Artigo de método

Quantificação de Células Proliferativas e Mortas em Enteróides

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DOI:

10.3791/60501

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31 de janeiro de 2020

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1Jiangsu Key Laboratory of Neuropsychiatric Diseases and Cambridge-Suda (CAM-SU) Genomic Resource Center, Medical College of Soochow University, Department of Oncology, The First Affiliated Hospital of Soochow University, 2Department of Pathology, University of Chicago, 3Department of Pathology, Brigham and Women's Hospital–Harvard Medical School

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

O protocolo apresentado utiliza citometria de fluxo para quantificar o número de células proliferantes e mortas em enteróides de camundongos cultivados. Este método é útil para avaliar os efeitos do tratamento medicamentoso sobre a proliferação organoide e a sobrevivência.

Resumo

O epitélio intestinal atua como uma barreira que impede a entrada de conteúdo luminal, como microbiota patogênica e toxinas, de entrar no resto do corpo. A função da barreira epitelial requer a integridade das células epiteliais intestinais. Enquanto a proliferação de células epiteliais mantém uma camada contínua de células que forma uma barreira, danos epiteliais levam à disfunção da barreira. Como resultado, o conteúdo luminal pode atravessar a barreira intestinal através de uma via irrestrita. A disfunção da barreira intestinal tem sido associada a muitas doenças intestinais, como doença inflamatória intestinal. As criptas intestinais de camundongos isolados podem ser cultivadas e mantidas como estruturas semelhantes a criptografia, que são chamadas de organoides intestinais ou "enteróides". Os enteróides são ideais para estudar a proliferação e a morte celular de células epiteliais intestinais in vitro. Neste protocolo, descrevemos um método simples para quantificar o número de células proliferativas e mortas em enteróides cultivados. 5-etilôndeus-2'-desoxuridina (EdU) e iodeto de propídio são usados para rotular células proliferantes e mortas em enteróides, e a proporção de proliferação e células mortas são então analisadas por citometria de fluxo. Esta é uma ferramenta útil para testar os efeitos do tratamento medicamentoso na proliferação de células epiteliais intestinais e na sobrevivência celular.

Introdução

Uma função fundamental das células epiteliais intestinais é proteger a entrada de conteúdos luminários como bactérias patogênicas e toxinas1,2. Para realizar tal função, as células-tronco intestinais proliferam e se diferenciam continuamente em uma variedade de células epiteliais, incluindo enterócitos e células secretas, que formam uma barreira formando conexões apertadas3. A rápida renovação das células epiteliais intestinais requer coordenação rigorosa da proliferação celular, diferenciação celular e morte celular4,5. A redução da proliferação celular ou a morte celular excessiva leva a danos epiteliais e a função de barreira comprometida1,6. A disfunção da barreira intestinal tem sido associada a doenças inflamatórias intestinais7,8.

Um método para cultivar criptas intestinais foi desenvolvido anteriormente. Usando essa técnica, as criptas de camundongos isolados crescem em organoides intestinais (enteróides), que possuem criptosas como estruturas e contêm toda a linhagem celular epitelial intestinal9,10. 5-Etilnyl-2'-deoxyuridina (EdU) é um analógico de timmidina capaz de substituir a timina (T) no DNA que está passando por replicação durante a proliferação celular. As células proliferativas podem ser rotuladas de forma rápida e precisa pela coloração de EdU. Propidium iodeto (PI) é um análogo de brometo de etídio que libera fluorescência vermelha após inserção em DNA de dupla cadeia. Pi detecta especificamente células mortas, uma vez que só passa pela membrana celular danificada.

Neste protocolo, primeiro descrevemos como isolar criptas do intestino delgado murina e depois cultimá-las como enteróides in vitro. Descrevemos então como analisar as células proliferativas e mortas em enteróides por incorporação e citometria de fluxo da EdU e PI.

