níveis elevados de proteína do fluido espinhal podem ser o resultado da difusão da proteína plasmática através de uma barreira hemato-cerebral alterada ou síntese intratérica. Um protocolo de teste otimizado é apresentado neste artigo que ajuda a discriminar ambos os casos e fornece medições quantitativas de proteínas sintetizadas intrathecally.
É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.
Artigo de método
Medição quantitativa de proteínas sintetizadas intrathecally em camundongos
Neste artigo
Resumo
Resumo
O líquido cefalorraquidiano (CSF), um fluido encontrado no cérebro e na medula espinhal, é de grande importância para a ciência básica e clínica. A análise da composição da proteína CSF fornece informações cruciais na pesquisa básica de neurociência, bem como doenças neurológicas. Uma ressalva é que as proteínas medidas em CSF podem derivar da síntese intrathecal e da transudação do soro, e a análise da proteína de CSF pode somente determinar a soma destes dois componentes. Para discriminar entre a transudação de proteínas do sangue e proteínas intrathecally produzidas em modelos animais, bem como em seres humanos, as medições de perfil de proteína CSF usando ferramentas convencionais de análise de proteínadevem incluir o cálculo do quociente de csf/soro albumina(q albumina),um marcador da integridade da interface sangue-cérebro (BBI) e do índice de proteína(q proteína/q albumina), uma estimativa de síntese de proteína intrathecal. Este protocolo ilustra todo o procedimento, desde csf e coleta de sangue para quocientes e cálculos de índices, para a medição quantitativa da síntese intratês de proteínas e imparidade BBI em modelos de camundongos de distúrbios neurológicos.
Introdução
O líquido cefalorraquidiano (CSF), um líquido claro e incolor em torno do cérebro e da medula espinhal, tem grande importância científica clínica e básica. O CSF preserva o ambiente eletrólitico do sistema nervoso central (SNC), equilibra o estado sistêmico de base ácida, fornece nutrientes para células neuronais e gliais, funciona como um sistema linfático para o SNC, e transporta hormônios, neurotransmissores, citocinas e outros neuropeptídeos em todo o CNS1. Assim, como a composição do CSF reflete a atividade do SNC, esse fluido oferece um acesso valioso, embora indireto, para caracterizar o estado fisiológico e patológico do SNC.
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Protocolo
Todo o trabalho animal utiliza protocolos revisados e aprovados pelo Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) da Geisel School of Medicine em Dartmouth.
1. Coleta de fluidos
NOTA: Tanto o soro quanto o CSF são necessários. Dois protocolos para cada coleta de fluidos são necessários para a sobrevivência e necropsia.
- Coleta de soro e CSF usando procedimentos de sobrevivência
NOTA: Para a coleta de fluidos de sobrevivência, a coleta de soro deve preceder a coleta de CSF, pois é um procedimento menos invasivo. CSF deve ser obtido dentro de uma semana de sorteio de soro.- Procedimento ret....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Resultados
Este experimento representativo teve como objetivo comparar a síntese intratítica do IgG em dois modelos de roedores clinicamente relevantes de esclerose múltipla (EM): a PLP139-151-induzida pela encefalomielite autoimune experimental (TMEV-IDD) e a doença de desmielinação induzida pelo vírus de Theiler. R-EAE é um modelo útil para a compreensão de EmS remitindo-remitindo-remitindo, visto que o modelo de TMEV-IDD caracteriza oM9progressivo crônico.
Para o pre.......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Discussão
Métodos quantitativos para a avaliação do aumento das concentrações de proteínas CSF são ferramentas úteis na caracterização do estado fisiológico e patológico do SNC. No entanto, além da quantificação confiável dos níveis de proteína CSF, a detecção de proteínas CSF requer uma expressão de resultados que discrimina entre frações derivadas do sangue e do SNC no CSF. No entanto, até à data, os ensaios de quantificação de proteínas comumente utilizados não permitem a discriminação entre os dois componentes proteicos, mesmo.......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Divulgações
Os autores não têm nada a divulgar.
Agradecimentos
Os autores agradecem à equipe do Centro de Medicina e Pesquisa Comparativa (CCMR) em Dartmouth por seu cuidado especializado com os camundongos usados para esses estudos. O Fundo de Pesquisa Bornstein financiou esta pesquisa.
....Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Seringa de insulina de 1 mL | BD | 329650 | |
| Seringa de 1 mL | BD | 329622 | |
| agulha de calibre 25 | BD | 305122 | |
| Seringa de 3 mL | BD | 309582 | |
| agulha de insulina de calibre 30 | BD | 305106 | |
| Almofadas absorventes | Qualquer marca | ||
| Acepromazina | Patterson Vet Supply Inc | ||
| Lavadora Magnética Portátil BioPlex BioRad | 171020100 | Magnet | |
| BioPlex MAGPIX Leitor Multiplex | BioRad | 171015001 | |
| BioPlex Pro Placas de Fundo Plano | BioRad | 171025001 | |
| Anticorpo de detecção biotinilado | Qualquer fonte | O anticorpo deve ser direcionado contra a espécie de a proteína de interesse. | |
| Albumina de soro bovino (BSA) | Sigma | A4503 | |
| Cloridrato de buprenorfina | PAR Pharmaceutical | NDC 42023-179-05 | |
| Tubos capilares | Sutter Instrument | B100-75-10 | OD: 1,0 mm, ID: 0,75 mm Vidro borossilicato 10 cm; desenhado sobre Bunsen para tornar o ID menor. |
| Tubo de centrífuga, 0,2 mL | VWR | 20170-012 | |
| Tubo de centrífuga, 0,5 mL | VWR | 87003-290 | |
| Tubo de centrífuga, 1,5 mL | VWR | 87003-294 | |
| Diacetato de clorexidina | Nolvasan | E004272 | |
| Pontas de pipetas descartáveis | Qualquer marca | ||
| Barras auriculares | KOPF Instruments | 1921 ou Freezer | |
| VWR | VWR32086A | ||
| Gaze | Medline | NON25212 | |
| Sunbeam | XL King Size SoftTouch, 4 configurações de calor com desligamento automático, azul-petróleo, câmara de indução de 12 polegadas x 24 polegadas | ||
| VETEQUIP | |||
| Vet Supply Inc | NDC 14043-704-06 | ||
| Cetamina (KetaVed) | Patterson Vet Supply Inc | ||
| (acopladas a anticorpos) | BioRad | de esferas magnéticas acopladas a anticorpos | |
| Microrretrator de Microrretratores | de SBT1500 | Southwest Scientific | |
| Qualidade | ACD-010 | Blunt - 1 mm | |
| Microsoft Office (Excel) | Microsoft | ||
| MilliPlex MAP Mouse Imunoglobulina Isotipagem Painel de esferas magnéticas | EMD Millipore | MGAMMAG-300K | Kit comercial para a quantificação através do Luminex de um painel de isotipos e subclasses de imunoglobulinas em fluidos de camundongos. |
| Kit ELISA de captura de albumina de camundongo | Novus Biological | NBP2-60484 | Kit comercial para quantificação através de ELISA de albumina em fluidos de camundongos. |
| Pipeta multicanal | Eppendorf | 3125000060 | |
| Cotonetes não estéreis | MediChoice | WOD1002 | Precisa ser autoclavada para esterilidade |
| Oxigênio | AIRGAS | OX USPEA | |
| Pasteur Pippettes | Fisher | 13-678-20A | de 5 e 3/4" |
| com agulha descartável, 6-0 Prolen | Patterson Vet | 8695G | P-3 Corte reverso, 18 " |
| PE-Streptavidin | BD Biosciences | 554061 | |
| Pipetters | Eppendorf | Research seriers | |
| Tubulação de | |||
| Centrífuga refrigerada | Beckman Coulter | ALLEGRA X-12R | |
| Escala | Uline | H2716 | |
| Pena | de bisturiEF7281 | ||
| Shaver | Harvard Apparatus | 52-5204 | |
| Proteínas padrão | Qualquer fonte | A melhor escolha para um padrão de referência é uma concentração purificada e conhecida da proteína de interesse. | |
| Instrumento estereotáxico | KOPF Instruments | Modelo 900LS | Acessórios Padrão |
| Estéril 1 x PBS | Corning Cellgro | 21-040-CV | |
| Solução salina estéril | Baxter | 0338-0048-02 | 0,9% Cloreto de Sódio Irrigação |
| Pinça Cirúrgica Curvada, 7 (2) | Ferramentas de Ciência Fina | 11271-30 | Dumont |
| Tesoura Cirúrgica | Ciência Fina | 14094-11 | Vaporizador de Aço Inoxidável 25x |
| + Medidor de Vazão | Moduflex Instrumentos de Anhestesia | ||
| Vortex | Fisher | 02-215-414 | |
| Almofada de aquecimento | Kent Scientific Corporation | RT-JR-20 | |
| Water Sonicator | Cole Parmer | EW-08895-01 | |
| Xylazine | Patterson Vet Supply Inc |
Referências
- Whedon, J. M., Glassey, D. Cerebrospinal fluid stasis and its clinical significance. Alternative Therapies in Health and Medicine. 15 (3), 54-60 (2009).
- Kang, J. H., Vanderstichele, H., Trojanowski, J. Q., Shaw, L. M.
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Reimpressões e permissões