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Protocolo

Este protocolo foi aprovado pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais do Cambridge-Suda Genomic Resource Center (CAM-SU) na Universidade Soochow.

1. Isolamento organoide intestinal e cultura

  1. Isolamento das criptas intestinais e da cultura enteróide
    1. Eutanize um rato selvagem de 8 semanas com inalação de CO2. Use fórceps de tecido e tesouras de íris finas para dissecar aproximadamente 8 cm de ileum.
    2. Saia usando uma seringa com agulha de alimentação de gavage com cerca de 40 mL de soro soro tampão de fesfato frio (DPBS), em seguida, corte longitudamente com tesouras e abra o íleum.
    3. Corte o ileum em pequenas peças (0,5-1,0 cm). Coloque as peças em 5 mL de DPBS frios estéreis em um tubo cônico de 15 mL, em seguida, rocha por 5 min no gelo.
    4. Use um controlador pipette para aspirar o DPBS e substituí-lo por 10 mL de tampão frio 1 (2 mM EDTA em DPBS). Pedra por 30 min no gelo.
    5. Use o controlador pipette para aspirar buffer 1 e substitua por 10 mL de tampão frio 2 (54,9 mM D-sorbitol, sacarose de 43,4 mM em DPBS). Agite por 2-3 min à mão (~80 shakes/min).
    6. Pegue uma gota de 20 μL de conteúdo buffer 2 depois de tremer e inspecione um microscópio.
    7. Filtrar o conteúdo buffer 2 com um filtro de célula estéril de 70 μm e, em seguida, coletar o buffer filtrado com um tubo cônico de 50 mL.
    8. Pipette 20 μL de filtragem no slide para contar as criptas. Transfira um volume suficiente de buffer 2 da etapa 1.1.7 para garantir que existam ~500 criptas/bem.
    9. Gire para baixo a 150 x g por 10 min a 4 °C. Uma vez que a fiação é concluída, cuidadosamente aspirar o supernatant.
    10. Suspenda as criptas em 50 μL de matriz de membrana do porão (por exemplo, Matrigel) por 500 criptas, pipette para cima e para baixo (tendo o cuidado de evitar bolhas), em seguida, coloque uma gota de 50 μL de matriz de membrana do porão/mistura de cripta no centro de um poço em uma placa de poço de 24. Incubar por 30 min a 37 °C para polimerizar a matriz de membrana do porão.
    11. Após 30 minutos de polimerização, adicione cuidadosamente 600 μL de mídia minigut (avançado o meio águia modificado de Dulbecco [DMEM]/F12, 2 mM L-alanine-L-glutamina, caneta/estreptococo [100 unidades/mL], 10 mM Hepes, Suplemento N2 [1:100], suplemento B27 [1:50] com fator de crescimento epidérmico [EGF; 50 ng/mL], Noggin [100 ng/mL], R-spondin [500 ng/mL], e Y27632 [10 μM]) para cada poço, em seguida, devolver a placa para a 37 °C/ incubadora C. Observe um microscópio todos os dias, e mude a mídia a cada 2-3 dias.
  2. Passaging enteróide
    NOTA: Para culturas longas, os enteróides devem ser divididos aproximadamente a cada semana.
    1. Para passar os enteróides, coloque a placa de cultura do tecido no gelo. Aspirar a mídia e adicionar 1 mL de DPBS frio a cada poço. Use uma ponta P1000 para pipette para cima e para baixo até que não restem pedaços sólidos de matriz de membrana do porão.
    2. Passe para cima e para baixo uma vez através de uma seringa de insulina de 1 mL (27 G) e em um tubo cônico de 15 mL. Gire para baixo por 5 min a 150 x g a 4 °C.
    3. Use pipeta para remover DPBS. Resuspender em 50 μL de matriz de membrana do porão/bem.
    4. Coloque a placa em uma incubadora de 37 °C por 30 min para permitir que a matriz de membrana do porão seja polimerizado. Sobreponha cada poço com 600 μL de mídia ENR (mídia de minigut, 50 ng/mL EGF, 100 ng/mL Noggin, 500 ng/mL R-spondin), em seguida, devolva a placa para a incubadora.

2. Análise de Citometria de Fluxo de Células EdU-positivas em Enteróides

NOTA: A Figura 1 mostra o fluxo de trabalho para análise de citometria de fluxo de células EdU-positivas em enteróides.

  1. Incubação de enteróides com EdU
    1. Cresça enteróides da etapa 1.2.4 por 5 a 7 dias. Passagem enteróides em uma nova placa de poço 24 em uma proporção de divisão de 1:2. Adicione 600 μL de meio ENR a cada poço. Incubar enteróides por 4-5 dias em uma incubadora de 37 °C.
    2. Defina o grupo controle (enteróides não tratados) e o grupo experimental (enteróides tratados com interleucina de 5 ng/mL 22 [IL-22]). Prepare pelo menos três réplicas para cada grupo.
    3. Adicione EdU ao meio ENR para preparar o meio EdU com uma concentração de 50 μM. Adicione 600 μL de edu médio a cada poço e incuba por 2 h em uma incubadora de 37 °C. Estabeleça um poço de enteróides sem tratamento de UEd como um controle negativo para subtração de fundo.
  2. Colheita de enteróides da matriz de membrana do porão
    1. Use um controlador pipette para aspirar o meio EdU e lave 1x com DPBS. Adicione 1 mL de DPBS.
    2. Use ponta de pipeta P1000 e pipeta para cima e para baixo até que não restem pedaços sólidos de matriz de membrana do porão. Transfira para um tubo de 15 mL e gire para baixo a 300 x g por 5 min. Descarte o supernatante.
    3. Adicione 500 μL de enzimas de dissociação celular(Tabela de Materiais)e incuba por 15 min a 37 °C. Use ponta de pipeta P200 e pipeta para cima e para baixo para quebrar enteróides em células únicas.
    4. Adicione 3 mL de meio DMEM contendo 10% de soro bovino fetal (FBS) e repetidamente pipette com uma ponta de pipette P1000.
    5. Gire para baixo a 300 x g por 5 min e aspirar o meio supernatante. Resuspender as células com 1 mL de DPBS.
  3. Fixação e permeabilização das células
    1. Transfira a suspensão celular para um tubo de 1,5 mL, gire para baixo a 300 x g por 5 min e descarte o supernatante.
    2. Resuspender as células com 1 mL de 4% paraformaldeído (PFA), fixar por 15 min à temperatura ambiente (RT) e girar para baixo a 300 x g por 5 min. Aspirar o supernatante com uma ponta de pipeta, lavar 1x com DPBS, e girar para baixo para remover o supernatante.
    3. Resuspenda as células com 1 mL de 0,5% de surfactante nonionic. Incubar por 10 min na RT.
    4. Gire para baixo a 300 x g por 5 min e aspirar o supernatant. Lave 1x com DPBS e gire para baixo para remover o supernatante.
  4. Detecção de EdU
    1. Prepare soluções de estoque para cada componente com antecedência: 1) solução de trabalho do azide Alexa Fluor, 2) solução de trabalho do buffer de reação 1x EdU e 3) solução de estoque de 10x de aditivo tampão EdU.
    2. Prepare 1x aditivo tampão EdU diluindo a solução 10x 1:10 em água desionizada. Prepare esta solução de novo.
    3. Prepare o coquetel de reação de acordo com a Tabela 1.
      NOTA: Adicione os ingredientes na ordem listada na tabela. Use o coquetel de reação dentro de 15 minutos de preparação.
    4. Adicione 100 μL de coquetéis de reação a cada tubo de 1,5 mL. Resuspender as células, proteger da luz, incubar por 30 min na RT.
    5. Centrífuga a 300 x g por 5 min e aspirar a solução de reação com ponta de pipeta suavemente.
    6. Adicione 0,5% de penetrante surfactante nonionic a cada tubo para lavar 1x na RT. Centrifuge a 300 x g por 5 min, aspirar o supernatante com ponta de pipeette suavemente, e resuspender as células em 1 mL de DPBS.
  5. Análise das células por citometria de fluxo
    1. Filtre as células resuspensas com um filtro de 40 μm e, em seguida, colete as células filtradas com um tubo cônico de 15 mL. Realize a detecção de facs na máquina o mais rápido possível.
      NOTA: Se as condições forem limitadas, as amostras manchadas de células devem ser armazenadas no escuro a 4 °C e testadas em até 3 dias.
    2. Selecione o canal apropriado (de acordo com o tipo de Azide Alexa Fluor no kit EdU; aqui, canal vermelho) e tensão (aqui, ~150-350 V) para análise de citometria de fluxo.
    3. Estratégia gating
      1. Desenhe um gráfico pseudocolor FSC-A (eixo x) vs. SSC-A (eixo y) e distribua a maioria das células para a faixa visível do mapa de pontos ajustando a tensão. Selecione a população celular (R1) e exclua os detritos celulares no canto inferior esquerdo.
      2. A partir da população celular R1, estabeleça um FSC-A (eixo x) vs. FSC-H (eixo y) pseudocolor, e definir o portão para selecionar células únicas (R2) para excluir aglomerados celulares.
      3. A partir da população celular R2, estabeleça a intensidade da fluorescência (eixo x) vs. enredo de número de celular (eixo y) e use o controle negativo para definir o portão. A região do sinal fluorescente é uma região celular positiva (R3). Compare a proporção de células EdU-positivas (R3) entre os grupos experimentais e de controle.

3. Análise de Citometria de Fluxo de Células PI-positivas em Enteróides

NOTA: A figura 2 mostra o fluxo de trabalho para análise de citometria de fluxo de células PI-positivas em enteróides.

  1. Incubação de células enteróides com PI
    1. Cresça enteróides da etapa 1.2.4 por 5 a 7 dias. Passagem enteróides em uma nova placa de poço 24 em uma proporção de divisão de 1:2. Adicione 600 μL de meio ENR a cada poço. Incubar enteróides por 4-5 dias em uma incubadora de 37 °C.
    2. Defina o grupo controle (não tratado) e o grupo experimental (tratado IL-22), usando pelo menos três réplicas para cada grupo.
    3. Adicione PI ao meio ENR para preparar o meio PI com uma concentração de 3 μM.
    4. Adicione 600 μL de pi médio a cada poço e incuba por 30 min em uma incubadora de 37 °C. Estabeleça um poço de enteróides sem tratamento de PI como um controle negativo para subtração de fundo.
  2. Colher enteróides da matriz de membrana do porão seguindo as etapas 2.2.1-2.2.5.
  3. Análise das células por citometria de fluxo
    1. Filtre as células resuspensas com um filtro de 40 μm e colete as células filtradas com um tubo cônico de 15 mL.
    2. Realize a detecção de facs na máquina o mais rápido possível.
      NOTA: Se as condições forem limitadas, as amostras manchadas de células devem ser armazenadas no escuro a 4 °C e testadas em até 3 dias.
    3. Selecione o canal apropriado (aqui, canal vermelho) e tensão (aqui, ~150-350 V) para análise de citometria de fluxo.
    4. Use a mesma estratégia de gating descrita na seção 2.5.3.

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Resultados

Pequenas criptas intestinais foram isoladas e cultivadas como enteróides na matriz de membrana do porão. Os enteróides começaram a formar brotos 2 dias após o isolamento. No 6º dia, os enteróides tinham muitos botões com muitos detritos (células mortas) no lúmen. Os enteróides estavam prontos para serem passagens nesta fase (Figura 3).

Inúmeros estudos têm demonstrado que citocinas inflamatórias são essenciais para a manutenção da homeostase epitelial intestinal. ...

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Discussão

Este protocolo detalha as etapas necessárias para a cultura de enteróides in vitro e quantificação de células EdU e PI-positivas nos enteróides por citometria de fluxo. Há várias vantagens dessa estratégia. Primeiro, a rotulagem EdU é usada para detectar células proliferadoras em enteróides. Em comparação com o ensaio tradicional da BrdU, o método de rotulagem EdU é mais rápido, mais sensível e mais preciso. EdU é muito semelhante à timina (T), que substitui a timina na síntese de DNA durante a divisão celular. Em compar...

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Divulgações

Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

Este trabalho é apoiado pela Fundação Nacional de Ciência Natural da China (31971062, 31900326 e 31601022), Fundação de CiênciaNatural da Província de Jiangsu (BK20190043, BK20180838), Fundo de Pesquisa do Laboratório Estadual-Chave de Biotecnologia Farmacêutica, Universidade de Nanjing (KF-GN-202004). A Fundação de CiênciaNatural das Instituições de Ensino Superior de Jiangsu da China (19KJB320003), o Programa de Subsistência e Tecnologia da cidade de Suzhou (SYS2019030) e o Programa de Inovação em Pesquisa para Graduados Universitários da Província de Jiangsu (KYCX19-1981) . Este trabalho também é apoiado pela Tang Scholar da Universidade de Soochow.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Tubo de centrífuga de 15 mlCorning430791
agulha de gavagem de 22 GVWR20068-608
Placa de 24 poçosNunc142475
Filtro de células estéreis de 40 mmBD 352340
Tubo de centrífuga de 50 mlCorning430829
Filtro de células estéreis de 70 mmBD352350
Citômetro de foco acústico avançado DMEM / F-12GIBCO12634010
Attune NxTInvitrogenA24863
B-27 SuplementoGIBCO17504044
2 mM EDTA em DPBS
Buffer 254,9 mM D-sorbitol, 43,4 mM de sacarose em camundongos
DPBS C57 / B6Instituto de Pesquisa Biomédica de Nanjing da Universidade
Enzimas de dissociação celular (TrypLE)Life technologies12605-010
CentrífugaEppendorf5424
CentrífugaEppendorf5424R
CentrífugaEppendorf5810R
Click-iT Plus EdU Alexa Fluor 594 Kit de imagemLife tecnologiasC10639
Incubadora de CO2PanasonicMCO-18AC
DPBSGIBCO
D-sorbitolBBISB0491
EDTABBIEB0185
ENR mediaMinigut, 50 ng/ml EGF, 100 ng/ml Noggin, 500 ng/ml R-spondin
Fetal Bovine Serum (FBS)Gibco10270-106
Tesoura de Íris FinaTansoole2037454
Microscópio de FluorescênciaOlympusFV1000
GlutaMAX SuplementoGIBCO35050-061
Soro de CabraLife technologies16210-064
HDMEMHycloneSH30243.01B
HEPESSigmaH4034
MatrigelCorning356231
Minigut mediaDMEM/F12 avançado, 2 mM Glutamax, Penn/Strep (100 unidades/ml), 10 mM Hepes, suplemento N2 (1:100), suplemento B27 (1:50)
Suplemento N2R& DAR009
Surfactante não iônico (Triton X)BBITB0198-500ML
Tesoura de operação (12,5 cm)Tansoole2025785
Paraformaldeído (PFA)sigma158127-500g
Penn /Strep Invitrogen15140-148
Microscópio de contraste de faseNikonTS1000
Iodeto de propídioSigmaP4170-25MG
Recombinante EGFPeproTech315-09
Recombinante Mouse NogginPeproTech250-38
Recombinante Mouse R-Spondin 1R& D3474-RS-050
Murino Recombinante IL-22PeproTech210-22-10
SacaroseBBISB0498
Fórceps de TecidoTansoole2026704
Y-27632 2HC1SelleckS1049
1 de Nanjing 14190144

Referências

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